檸檬黃褪色光度法檢測H2O2-Fe2+產(chǎn)生的羥自由基

李建晴，李垠俊，鄯 慧，蔡雪梅

（晉中學院化學化工學院，山西 晉中 030600）

檸檬黃褪色光度法檢測H2O2-Fe2+產(chǎn)生的羥自由基

李建晴，李垠俊，鄯 慧，蔡雪梅

（晉中學院化學化工學院，山西 晉中 030600）

利用Fenton反應產(chǎn)生羥自由基（·OH）,加入檸檬黃顯色劑,·OH與顯色劑發(fā)生作用使檸檬黃褪色，用分光光度計測定其ΔA值的變化，從而間接測定產(chǎn)生羥自由基的量.對抗壞血酸、鹽酸羥胺在不同溶劑中的抗羥基自由基氧化性能進行了比較.結(jié)果表明：抗壞血酸、鹽酸羥胺50%乙醇溶液的抗氧化能力比抗壞血酸、鹽酸羥胺水溶液的抗氧化能力強.4種體系中的回收率：抗壞血酸、鹽酸羥胺50%乙醇溶液的回收率分別為106.6%、102.4%，抗壞血酸、鹽酸羥胺水溶液的回收率分別為92.2%、94.0%.

羥自由基；檸檬黃；H2O2-Fe2+；EDTA-Fe（II）

羥自由基（·OH）是目前所知活性氧中對生物體毒性最強、危害最大的一種自由基[1-4]，具有氧化效率高、反應速度快的特點，羥自由基會損傷細胞，引發(fā)各種疾病[5].藥物的抗氧化性，藥劑對羥基自由基阻礙作用的標志之一是·OH的清除率，羥自由基的檢測一直以來都受到廣泛關(guān)注.尋找操作快速、簡便檢測·OH的方法，對抗氧化藥物的選取有一定的意義[6-8].本文利用Fent on反應產(chǎn)生羥自由基（·OH），加入檸檬黃顯色劑，· OH與顯色劑發(fā)生作用使檸檬黃褪色，用分光光度計測定其ΔA值的變化，從而間接測定產(chǎn)生羥自由基的量.對抗壞血酸、鹽酸羥胺在不同溶劑中的抗羥基自由基氧化性能進行了比較，為羥自由基（·OH）的檢測、藥劑的選擇等提供了依據(jù).

1 試驗部分

1.1 儀器、試劑

TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計；電子天平；pH S-2ST數(shù)顯酸度計；H H-S恒溫水浴鍋；722s可見分光光度計.

檸檬黃（天津多福源實業(yè)有限公司）配制0.3 m mol/L的溶液；H2O2（體積分數(shù)30%）：使用時按需稀釋；3.8 m mol/L的EDTAFe（II）溶液；pH=4.30的三酸緩沖溶液；1.0 mg/mL的抗壞血酸和鹽酸羥胺的抗氧化劑溶液.

1.2 羥自由基試驗方法

在10 mL帶刻度比色管中，順序加入2 mL pH=4.30的三酸緩沖溶液，0.7 mL的3.8 m mol/L EDTA-Fe2+，2.0 mL 0.3 m mol/L檸檬黃，0.6%H2O2溶液0.7 mL，定容30℃下保持30 m i n，選定λmax=425 nm，測其A425.加H2O2前體系的吸光度為A0，加H2O2后體系的吸光度為Ab，羥自由基的產(chǎn)生量用ΔA=A0-Ab來表示.

在加H2O2之前加入一定量的抗壞血酸，鹽酸羥氨等還原試劑，λmax=425 nm，測吸光度As，則抗羥基自由基氧化率S的表觀值計算公式為：

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件的選擇

2.1.1 吸收光譜

按照實驗方法作吸收光譜曲線見圖1.結(jié)果表明，非氧化體系和氧化體系中，在λmax=425 nm處都有最強吸收，但在加H2O2的檸檬黃體系A(chǔ)比未加的要小，這表明羥自由基對檸檬黃具有比較強的褪色作用.

2.1.2 酸度的影響

配制pH 1.82、2.00、2.51、3.06、4.30、5.04、6.00、7.20、8.29、9.22、10.21和11.21的系列體系，按實驗方法測量各個溶液的吸光度ΔA425.實驗結(jié)果如圖2.結(jié)果表明：在pH=4.30時，體系的ΔA425達最大值，故本實驗選用pH為4.30的緩沖體系.

圖1 檸檬黃吸收曲線，1-非氧化體系（未加H2O2），2-氧化體系（加H2O2）

圖2 三酸緩沖溶液酸度的影響

2.1.3 檸檬黃用量的影響

試驗測定了檸檬黃濃度對體系吸光度A425的影響.結(jié)果表明，隨著加入檸檬黃體積分數(shù)增大，測定的Δ A425值也增大，而在檸檬黃達到0.06 m mol/L時，體系ΔA425值較大，且A0，Ab處于測量誤差較小的范圍.

2.1.4 H2O2用量的影響

依據(jù)實驗方法改變加入H2O2的量，測定吸光度A425.結(jié)果見圖3.隨著加入H2O2的量的增大，體系的Δ A425值增大，可見，F(xiàn)ent on反應產(chǎn)生的·OH量和體系中H2O2的加入的量是成正比的.結(jié)果表示，本試驗中當加入體積分數(shù)達到H2O20.6%的時候，體系的ΔA425達到最大，此時，A0、Ab也都處于誤差較小的范圍，本試驗選擇加入0.6%的H2O2溶液是0.7 mL.

圖3 H202用量的影響

2.1.5 反應時間的影響

據(jù)實驗方法考查了反應時間對體系吸光度的影響，試驗結(jié)果表明：隨著反應時間的增加，體系ΔA425增長變慢，褪色速度大幅下降.當反應時間達30 m i n后，在30℃下ΔA425增加較慢.本試驗選用30 m i n作為最佳反應時間.

2.1.6 反應溫度的影響

按實驗方法，分別在25至50度之間，測定了體系的ΔA425.試驗的結(jié)果表明：隨著反應體系溫度的增加，其ΔA425逐漸增加，實驗選擇30℃作為比較適宜的反應溫度.

2.1.7 EDTA-Fe（II）加入量的試驗

按試驗方法加入體積不同的3.8 m mol/L EDTA-Fe（II）試液，待完全反應后，同樣測吸光度A425.如圖4所示.試驗表明：隨加入的EDTA-Fe（II）增大，吸光度ΔA425值也逐漸增大.而在加入量達到0.7 mL時，體系ΔA425最大，其后達到飽和.本試驗中，EDTA-Fe（II）適宜用量定為加入0.7 mL.

2.2 還原劑對羥自由基的清除作用的試驗

依據(jù)試驗方法，試驗對還原劑抗壞血酸以及鹽酸羥胺兩種試劑對羥自由基的還原清除能力進行了測定，結(jié)果如圖5.

實驗表明：兩種還原劑對羥自由基的清除作用能力都與其加入的量成正相關(guān),隨著還原劑加入量的增加，其對羥自由基還原的效果也增大，最后，當還原劑用量增大到一定的量以后，其對羥自由基還原的清除率（S）增長速度變小到基本不變，說明加入的還原劑及抗氧化劑的藥效也趨于了飽和.

圖4 EDTA-Fe2+用量的影響

圖5 抗氧化劑用量對抗羥自由基清除率的影響

2.3 回收率的實驗

依照實驗方法，在還原劑清除羥自由基沒有達飽和的用量區(qū)間作了抗壞血酸50%乙醇溶液、鹽酸羥胺50%乙醇溶液、抗壞血酸水溶液和鹽酸羥胺水溶液的標準回收率實驗，表1所示為4次實驗結(jié)果的平均值.

表1 回收率實驗

結(jié)果表明：抗壞血酸、鹽酸羥50%乙醇溶液的回收率大于其相應水溶液的回收率；無論在50%乙醇溶液中，還是在水溶液中，抗壞血酸的抗氧化能力較鹽酸羥胺強.

3 結(jié)論

a.試驗方法方便，快捷，所用設備簡單，能方便地測定羥自由基.

b.試驗方法可對清除羥自由基的還原劑用來進行篩選.對2種還原劑的不同溶劑的還原羥自由基的性能進行了比較，結(jié)果為:抗壞血酸50%乙醇溶液＞鹽酸羥胺50%乙醇溶液＞抗壞血酸水溶液＞鹽酸羥胺水溶液.這說明抗氧化劑用乙醇溶劑配置抗羥自由基氧化性能增強.

c.對樣品做了回收率實驗，抗壞血酸、鹽酸羥胺50%乙醇溶液的回收率分別為106.6%、102.4%，抗壞血酸、鹽酸羥胺水溶液的回收率分別為92.2%、94.0%，回收率較高，結(jié)果較好.

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Hydroxyl Radicals Generated by H2O2-Fe2+are Detected with Lemon Yellow Fading Spectrophotometric

LI Jian-qing，LI Yin-jun，SHAN Hui，CAI Xue-mei
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Jingzhong University，Jingzhong Shanxi，030600 China）

The hydroxyl free radicals which are produced by Fenton reaction can make the lemon yellow fade to measure the discharge of hydroxyl free radicals indirectly.Through the research of the determination conditions,optimum experiment conditions are obtained.And the article makes a comparison of the performance of different solution of Ascorbic acid and hydroxylamine hydrochloride on the resistance to the hydroxyl free radical oxidation.Results showed that the antioxidant capacity of the 50% ethanol solution of ascorbic acid and hydroxylamine hydrochloride is better than the aqueous solution of ascorbic acid and hydroxylamine hydrochloride.The recovery rate of 50%ethanol solution of the ascorbic acid and hydroxylamine hydrochloride are 106.6%,102.4%respectively.The recovery rate of the aqueous solution of ascorbic acid and hydroxylamine hydrochloride are 92.2%,94.0%respectively.

Hydroxyl radical;Lemon yellow;H2O2-Fe2+;EDTA-Fe2+

O657

A

1673-1808（2014）03-0028-04

（編輯 楊樂中）

2014-03-08

國家自然科學基金（No：21175086），山西省高?？萍佳芯块_發(fā)項目（No：20111026），山西省大學生創(chuàng)新實驗項目（NO：2012350）.

李建晴（1963-），女，山西昔陽人，晉中學院化學化工學院，教授，研究方向：光譜分析；

李垠俊（1991-），男，山西忻洲人，晉中學院化學化工學院；

鄯慧（1990-），女，山西陽泉人，晉中學院化學化工學院；

蔡雪梅（1961-），女，山西運城人，晉中學院化學化工學院，教授，研究方向：光譜分析.