α-玉米赤霉醇對(duì)大鼠成骨細(xì)胞IL-6 表達(dá)及分泌的影響

段 斐，郝華超，薛 娟，李少春，劉未華，谷 雨，孫曉芳

（河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000）

·基礎(chǔ)研究·

α-玉米赤霉醇對(duì)大鼠成骨細(xì)胞IL-6 表達(dá)及分泌的影響

段 斐，郝華超，薛 娟，李少春，劉未華，谷 雨，孫曉芳

（河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000）

目的 探討α-玉米赤霉醇對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠成骨細(xì)胞IL-6表達(dá)及分泌的影響。方法 體外培養(yǎng)原代SD新生大鼠顱骨成骨細(xì)胞，形態(tài)學(xué)觀察、堿性磷酸酶(ALP)染色、I型膠原免疫熒光染色進(jìn)行成骨細(xì)胞鑒定，分別以雌激素及不同濃度的α-玉米赤霉醇作用于成骨細(xì)胞，采用RT-PCR法檢測(cè)IL-6 mRNA的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)成骨細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6的含量。結(jié)果 10-10～10-5mol/L α-玉米赤霉醇能夠抑制成骨細(xì)胞 IL-6 mRNA的表達(dá)及其蛋白分泌，其中以10-6mol/L、10-7mol/L的α-玉米赤霉醇作用顯著。結(jié)論 α-玉米赤霉醇能夠抑制成骨細(xì)胞細(xì)胞因子 IL-6 mRNA及蛋白的表達(dá)，這可能是α-玉米赤霉醇防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制之一。

α-玉米赤霉醇；成骨細(xì)胞；白細(xì)胞介素6；絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一種嚴(yán)重危害老年婦女身體健康及生活質(zhì)量的常見病，其起病隱匿，常發(fā)生在絕經(jīng)后5～10年，由于卵巢功能衰退，雌激素水平下降，導(dǎo)致骨量減少及骨組織結(jié)構(gòu)變化，骨脆性增加，因其引起的骨折已成為老年人壽命縮短、致畸、致殘的主要原因。由于PMOP和雌激素水平降低密切相關(guān)，因此雌激素替代療法（hormore replacement treatment，HRT）是目前防治PMOP的最有效方法之一。但是，長(zhǎng)期使用雌激素有誘發(fā)乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、心腦血管疾病、靜脈血栓的危險(xiǎn)[1]。α-玉米赤霉醇(α-zeranol，α-ZAL)是一種新型植物雌激素，前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，α-ZAL可以有效改善去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠的骨密度和生物力學(xué)性能[2-3]，為了進(jìn)一步探討α-ZAL抗骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制，實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)新生大鼠顱骨成骨細(xì)胞，利用不同濃度的α-ZAL干預(yù)成骨細(xì)胞，觀察其對(duì)成骨細(xì)胞IL-6 mRNA的表達(dá)及其蛋白分泌的影響。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD孕鼠（由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證編號(hào)：1004078）所生24 h內(nèi)新生大鼠10只，性別、體質(zhì)量不限。

1.2 主要試劑

17β雌二醇（SIGMA公司），α-ZAL（DR. ehrenstorfer Gmbh公司），DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），胎牛血清（四季青公司），胰蛋白酶（AMRESCO公司），I型膠原酶（SIGMA公司），ALP染色試劑盒（北京雷根生物技術(shù)有限公司），羊抗鼠I型膠原多克隆抗體（sc-25974），免疫熒光染色試劑盒-抗大鼠Cy3、Hoechst染色試劑盒、Trizol試劑 （上海碧云天生物技術(shù)有限公司），PCR引物（上海生工），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（MBI Fermentas公司），大鼠IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒（上海凱博生化試劑有限公司）。

1.3 主要儀器

酶標(biāo)儀（iMark，Bio-rad），低溫低速離心機(jī)（DL-5M，湘儀），CO2培養(yǎng)箱（MCO-15AC，SANYO），倒置顯微鏡（XDS-1A，上海精密儀器儀表有限公司），熒光顯微鏡（CX31-32RFL，OLYMPUS），超凈工作臺(tái)（BSC-1600ⅡA2，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），低溫高速離心機(jī)（Fresco21，Thermo），PCR 儀（DL9700，鼎國(guó)昌盛有限公司），電子分析天平（TP-114，丹佛），電泳槽（SUB-CELL GT，Bio-rad），凝膠成像系統(tǒng)（Gel DicTMXR+，Bio-rad），細(xì)胞培養(yǎng)板（costar）。

2 方 法

2.1 新生大鼠顱骨成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)

將新生24 h SD大鼠脫頸處死后，75%乙醇浸泡消毒10 min，無菌操作取出顱骨，D-Hank's 液清洗后，剔除骨膜、血管和結(jié)締組織，0.01mol/L PBS 液（含青霉素、鏈霉素）反復(fù)清洗。用眼科剪將頭蓋骨剪成泥狀，加入0.25%胰蛋白酶（含0.02EDTA），37℃恒溫消化20 min，吸出消化液，加0.1%Ⅰ型膠原酶，37℃消化20 min，低溫離心機(jī)離心5 min（1 000 r/min），棄上清液，加入含15%血清的DMEM 培養(yǎng)基，吹打骨片，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以后每3 d換培養(yǎng)液1次，待生長(zhǎng)細(xì)胞鋪滿平皿 80%后，進(jìn)行傳代。每5～7 d傳代1次。

2.2 成骨細(xì)胞的鑒定

成纖維細(xì)胞 ( fibroblast，F(xiàn)B) 是成骨細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的主要混雜細(xì)胞。將新生大鼠顱骨分離的細(xì)胞經(jīng)差速黏附法純化獲得的成骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定，經(jīng)鑒定確認(rèn)的成骨細(xì)胞可用于實(shí)驗(yàn)研究。

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

采用倒置相差顯微鏡每日觀察成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及形態(tài)特征。

2.2.2 堿性磷酸酶(ALP)染色

采用改良鈣鈷法，取第3代的成骨細(xì)胞爬片，95%乙醇固定后，按照試劑盒說明進(jìn)行染色。利用圖像測(cè)量分析軟件IPP7.0分析計(jì)算原代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞純度，計(jì)算公式：成骨細(xì)胞純度 = 染色細(xì)胞/全部細(xì)胞× 100%。

2.2.3 I型膠原免疫熒光染色

將培養(yǎng)的第3代細(xì)胞接種到載玻片上，待細(xì)胞貼壁后，4%多聚甲醛固定，用羊抗鼠I型膠原多克隆抗體（1∶200稀釋），按照免疫熒光染色試劑盒說明書進(jìn)行染色，之后使用Hoechst染色試劑盒對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察。

2.3 分組及干預(yù)

取培養(yǎng)第3代的成骨細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為105/mL，接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底時(shí)用10%高糖 DMEM將α-ZAL梯度稀釋成10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol/L，并設(shè)陰性及陽性對(duì)照（10-8mol/L 17β雌二醇）。孵育48 h后，分別收集培養(yǎng)上清和細(xì)胞，-80℃保存。

2.4 RT-PCR測(cè)定成骨細(xì)胞IL-6 mRNA的表達(dá)

按Trizol試劑盒的說明要求，提取細(xì)胞總RNA，并用DNA酶處理總RNA，瓊脂糖凝膠電泳確定RNA未降解，紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因的表達(dá)。PCR引物見表1。

表1 目的基因檢測(cè)所用引物

2.5 ELISA檢測(cè)成骨細(xì)胞IL-6的分泌量

將凍存的細(xì)胞培養(yǎng)上清標(biāo)本室溫下融解，10倍稀釋后按照 IL-6 的 ELISA 試劑盒說明操作，在492 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定樣本的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算 IL-6的濃度，最后得出培養(yǎng)上清中 IL-6的實(shí)際濃度。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，行單因素方差分析 ( One-way ANOVA)，多樣本組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析借助于SPSS 13. 0 完成，以P＜0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

原代細(xì)胞培養(yǎng)貼壁前呈均勻一致的球形，散在懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液中；24 h后少量細(xì)胞開始貼壁生長(zhǎng)，外觀呈長(zhǎng)梭形；2 d后大部分細(xì)胞貼壁、伸展，細(xì)胞體積增大，并向多角形轉(zhuǎn)化，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞呈星形生長(zhǎng)，并借突起相互連接；5 d后細(xì)胞鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶底部，連接緊密，融合成片，細(xì)胞分界不清。傳代培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)較快，一般在接種后5 h可貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng) 3 d細(xì)胞可長(zhǎng)滿瓶壁，其形態(tài)與原代培養(yǎng)相同（圖1）。

圖1 成骨細(xì)胞光鏡觀察（×200）

3.2 ALP染色

光學(xué)顯微鏡下可見，細(xì)胞呈梭形、多角形，細(xì)胞質(zhì)中可見灰黑色細(xì)微顆粒（圖2）。軟件分析染色結(jié)果顯示，陽性染色細(xì)胞占全部細(xì)胞的比例為 93.27% ± 2.31%，說明細(xì)胞純度較高。

圖2 成骨細(xì)胞ALP染色（×200）

3.3 I型膠原免疫熒光染色

熒光顯微鏡下可見，細(xì)胞染色呈梭形、多角形，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見紅色陽性熒光顆粒，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光（圖3）。說明本實(shí)驗(yàn)原代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞具備合成、分泌Ⅰ型膠原的特點(diǎn)。

圖3 I型膠原免疫熒光染色（×200）

3.4 成骨細(xì)胞IL-6 mRNA的表達(dá)

與陰性對(duì)照組相比較，不同濃度（10-10～10-5mol/L）α-ZAL處理組在作用48 h后均能顯著降低成骨細(xì)胞IL-6 mRNA的表達(dá)（P＜0.05）；10-6、10-7mol/L α-ZAL處理組與陽性對(duì)照組相比較，IL-6 mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而其他處理組則顯著高于陽性對(duì)照組（P＜0.05）（圖4）。

圖4 各實(shí)驗(yàn)組成骨細(xì)胞中IL-6 mRNA的表達(dá)

3.5 成骨細(xì)胞IL-6 的分泌量

與陰性對(duì)照組相比較，不同濃度α-ZAL處理組在作用48 h后均能顯著降低成骨細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6的含量（P＜0.05）；10-6、10-7mol/L α-ZAL處理組與陽性對(duì)照組相比較，上清液中IL-6的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而其他處理組則顯著高于陽性對(duì)照組（P＜0.05）（圖5）。此結(jié)果與不同濃度處理組成骨細(xì)胞IL-6 mRNA的表達(dá)情況相一致。

圖5 各實(shí)驗(yàn)組成骨細(xì)胞IL-6的分泌量

4 討 論

IL-6主要由成骨細(xì)胞、單核細(xì)胞、B細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌，作為強(qiáng)有力的骨吸收刺激因子之一，IL-6 可使 GM-CFU 增生，促進(jìn)破骨細(xì)胞生成；誘導(dǎo)成骨細(xì)胞產(chǎn)生IL-1、PGE2、PTHrp等，并與之相互協(xié)調(diào)作用，從而刺激破骨細(xì)胞分化，加強(qiáng)破骨細(xì)胞活動(dòng)并抑制其凋亡；介導(dǎo)M-CSF發(fā)揮的促進(jìn)破骨細(xì)胞前體的分化與增殖，抑制破骨細(xì)胞凋亡[4-6]。研究[7-8]表明，患有PMOP的婦女，在患病的前10年內(nèi)，反映骨丟失的重要指標(biāo)是體內(nèi)的IL-6水平，骨丟失與血清IL-6水平表現(xiàn)出正相關(guān)性。 何勇等[9]發(fā)現(xiàn)，PMOP婦女血清IL-6水平明顯高于絕經(jīng)后非骨質(zhì)疏松婦女以及健康育齡婦女組，且患者血清IL-6水平與骨密度呈明顯負(fù)相關(guān)，與骨鈣素呈明顯正相關(guān)。IL-6基因缺陷的小鼠，在卵巢切除后沒有骨丟失的表現(xiàn)[10]。Moffett等[11]分析了3 376例年齡超過65歲女性IL-6 G-174C多態(tài)性與骨質(zhì)疏松表型的關(guān)系，認(rèn)為IL-6 G-174C啟動(dòng)子多態(tài)性是骨量丟失的一個(gè)基因標(biāo)志。這些均提示，IL-6與PMOP的發(fā)生密切相關(guān)。

已證實(shí)在IL-6基因啟動(dòng)子上存在雌激素反應(yīng)原件（estrogen response element, ERE），雌激素可通過雌激素受體（estrogen receptor，ER）作用于IL-6基因啟動(dòng)子近端的225bp的基因序列，阻斷NF-κB的c-Rel和RelA蛋白與IL-6基因調(diào)節(jié)區(qū)內(nèi)靶序列的結(jié)合，抑制IL-6基因的表達(dá)[12]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，以生理濃度范圍的雌二醇處理未成熟的SD雌性大鼠，可明顯下調(diào)大鼠血清中IL-6的含量[13]，應(yīng)用ER-α受體激動(dòng)劑（PPT）處理實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）小鼠，可降低小鼠脾細(xì)胞IL-6的表達(dá)[14]。而人卵巢切除術(shù)后或自然絕經(jīng)后，血清中IL-6增多，雌二醇治療能降低IL-6的產(chǎn)生[15]。這些結(jié)果證實(shí)了雌激素對(duì)IL-6有負(fù)調(diào)節(jié)作用。

α-ZAL是玉米赤霉烯酮（zearalenone, ZEN）的還原產(chǎn)物，在玉米、小麥、高粱等重要農(nóng)作物中廣泛存在，具有促生長(zhǎng)發(fā)育、防衰保綠的類激素效應(yīng)。研究[16-19]發(fā)現(xiàn)，α-ZAL具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移以及細(xì)胞外基質(zhì)的合成，抑制血小板的粘附與聚集、抗氧化、改善血脂代謝及血流動(dòng)力學(xué)、降低血管張力等作用，對(duì)心血管系統(tǒng)以及神經(jīng)元均具有廣泛的保護(hù)作用，這些作用與雌激素相似，但對(duì)于子宮與乳腺的刺激卻明顯小于雌激素，其對(duì)子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等的發(fā)病率無明顯影響，甚至對(duì)子宮、乳腺具有潛在的保護(hù)作用[20-21]。以往研究顯示，α-ZAL可以有效改善骨質(zhì)疏松模型大鼠的骨密度和生物力學(xué)性能[2-3]，上調(diào)大鼠脛骨近端骨組織ER-α mRNA的表達(dá)[22]，說明α-ZAL對(duì)卵巢切除所致大鼠骨質(zhì)疏松癥具有明顯的防治作用。為了進(jìn)一步探討其作用機(jī)理，采用RT-PCR和ELISA法對(duì)α-ZAL作用下新生大鼠成骨細(xì)胞IL-6 mRNA的表達(dá)及其蛋白分泌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，10-10～10-5mol/Lα-ZAL可顯著降低成骨細(xì)胞IL-6 mRNA的表達(dá)及其蛋白分泌，其中，10-6、10-7mol/L α-ZAL兩個(gè)處理組的作用效果最好，其與17β雌二醇組在抑制成骨細(xì)胞生成IL-6方面的能力一致。由此說明，α-ZAL具有與雌二醇相類似的作用，影響了成骨細(xì)胞的自分泌，抑制IL-6的表達(dá)。推測(cè)α-ZAL在骨重建中發(fā)揮類雌激素樣作用時(shí)，不僅能作用于成骨細(xì)胞，促進(jìn)骨形成，很有可能通過降低IL-6，抑制破骨細(xì)胞前體的形成和分化，下調(diào)破骨細(xì)胞的活性，影響骨吸收，這可能是α-ZAL防治PMOP的機(jī)制之一。

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（責(zé)任編輯：劉俊華）

Effects of α-zeranol on the IL-6 expression and secretion in rat osteoblasts

DUAN Fei, HAO Huachao, XUE Juan, LI Shaochun, LIU Weihua, GU Yu, SUN Xiaofang
(College of Basic Medical Sciences of Hebei University, Baoding 071000, China)

Objective To investigate the effects of α-zeranol on the IL-6 expression and secretion in rat osteoblasts. Methods Osteoblasts were isolated from the skull of SD neonatal rats and identified by morphological observation, ALP staining, and collagen I immunofluorescence staining. 17β-estradiol and α-zeranol with different concentration were administrated. The expression of IL-6 mRNA in the osteoblasts was detected by RT-PCR and the level of IL-6 in culture supernatant of osteoblasts was measured by ELISA. Results α-zeranol with 10-10～10-5mol/L concentrations could inhibit the expression and secretion of IL-6 in osteoblasts, among which the concentrations of 10-6and 10-7mol/L had obvious effects. Conclusion α-zeranol can inhibit the expressions of IL-6 mRNA and protein in osteoblasts, it may play an important role in the prevention of postmenopausal osteoporosis.

α-zeranol; osteoblasts; IL-6; postmenopausal osteoporosis

R977

A

1674-490X(2014)01-0001-07

2013-12-05

河北大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（2012A2002）; 河北省計(jì)生委基金項(xiàng)目 （2010A03）

段斐（1958—），女，河南洛陽人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事植物雌激素對(duì)絕經(jīng)期婦女骨質(zhì)疏松的治療的基礎(chǔ)研究工作。E-mail: feiduan9999@sina.com

郝華超（1975—），男，河北保定人，副主任醫(yī)師，在讀碩士，主要從事神經(jīng)外科臨床及基礎(chǔ)研究。E-mail: 2252676668@qq.com