iPSCs遺傳穩(wěn)定性與重編程機制的研究進展

任才芳，孫紅艷，王立中，張國敏，樊懿萱，顏光耀，王丹，王鋒

南京農(nóng)業(yè)大學，江蘇省家畜胚胎工程實驗室，南京 210095

Jiangsu Livestock Embryo Engineering Laboratory, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

iPSCs遺傳穩(wěn)定性與重編程機制的研究進展

任才芳，孫紅艷，王立中，張國敏，樊懿萱，顏光耀，王丹，王鋒

南京農(nóng)業(yè)大學，江蘇省家畜胚胎工程實驗室，南京 210095

誘導性多能干細胞(Induced pluripotent stem cells, iPSCs)是采用特定轉(zhuǎn)錄因子，將體細胞重編程為具有多能性的干細胞。iPSCs已成功由多種體細胞誘導出來，不僅具有發(fā)育多能性還能避免胚胎干細胞(Embryonic stem cells, ESCs)的倫理道德問題，已成為生命科學領域不可或缺的研究工具，具有廣闊的應用前景。但獲得高質(zhì)量、遺傳穩(wěn)定的iPSCs是當前亟須解決的問題。文章對iPSCs重編程機制和遺傳穩(wěn)定性的研究進展進行了綜述，以期為提高iPSCs的誘導效率、降低誘導成本、掌握iPSCs質(zhì)量控制的關鍵點提供參考，從而推進多能性干細胞臨床應用的發(fā)展。

iPSCs；遺傳穩(wěn)定性；重編程機制；表觀遺傳學

早在1981年，Evans和Kaufman[1]就利用囊胚內(nèi)細胞團首次建立小鼠胚胎干細胞系，因其具有全能性和無限增殖的特性在組織修復等方面蘊藏著巨大應用潛力而受到廣泛關注，并引發(fā)了后續(xù)的干細胞研究熱潮。但事實上，胚胎干細胞(Embryonic stem cells, ESCs)建系非常困難，迄今只有在小鼠[1]、大鼠[2]、人[3]和猴類[4,5]上建系，而且其應用一直受阻于倫理道德(以破壞早期胚胎為代價)和異體排斥等問題的困擾。

直到2006年，Takahashi等[6]首次報道從小鼠體細胞獲得了誘導性多能干細胞(Induced pluripotent stem cells, iPSCs)，這為干細胞研究和應用帶來了重大變革。將轉(zhuǎn)錄因子 Oct3/4、Sox2、Klf4和 c-Myc (OSKM)導入體細胞使其重編程為具有多能性的一類干細胞——iPSCs[6]。iPSCs具有無限自我更新的能力和分化為 3個胚層細胞的多能性，已成為生命科學領域一個重要的研究工具。這項技術不僅簡化了去分化重編程的研究方法，也為再生醫(yī)學的細胞移植治療[7]、疾病模型的構建[8]以及哺乳動物的發(fā)育研究[9]等提供了新的方法和手段。

理論上，所有體細胞均可重編程為iPSCs，但目前已誘導過的體細胞重編程效率均比較低。通過從形態(tài)學、基因表達模式和分化為3個胚層細胞能力等方面的研究發(fā)現(xiàn)，盡管iPSCs與ESCs在功能和分子結構等方面的總體參數(shù)類似[10]，但仍存在各方面不同程度的差異，包括特異的表觀遺傳修飾[11]、基因表達[12]、分化潛能[13]和疾病模型的變異[14]等，不僅影響iPSCs的遺傳穩(wěn)定性，而且誘導的iPSCs可能會致瘤。因此，重編程的低效、不明確的重編程機制以及誘導后的 iPSCs的遺傳不穩(wěn)定現(xiàn)象等問題嚴重限制iPSCs的應用。本文綜述了iPSCs的形成機制、遺傳穩(wěn)定性的最新進展，并推測了調(diào)控iPSCs質(zhì)量鑒定的關鍵點，旨在為多能性干細胞的研究和應用提供參考。

1 iPSCs的誘導優(yōu)化

iPSCs誘導效率低以及病毒轉(zhuǎn)基因的整合是長期困擾其發(fā)展的重要因素。為提高 iPSCs的誘導效率和質(zhì)量，簡化誘導過程，提高其安全性，科研人員正不斷地對誘導體系進行優(yōu)化。

在誘導方法方面，除早期的4因子外，根據(jù)不同的動物可對多能因子進行增減實驗，如Bao等[15]研究發(fā)現(xiàn)，僅用OSKM誘導出的綿羊iPS樣細胞不能穩(wěn)定傳代，而在這4個轉(zhuǎn)錄因子基礎上增加Nanog、 Lin28、SV40 large T和hTERT誘導出了穩(wěn)定的綿羊iPS細胞系，能傳至30代以上。鑒于iPSCs的安全性問題，很多學者都在探索多能性基因誘導重編程的代替方法，為避免病毒轉(zhuǎn)基因重組導致 iPSCs基因組的突變。Warren等[16]利用體外合成的編碼OSKM的mRNA誘導出iPSCs，不僅將誘導效率提高十倍，而且成功建立一個簡單、高效、安全非整合的iPSCs誘導體系。最近，Hou等[17]開創(chuàng)性地利用7種小分子化合物成功誘導了小鼠iPSCs (Chemically induced pluripotent stem cells, CiPSCs)，效率達到0.2%，這與慢病毒誘導的效率相當，他們還通過多種方法驗證了CiPSCs的多能性，由其生產(chǎn)的6月齡嵌合體小鼠 100%健康存活。這種化合物誘導iPSCs的方法不僅避免了病毒誘導的 iPSCs的致癌危險，而且使 iPSCs離臨床應用更近一步，這在體細胞重編程進程中具有里程碑的作用。

在培養(yǎng)條件方面，Miguel等[18]在培養(yǎng)基中添加Vitamin C不僅提高了重編程效率，還改善了小鼠iPSCs(Mouse iPSCs, miPSCs)質(zhì)量。目前，小鼠[19]和人[20]的iPSCs已成功實現(xiàn)了無飼養(yǎng)層培養(yǎng)。David等[19]在無血清和無飼養(yǎng)層的懸浮培養(yǎng)環(huán)境下誘導出miPSCs，加速了由單個細胞和較少細胞生產(chǎn) iPSCs的進程，促進了 iPSCs的誘導、擴增與分化技術的發(fā)展。最近，Nakagawa等[20]發(fā)現(xiàn)StemFitTM培養(yǎng)基結合重組Laminin-511 E8片段能使人類ESCs(Human ESCs, hESCs)和人類iPSCs (Human iPSCs, hiPSCs)在培養(yǎng)皿上穩(wěn)固生長，且能消化成單細胞傳代而無核型異?，F(xiàn)象。人的 iPSCs無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系避免人iPSCs帶有動物源成分，簡化了安全性測試過程，增加了安全性更高的iPSCs數(shù)目。

iPSCs在誘導優(yōu)化方面已經(jīng)取得了一系列突破性的進展，但迄今產(chǎn)生的多種 iPSCs仍存在很多遺傳不穩(wěn)定現(xiàn)象。

2 iPSCs的遺傳穩(wěn)定性

iPSCs的遺傳穩(wěn)定性因直接影響到其質(zhì)量和應用而備受關注。通過對多個 iPSCs基因組異?，F(xiàn)象的分析表明，從染色體、基因拷貝數(shù)以及單核苷酸到線粒體DNA都存在發(fā)生畸變的趨勢。這些遺傳畸變可能由多種原因?qū)е拢?1) 原始細胞的突變在重編程過程中一直攜帶；(2) 轉(zhuǎn)錄因子及基因重組導致的突變；(3)細胞傳代培養(yǎng)時出現(xiàn)新的突變并積累；(4) iPSCs本質(zhì)性更高的變異率。具體見表1。

2.1 染色體畸變

Taapken等[21]對大量研究分析發(fā)現(xiàn) 12.5%的iPSCs系存在染色體畸變，相比于ESCs系的分析結果無顯著性差異，而且iPSCs系傾向于獲得與ESCs系類型相似的染色體畸變。[21-23]。

iPSCs中部分染色體畸變可能來源于體細胞，它們在誘導過程中保留下來，但是染色體畸變增加似乎與重編程方法或體細胞種類無關[21～25]。

多個研究報道認為，iPSCs的傳代次數(shù)與染色體畸變存在相關性聯(lián)系。通過觀察畸變出現(xiàn)的時間，可以發(fā)現(xiàn)iPSCs更傾向于在低代次出現(xiàn)染色體畸變，峰值在 8代左右，而ESCs似乎在高代次(＞30代)才積累產(chǎn)生染色體畸變[22,24,25]。進一步分析拷貝數(shù)變異(Copy number variations, CNVs)，iPSCs的CNVs大多數(shù)出現(xiàn)在低代次并在傳代過程中減少；而 ESCs的CNVs數(shù)量相當穩(wěn)定[24]。Hussein等[26]則認為，誘導過程本身可能會導致CNVs 的顯著增加，以致誘導產(chǎn)生的iPSCs具有大量新生CNVs。因此，iPSCs畸變發(fā)生在其生長的起始階段可能性最大，而且可能主要由重編程過程的選擇所致。Alexej等[27]通過對7個個體、20個hiPSCs系進行全基因組和轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)在 iPSCs中表現(xiàn)出來的這些變異中至少有 50%在親代中低頻出現(xiàn)，因此重編程不一定是導致iPSCs產(chǎn)生新的畸變的原因。有研究表明，iPSCs誘導過程能夠掩蓋體細胞的染色體不穩(wěn)定性，說明重編程過程可能對非整倍體細胞具有選擇作用[28]。

表1 iPSCs遺傳穩(wěn)定性的研究總結

2.2 單核苷酸突變

每個iPSCs系均攜帶了1000多個單核苷酸突變，但某些突變并不能在原始體細胞中檢測到，說明它們可能是iPSCs重編程時變異所致[29,30]。Ji等[29]對不同代次細胞進行測序，揭示iPSCs大約有7%的突變是在傳代過程中產(chǎn)生的，19%存在于原始體細胞中，而74%是在重編程過程中獲得的。

仔細觀察 iPSCs單核苷酸突變產(chǎn)生的時間，可以鑒別突變發(fā)生在重編程之前還是剛剛重編程之后，但為了充分闡明誘導多能性細胞的特性，最主要的還是要鑒定iPSCs是否比ESCs和體細胞更傾向于發(fā)生單堿基突變。

2.3 端粒的完整性

端粒是線狀染色體末端的DNA重復序列，在正常體細胞中，其長度隨著細胞分裂而逐漸縮短。iPSCs是由完全分化的細胞誘導產(chǎn)生的，所以重編程必須使端粒延長，以使其能夠無限地自我更新。雖然在重編程后一般仍能觀察到端粒在延長，但iPSCs克隆之間端粒的長度似乎相差很大，有報道認為端粒長度在培養(yǎng)過程中隨時間延長而縮短[36]。為了直接驗證端粒酶在iPSCs重編程過程中的作用，Wang等[37]對比了Terc雜合(+/-)和Terc缺陷(-/-)小鼠尾尖成纖維細胞的重編程效率，雖然這兩類細胞均能誘導出iPSCs，但將Terc(-/-)iPSCs注射到8細胞胚胎中沒有產(chǎn)生嵌合體后代，表明(1)端粒酶可能是誘導多能性所必須的；(2)Terc(-/-)iPSCs不能產(chǎn)生嵌合體，可能與其端粒長度嚴重縮短、長期增殖能力變?nèi)跤嘘P。此外，端粒延長與DNA甲基化的改變相關，但iPSCs克隆間 DNA甲基化差異大，Yehezkel等[38]提出TERRA水平升高可能對穩(wěn)定iPSCs端粒長度和功能具有重要作用。

端粒長度是重編程的一個重要特征。即使在能觀察到其他多能性參數(shù)的情況下，若端粒不完全的延伸，甚至隨著時間的推移，端粒縮短均可能為不完全重編程，這可能是某些 iPSCs克隆不能傳代、突然衰竭的原因。

2.4 線粒體DNA

不同 iPSCs間遺傳穩(wěn)定性存在大量差異，最近對線粒體DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)分析也發(fā)現(xiàn)，在重編程過程中mtDNA存在各種變化，但在iPSCs系間并沒有檢測到顯著的代謝差異。因此，mtDNA多拷貝數(shù)與高變異的特征可能導致細胞對基因突變的耐受性增強，但具體影響和機制尚需要進一步研究[39]。

3 iPSCs的重編程機制研究

iPSCs的誘導技術已經(jīng)成熟，但其機制尚不明確。多能性的重編程機制對提高重編程的效率和獲得高質(zhì)量重編程細胞具有重要影響，深入了解重編程機制將有助于闡明細胞穩(wěn)定特性的機制，指導細胞分化，推進 iPSCs在個性化治療中的應用。目前，對重編程的了解雖然有所進展，但仍不夠透徹，歸納起來主要從兩個方面探討 iPSCs重編程機制：一是重編程過程中內(nèi)源和外源信號通路對體細胞去分化的影響，另一方面則傾向于表觀遺傳修飾對 iPSCs形成的調(diào)控。

3.1 iPSCs信號通路研究

重編程誘導的關鍵問題就是體細胞狀態(tài)如何被消除，干細胞樣轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡如何形成。誘導有效的重編程需要經(jīng)歷很多步驟，首先是形成干細胞樣克隆，但大多數(shù)表達重編程因子的細胞未能成功發(fā)生形態(tài)變化，仍保持成纖維樣即發(fā)生凋亡、衰老或細胞周期停滯；其次是形成干細胞樣轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡，逐漸消除體細胞狀態(tài)；最后是干細胞樣克隆如何獲得和維持干性(全能性)。Sharma等[40]研究通過調(diào)控重編程過程中信號通路關鍵因子的反應，進而獲得更高的重編程效率。研究發(fā)現(xiàn)，p53/p21或 Ink4a/Arf的沉默可提高iPSCs的生產(chǎn)效率，其中抑制p53/p21途徑能提高細胞增殖率，加速 iPSCs形成[41]。SIRT6是維持轉(zhuǎn)錄、基因組穩(wěn)定、端粒完整性、DNA修復和代謝穩(wěn)態(tài)的關鍵調(diào)控因子，能顯著提高重編程效率[40]；外源多能性基因誘導體細胞重編程通常是一種低效且隨機的事件，Tanabe等[42]發(fā)現(xiàn)大多數(shù)人皮膚成纖維細胞在接受到 OSKM信號后能啟動重編程過程，但之后有很多細胞逆轉(zhuǎn)重編程，導致重編程效率較低，研究表明在之前報道的能提高直接重編程效率的因子中，只有LIN28而非Nanog、細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)或p53 shRNA顯著抑制了重編程的逆轉(zhuǎn)。這些研究表明，在人成纖維細胞重編程過程中，是成熟過程而不是啟動過程限制了重編程。細胞類型特異性剪接模式對細胞的特性與功能具有重要作用，深度測序結合高通量絕對定量技術發(fā)現(xiàn)，在重組期間，體細胞剪接模式也恢復到多能性狀態(tài)。利用siRNA篩選鑒定了調(diào)節(jié)iPSCs剪接模式的關鍵基因U2af1和Srsf3，結果表明它們在體細胞重編程過程中具有重要作用[43]，剪接模式的選擇可能代表了重編程的部分分子網(wǎng)絡。Hou等[17]僅利用小分子化合物成功誘導出miPSCs，其中人類婆羅雙樹樣基因-4(Sal-like4, Sall4)介導的分子通路在小分子化合物誘導重編程的早期發(fā)揮著重要作用。

3.2 iPSCs表觀遺傳調(diào)控

誘導多能性是一個伴隨著表觀遺傳學逐漸變化的過程，如重編程過程中外源基因的沉默[44]，內(nèi)源多能性基因的重新激活[6]，基因啟動子的二價染色質(zhì)域的建立[45]，染色質(zhì)纖維重組[46]等。下文主要從組蛋白修飾、DNA甲基化與去甲基化以及其他表觀修飾形式等方面闡述多能性誘導過程中表觀修飾特性如何形成以及它們對維持多能性的作用。

3.2.1 多能性細胞獨特的組蛋白修飾

隨著分子生物技術的發(fā)展，如今已經(jīng)能夠在全基因組水平描繪出染色體表觀遺傳模式。研究發(fā)現(xiàn)，多能性干細胞擁有特殊的組蛋白修飾模式。

多能性細胞獨特的組蛋白修飾受兩個重要因素影響：一是 PcG(Polycomb group)蛋白，其介導的H3K27甲基化能抑制多能性干細胞中發(fā)育調(diào)節(jié)因子的表達；二是TrxG(Trithorax group)蛋白，其介導的H3K4甲基化能夠激活自我更新相關基因的表達。Mansour等[47]發(fā)現(xiàn)H3K27甲基轉(zhuǎn)移酶Utx參與調(diào)節(jié)iPSCs的誘導效率，與多能性的維持無關。Utx利用其組蛋白脫甲基催化作用，與OSK一起加速iPSCs的形成。H3K4的甲基化由TrxG成員介導， TrxG的主要成員Wdr5在未分化的ESCs和iPSCs中表達最高，隨著細胞分化，其表達水平下降。Wdr5與Oct4相互作用，為iPSCs有效形成所需，Wdr5表達沉默會導致Oct3/4靶基因表達下降、ESCs自我更新能力降低[48]。H3K4去甲基化酶 LSD1 能與Rcor家族輔阻遏蛋白形成復合體發(fā)揮穩(wěn)定甲基化的作用，共表達Rcor2與Oct4、Sox2和 Klf4 能促進iPSCs的形成[49]。組蛋白的乙?；彩嵌嗄苄愿杉毎兄匾慕M蛋白修飾模式。乙?；酵ǔＥc轉(zhuǎn)錄活性相關，由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HATs)和組蛋白去乙?；?HDACs)的調(diào)節(jié)維持平衡。HAT復合物如Gata4和 Gata6是 ESCs發(fā)育的調(diào)控因子，而且明顯與Nanog的靶基因重疊。另外，HDAC抑制劑如丙戊酸[50]能提高 iPSCs的重編程效率，表明組蛋白乙?；瘏⑴c多能性的獲得與維持。

3.2.2 DNA甲基化和去甲基化

在iPSCs中觀察到的DNA甲基化能表現(xiàn)其來源體細胞的特征，暗示表觀遺傳記憶的存在[51]。

Shao等[11]通過對比人類骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)、ESCs和由MSCs誘導的iPSCs的DNA甲基化模式發(fā)現(xiàn)，iPSCs攜帶體細胞的表觀遺傳記憶，并且其甲基化模式與ESCs相似，但iPSCs的DNA甲基化通常在CpG島外，而且主要發(fā)生在參與分化的基因。有研究表明，非CpG的胞嘧啶DNA甲基化可能與其精確性有關[52]。為探索多能性干細胞逆轉(zhuǎn)衰老是否伴隨著特定的衰老相關DNA甲基化，Koch等[53]對比間充質(zhì)干細胞在長期培養(yǎng)、紅外輻射、永生化和誘導為 iPSCs 4種過程的DNA甲基化的變化，結果表明長期培養(yǎng)與表觀遺傳調(diào)控相關，電離輻射不會影響衰老相關的DNA甲基化，過表達人端粒酶催化亞基或用強力霉素誘導細胞的永生化能延長端粒卻不能避免衰老相關的DNA甲基化，只有iPSCs幾乎避免了全部的衰老相關的 DNA甲基化。這表明 iPSCs中衰老相關DNA甲基化相對較少，可能在它們恢復干性、逃避細胞衰老的過程中發(fā)揮重要的作用。

在重編程過程中，內(nèi)源多能性基因(包括Oct3/4和Nanog)的激活伴隨著其啟動子區(qū)域胞嘧啶的去甲基化，多能性基因啟動子區(qū)域的DNA去甲基化不足，會導致其不能被激活[54]。Tet(Ten-eleven translocation, Tet)蛋白能夠催化 5-甲基胞嘧啶(5-mC)轉(zhuǎn)化為 5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)，參與DNA去甲基化，對重編程具有重要的調(diào)節(jié)作用[55]。

3.2.3 其他的表觀調(diào)控

最近，中美科學家聯(lián)合攻關發(fā)現(xiàn)了 iPSCs形成過程中的一個關鍵“路障”——細胞內(nèi)的染色體構象，研究結果表明，體細胞僅有4個轉(zhuǎn)錄因子不足以形成完全多能性干細胞，還取決于另一個關鍵因素，即SMC1(Structural maintenance of chromosomes 1)蛋白介導的染色體三維內(nèi)環(huán)構象[56]。

X染色體失活(X chromosome inactivation, XCI)也具有一定的調(diào)控作用。mESCs攜帶兩條活性染色體(XaXa)，隨著這些細胞的分化會啟動 XCI，即其中一條X染色體失活，從而平衡雄性動物(XY)和雌性動物(XX)X相關基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)重編程可以使iPSCs重新獲得兩條活性X染色體，但Tchieu等的研究表明某些 iPSCs仍保持著體細胞中失活的X 染色體[57,58]，這些差異可能與哺乳動物發(fā)育過程中X染色體失活起始的不同機制有關。因此，關于重編程過程中X染色體的失活與重新激活的分子機制尚需要進一步研究。

重編程是轉(zhuǎn)錄因子等內(nèi)因和培養(yǎng)條件等外因共同推動的結果，在誘導 iPSCs的過程中，外源性信號與內(nèi)源性信號形成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡共同調(diào)控iPSCs的形成。

4 iPSCs的質(zhì)量監(jiān)控

迄今，多項研究對 iPSCs克隆進行了形態(tài)學、AKP染色、內(nèi)源與外源多能性基因的檢測、畸胎瘤的形成與分析等鑒定，并由 iPSCs產(chǎn)生了嵌合體動物[6,17]。這些研究已充分驗證iPSCs的多能性，但要生產(chǎn)臨床級別的iPSCs，應避免慢病毒轉(zhuǎn)基因的整合，保證其完全重編程，不會發(fā)生遺傳不穩(wěn)定現(xiàn)象，并使其脫離飼養(yǎng)層及動物源血清培養(yǎng)體系，最后，至關重要的是建立評定 iPSCs質(zhì)量的可靠方法，這有利于篩選高質(zhì)量的iPSCs進行臨床應用。

外源基因整合是影響 iPSCs質(zhì)量的一個重要方面?；蚪M的變化可能會影響 iPSCs的核型，甚至可能有致瘤危險。iPSCs中的基因組不穩(wěn)定性已體現(xiàn)在大量的畸變中，然而，目前核型分析技術尚不能直接檢測全部的變異[23]。因此，需要諸如用Array-based比較基因組雜交(Comparative genomic hybridization, CGH)、單核苷酸多態(tài)性芯片(Singlenucleotide polymorphism-based microarrays, SNP 芯片)或外顯子測序等更嚴謹?shù)姆椒▉龛b定新的細胞系。在 iPSCs誘導過程中，細胞必須穿越表觀遺傳屏障才能成功重編程，因此，檢測多能性干細胞的表觀遺傳模式在評定其質(zhì)量方面尤為重要。由于DNA甲基化穩(wěn)定而且具有長期記憶的特點，可望成為評定多能性干細胞質(zhì)量的候選方法[11]。據(jù)此，也可以嘗試添加甲基化抑制劑等幫助細胞穿越表觀遺傳屏障以提高 iPSCs的效率和質(zhì)量。通過可靠的iPSCs質(zhì)量評定方法，在早期鑒定細胞質(zhì)量，就可以使用高質(zhì)量 iPSCs培育組織和器官，這不僅有利于提高器官移植的安全性，還能降低成本。

5 展 望

iPSCs應用前景廣闊，在疾病模型構建、細胞移植治療和改善動物性能等方面具有重要作用。今后，iPSCs的培養(yǎng)應傾向于隔離飼養(yǎng)層體系，并盡量縮短培養(yǎng)時間以降低培養(yǎng)過程中累積突變的概率。在臨床使用前，必須對細胞基因組完整性以及穩(wěn)定性實行評估。目前，高通量測序可以在全基因組水平顯示基因組的變化，通過比較iPSCs、ESCs以及體細胞的內(nèi)在突變率，可以鑒定細胞是否達到臨床級水平。迄今，iPSCs研究已取得了巨大的進步，但目前仍有許多問題亟待解決。最重要的是 iPSCs的重編程機制問題以及如何獲得安全性更高的iPSCs。隨著科學技術的不斷進步和這些問題的解決，iPSCs必將為人類生命科學的發(fā)展翻開新的篇章。

[1] Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature, 1981, 292(5819): 154-156.

[2] Buehr M, Meek S, Blair K, Yang J, Ure J, Silva J, McLay R, Hall J, Ying QL, Smith A. Capture of authentic embryonic stem cells from rat blastocysts. Cell, 2008, 135(7): 1287-1298.

[3] Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science, 1998, 282(5391): 1145-1147.

[4] Suemori H, Tada T, Torii R, Hosoi Y, Kobayashi K, Imahie H, Kondo Y, Iritani A, Nakatsuji N. Establishment of embryonic stem cell lines from cynomolgus monkey blastocysts produced by ivf or icsi. Dev Dyn, 2001, 222(2): 273-279.

[5] Thomson JA, Kalishman J, Golos TG, Durning M, Harris CP, Hearn JP. Pluripotent cell lines derived from common marmoset (callithrix jacchus) blastocysts. Biol Reprod, 1996, 55(2): 254-259.

[6] Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 2006, 126(4): 663-676.

[7] Robinton DA, Daley GQ. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature, 2012, 481(7381): 295-305.

[8] Urano F. Wolfram syndrome ips cells: The first human cell model of endoplasmic reticulum disease. Diabetes, 2014, 63(3): 844-846.

[9] Phillips MJ, Perez ET, Martin JM, Reshel ST, Wallace KA, Capowski EE, Singh R, Wright LS, Clark EM, Barney PM, Stewart R, Dickerson SJ, Miller MJ, Percin EF, Thomson JA, Gamm DM. Modeling human retinal development with patient-specific Induced Pluripotent Stem cells reveals multiple roles for Visual System Homeobox 2. Stem Cells, 2014, 32(6): 1480-1492.

[10] Bock C, Kiskinis E, Verstappen G, Gu HC, Boulting G, Smith ZD, Ziller M, Croft GF, Amoroso MW, Oakley DH, Gnirke A, Eggan K, Meissner A. Reference maps of human es and ips cell variation enable high-throughput characterization of pluripotent cell lines. Cell, 2011, 144(3): 439-452

[11] Shao KF, Koch C, Gupta MK, Lin Q, Lenz M, Laufs S, Denecke B, Schmidt M, Linke M, Hennies HC, Hescheler J, Zenke M, Zechner U, ?aric T, Wagner W. Induced pluripotent mesenchymal stromal cell clones retain donor-derived differences in DNA methylation profiles. Mol Ther Jan, 2013, 21(1): 240-250.

[12] Laurent LC, Ulitsky I, Slavin I, Tran H, Schork A, Morey R, Lynch C, Harness JV, Lee S, Barrero MJ, Ku S, Martynova M, Semechkin R, Galat V, Gottesfeld J, Izpisua Belmonte JCI, Murry C, Keirstead HS, Park HS, Schmidt U, Laslett AL, Muller FJ, Nievergelt CM, Shamir R, Loring JF. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human escs and ipscs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell, 2011, 8(1): 106-118.

[13] Bar-Nur O, Russ HA, Efrat S, Benvenisty N. Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells. Cell Stem Cell, 2011, 9(1): 17-23.

[14] Urbach A, Bar-Nur O, Daley GQ, Benvenisty N. Differential modeling of fragile x syndrome by human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell, 2010, 6(5): 407-411.

[15] Bao L, He LXZ, Chen JJ, Wu Z, Liao J, Rao LJ, Ren JT, Li H, Zhu H, Qian L, Gu YJ, Dai HM, Xu X, Zhou JQ, Wang W, Cui C, Xiao L. Reprogramming of ovine adult fibroblasts to pluripotency via drug-inducible expression of defined factors. Cell Res, 2011, 21(4): 600-608.

[16] Warren L, Manos PD, Ahfeldt T, Loh YH, Li H, Lau F, Ebina W, Mandal PK, Smith ZD, Meissner A, Daley GQ, Brack AS, Collins JJ, Cowan C, Schlaeger TM, Rossi DJ. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mrna. Cell Stem Cell, 2010, 7(5): 618-630.

[17] Hou P, Li Y, Zhang X, Liu C, Guan J, Li H, Zhao T, Ye J, Yang W, Liu K, Ge J, Xu J, Zhang Q, Zhao Y, Deng H. Pluripotent stem cells induced from mouse somatic cells by small-molecule compounds. Science, 2013, 341(6146): 651-654.

[18] Esteban MA, Pei DQ. Vitamin c improves the quality of somatic cell reprogramming. Nat Genet, 2012, 44(4): 366-367.

[19] Fluri DA, Tonge PD, Song H, Baptista RP, Shakiba N, Shukla S, Clarke G, Nagy A, Zandstra PW. Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures. Nat Methods, 2012, 9(5): 509-516.

[20] Nakagawa M, Taniguchi Y, Senda S, Takizawa N, Ichisaka T, Asano K, Morizane A, Doi D, Takahashi J, Nishizawa M, Yoshida Y, Toyoda T, Osafune K, Sekiguchi K, Yamanaka S. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci Rep, 2014, 4: 3594.

[21] Taapken SM, Nisler BS, Newton MA, Sampsell-Barron TL, Leonhard KA, McIntire EM, Montgomery KD. Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotech, 2011, 29(4): 313-314.

[22] Ronen D, Benvenisty N. Genomic stability in reprogramming. Curr Opin Genet Dev, 2012, 22(5): 444-449.

[23] Ben-David U, Benvenisty N. High prevalence of evolutionarily conserved and species-specific genomic aberrations in mouse pluripotent stem cells. Stem Cells, 2012, 30(4): 612-622.

[24] Martins-Taylor K, Nisler BS, Taapken SM, Compton T, Crandall L, Montgomery KD, Lalande M, Xu RH. Recurrent copy number variations in human induced pluripotent stem cells. Nat Biotech, 2011, 29(6): 488-491.

[25] Mayshar Y, Ben-David U, Lavon N, Biancotti JC, Yakir B, Clark AT, Plath K, Lowry WE, Benvenisty N. Identification and classification of chromosomal aberrations in human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell, 2010, 7(4): 521-531.

[26] Hussein SM, Batada NN, Vuoristo S, Ching RW, Autio R, N?rv? E, Ng S, Sourour M, H?m?l?inen R, Olsson C,Lundin K, Mikkola M, Trokovic R, Peitz M, Brüstle O, Bazett-Jones DP, Alitalo K, Lahesmaa R, Nagy A, Otonkoski T. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature, 2011, 471(7336): 58-62.

[27] Abyzov A, Mariani J, Palejev D, Zhang Y, Haney MS, Tomasini L, Ferrandino AF, Rosenberg Belmaker LA, Szekely A, Wilson M, Kocabas A, Calixto NE, Grigorenko EL, Huttner A, Chawarska K, Weissman S, Urban AE, Gerstein M, Vaccarino FM. Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells. Nature, 2012, 492(7429): 438-442.

[28] Hamada M, Malureanu LA, Wijshake T, Zhou W, van Deursen JM. Reprogramming to pluripotency can conceal somatic cell chromosomal instability. PLoS Genet, 2012, 8(8): e1002913.

[29] Ji JF, Ng SH, Sharma V, Neculai D, Hussein S, Sam M, Trinh Q, Church GM, Mcpherson JD, Nagy A, Batada NN. Elevated coding mutation rate during the reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem cells. Stem Cells, 2012, 30(3): 435-440.

[30] Cheng LZ, Hansen NF, Zhao L, Du YT, Zou CL, Donovan FX, Chou BK, Zhou GY, Li SJ, Dowey SN, Ye ZH, Chandrasekharappa SC, Yang HM, Mullikin JC, Liu PP. Low incidence of DNA sequence variation in human induced pluripotent stem cells generated by nonintegrating plasmid expression. Cell Stem Cell, 2012, 10(3): 337-344.

[31] Polo JM, Liu S, Figueroa ME, Kulalert W, Eminli S, Tan KY, Apostolou E, Stadtfeld M, Li Y, Shioda T, Natesan S, Wagers AJ, Melnick A, Evans T, Hochedlinger K. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol, 2010, 28(8): 848-855.

[32] Young MA, Larson DE, Sun CW, George DR, Ding L, Miller CA, Lin L, Pawlik KM, Chen K, Fan X, Schmidt H, Kalicki-Veizer J, Cook LL, Swift GW, Demeter RT, Wendl MC, Sands MS, Mardis ER, Wilson RK, Townes TM, Ley TJ. Background mutations in parental cells account for most of the genetic heterogeneity of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell, 2012, 10(5): 570-582.

[33] McConnell MJ, Lindberg MR, Brennand KJ, Piper JC, Voet T, Cowing-Zitron C, Shumilina S, Lasken RS, Vermeesch JR, Hall IM, Gage FH. Mosaic copy number variation in human neurons. Science, 2013, 342(6158): 632-637.

[34] Liu P, Kaplan A, Yuan B, Hanna JH, Lupski JR, Reiner O. Passage number is a major contributor to genomic structural variations in mouse ips cells. Stem Cells, 2014, doi: 10.1002/stem.1779.

[35] Suzuki K, Yu C, Qu J, Li M, Yao XT, Yuan TT, Goebl A, Tang SW, Ren RT, Aizawa E, Zhang F, Xu XL, Soligalla RD, Chen F, Kim J, Kim NY, Liao HK, Benner C, Esteban CR, Jin YB, Liu GH, Li YR, Izpisua Belmonte JC. Targeted gene correction minimally impacts whole-genome mutational load in human-disease-specific induced pluripotent stem cell clones. Cell Stem Cell, 2014, 15(1): 31-36.

[36] Vaziri H, Chapman K, Guigova A, Teichroeb J, Lacher MD, Sternberg H, Singec I, Briggs L, Wheeler J, Sampathkumar J, Gonzalez R, Larocca D, Murai J, Snyder E, Andrews W, Funk WH, West MD. Spontaneous reversal of the developmental aging of normal human cells following transcriptional reprogramming. Regen Med, 2010, 5(3): 345-363.

[37] Wang F, Yin Y, Ye XY, Liu K, Zhu HY, Wang LL, Chiourea M, Okuka M, Ji GZ, Dan JM, Zuo BF, Li MS, Zhang Q, Liu N, Chen LY, Pan XH, Gagos S, Keefe DL, Liu L. Molecular insights into the heterogeneity of telomere reprogramming in induced pluripotent stem cells. Cell Res, 2012, 22(4): 757-768.

[38] Yehezkel S, Rebibo-Sabbah A, Segev Y, Tzukerman M, Shaked R, Huber I, Gepstein L, Skorecki K, Selig S. Reprogramming of telomeric regions during the generation of human induced pluripotent stem cells and subsequent differentiation into fibroblast-like derivatives. Epigenetics, 2011, 6(1): 63-75.

[39] Prigione A, Lichtner B, Kuhl H, Struys EA, Wamelink M, Lehrach H, Ralser M, Timmermann B, Adjaye J. Human induced pluripotent stem cells harbor homoplasmic and heteroplasmic mitochondrial DNA mutations while maintaining human embryonic stem cell-like metabolic reprogramming. Stem Cells, 2011, 29(9): 1338-1348.

[40] Sharma A, Diecke S, Zhang WY, Lan F, He C, Mordwinkin NM, Chua KF, Wu JC. The role of sirt6 protein in aging and reprogramming of human induced pluripotent stem cells. J Biol Chem, 2013, 288(25): 18439-18447.

[41] Banito A, Rashid ST, Acosta JC, Li S, Pereira CF, Geti I, Pinho S, Silva JC, Azuara V, Walsh M, Vallier L, Gil J. Senescence impairs successful reprogramming to pluripotent stem cells. Genes Dev, 2009, 23(18): 2134-2139.

[42] Tanabe K, Nakamura M, Narita M, Takahashi K, Yamanaka S. Maturation, not initiation, is the major roadblock during reprogramming toward pluripotency from human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110(30): 12172-12179.

[43] Ohta S, Nishida E, Yamanaka S, Yamamoto T. Globalsplicing pattern reversion during somatic cell reprogramming. Cell Rep, 2013, 5(2): 357-366.

[44] Okita K, Ichisaka T, Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature, 2007, 448(7151): 313-317.

[45] Mikkelsen TS, Hanna J, Zhang XL, Ku MC, Wernig M, Schorderet P, Bernstein BE, Jaenisch R, Lander ES, Meissner A. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature, 2008, 454(7205): 794-794.

[46] Fussner E, Djuric U, Strauss M, Hotta A, Perez-Iratxeta C, Lanner F, Dilworth FJ, Ellis J, Bazett-Jones DP. Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming. Embo J, 2011, 30(9): 1778-1789.

[47] Mansour AA, Gafni O, Weinberger L, Zviran A, Ayyash M, Rais Y, Krupalnik V, Zerbib M, Amann-Zalcenstein D, Maza I, Geula S, Viukov S, Holtzman L, Pribluda A, Canaani E, Horn-Saban S, Amit I, Novershtern N, Hanna JH. The h3k27 demethylase utx regulates somatic and germ cell epigenetic reprogramming. Nature, 2012, 488(7411): 409-413.

[48] Ang YS, Tsai SY, Lee DF, Monk J, Su J, Ratnakumar K, Ding JJ, Ge YC, Darr H, Chang B, Wang JL, Rendl M, Bernstein E, Schaniel C, Lemischka IR. Wdr5 mediates self-renewal and reprogramming via the embryonic stem cell core transcriptional network. Cell, 2011, 145(2): 183-197.

[49] Yang P, Wang YX, Chen JY, Li H, Kang L, Zhang Y, Chen S, Zhu B, Gao SR. Rcor2 is a subunit of the lsd1 complex that regulates esc property and substitutes for sox2 in reprogramming somatic cells to pluripotency. Stem Cells, 2011, 29(5): 791-801.

[50] Li X, Shan ZY, Wu YS, Shen XH, Liu CJ, Shen JL, Liu ZH, Lei L. Generation of neural progenitors from induced bama miniature pig pluripotent cells. Reproduction, 2014, 147(1): 65-72.

[51] Ohi Y, Qin H, Hong C, Blouin L, Polo JM, Guo T, Qi Z, Downey SL, Manos PD, Rossi DJ, Yu J, Hebrok M, Hochedlinger K, Costello JF, Song JS, Ramalho-Santos M. Incomplete DNA methylation underlies a transcriptional memory of somatic cells in human ips cells. Nat Cell Biol, 2011, 13(5): 541-549.

[52] Williams K, Christensen J, Pedersen MT, Johansen JV, Cloos PAC, Rappsilber J, Helin K. Tet1 and hydroxymethylcytosine in transcription and DNA methylation fidelity. Nature, 2011, 473(7347): 343-348

[53] Koch CM, Reck K, Shao KF, Lin Q, Joussen S, Ziegler P, Walenda G, Drescher W, Opalka B, May T, Brummendorf T, Zenke M, Saric T, Wagner W. Pluripotent stem cells escape from senescence-associated DNA methylation changes. Genome Res, 2013, 23(2): 248-259.

[54] Deng J, Shoemaker R, Xie B, Gore A, LeProust EM, Antosiewicz-Bourget J, Egli D, Maherali N, Park IH, Yu J, Daley GQ, Eggan K, Hochedlinger K, Thomson J, Wang W, Gao Y, Zhang K. Targeted bisulfite sequencing reveals changes in DNA methylation associated with nuclear reprogramming. Nat Biotech, 2009, 27(4): 353-360

[55] Saitou M, Kagiwada S, Kurimoto K. Epigenetic reprogramming in mouse pre-implantation development and primordial germ cells. Development, 2012, 139(1): 15-31.

[56] Zhang H, Jiao WW, Sun L, Fan JY, Chen MF, Wang H, Xu XY, Shen AD, Li T, Niu BB, Ge SF, Li W, Cui JW, Wang GJ, Sun JN, Fan XQ, Hu X,, Mrsny Randall J, Hoffman Andrew R, Hu J-F. Intrachromosomal looping is required for activation of endogenous pluripotency genes during reprogramming. Cell Stem Cell, 2013, 13(1): 30-35.

[57] Tchieu J, Kuoy E, Chin MH, Trinh H, Patterson M, Sherman SP, Aimiuwu O, Lindgren A, Hakimian S, Zack JA, Clark AT, Pyle AD, Lowry WE, Plath K. Female human ipscs retain an inactive x chromosome. Cell Stem Cell, 2010, 7(3): 329-342.

[58] Maherali N, Sridharan R, Xie W, Utikal J, Eminli S, Arnold K, Stadtfeld M, Yachechko R, Tchieu J, Jaenisch R, Plath K, Hochedlinger K. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell, 2007, 1(1): 55-70.

(責任編委: 高紹榮)

Reprogramming mechanism and genetic stability of induced pluripotent stem cells (iPSCs)

Caifang Ren, Hongyan Sun, Lizhong Wang, Guomin Zhang, Yixuan Fan, Guangyao Yan, Dan Wang, Feng Wang

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) were reprogrammed from somatic cells using specific transcription factors. Bypassing the ethical issue caused by embryonic stem cells (ESCs), iPSCs can be successfully induced from a variety of cells, which makes iPSCs a powerful research tool for developmental biology. iPSCs have also become indispensable to the research of life science due to their broad potential applications. However, it's a big challenge to obtain iPSCs with high quality and genetic stability. Here, we review the research progress of increasing the reprogramming mechanism and genetic stability of iPSCs in order to provide references of reprogramming efficiency of iPSCs, reducing the cost, and addressing key points of iPSCs quality control, further promotingclinical application of the iPSCs.

iPSCs; genetic stability; reprogramming; epigenetics

Jiangsu Livestock Embryo Engineering Laboratory, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

2014-04-17;

2014-07-12

國家自然科學基金項目(編號：31272443)資助

任才芳，博士研究生，研究方向：胚胎干細胞。E-mail: 2012105033@njau.edu.cn

王鋒，博士，教授，研究方向：動物胚胎工程。E-mail: caeet@njau.edu.cn

10.3724/SP.J.1005.2014.0879

時間: 2014-8-12 14:18:59

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140812.1418.003.html