響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化水酶法提取火麻仁油工藝參數(shù)

劉 賀 庚 平 張 娟 朱丹實慧麗娟 王 勃 何余堂 馬 濤

(渤海大學化學化工與食品安全學院1，錦州 121013)

(遼寧省高校重大科技平臺食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心2，錦州 121013)

(大成食品(大連)有限公司3，大連 116308)

火麻仁是?？浦参锎舐?Cannabis sativa L.)的干燥成熟種仁，在我國作為藥食同源作物已有三千多年的歷史［1］。廣西巴馬縣是世界自然醫(yī)學會確認的五大長壽地區(qū)之一，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)居民長壽與食用火麻仁油習慣密不可分［2］?；鹇槿屎土恳话銥?0% 左右［3］，不飽和脂肪酸(PUFA)占 70%～80%，其中亞油酸(LA，18∶2n－6)和 α －亞麻酸(ALA，18∶3n－3)分別占總脂肪酸含量的50%～70%和15%～25%?；鹇槿视椭笑兀?與ω－3脂肪酸的比例為 3∶1［4－7］，據(jù) Simopoulos［8］報道，此為人體營養(yǎng)所需的最佳比例?；鹇槿视椭笑茫瓉喡樗?GLA，18∶3n －6)含量較高［9－10］，Senapati等［11］報道，γ － 亞麻酸能有效緩解類風濕性關(guān)節(jié)炎，特異性皮炎及過敏等癥狀。同時，Oomah等［12］發(fā)現(xiàn)在火麻仁油中含有800 mg/kg的生育酚，主要以 γ－生育酚(85%)形式存在。γ－生育酚具有抗氧化、清除自由基、抗癌等功能，其抗氧化能力較α－生育酚和β－生育酚高［13］。因此，火麻仁油具有較高的藥用和食用價值。

傳統(tǒng)植物油提取主要采用溶劑浸出法和壓榨法。溶劑浸出法普遍采用6號溶劑進行油脂浸提。此法提油率較高，但是有機溶劑有一定毒性，會對人體造成損害，并且容易燃燒爆炸。壓榨法雖較溶劑提取法安全，但此法對植物蛋白破壞嚴重［14］。其他提油方法還有水劑法、超臨界CO2萃取法、水酶法等。水劑法與浸出法相比出油率較低，與壓榨法相比工藝路線太長［15］;超臨界CO2萃取法雖有安全高效，無毒無害，蛋白不變性等優(yōu)點，但是其生產(chǎn)成本較高，目前國內(nèi)未將此法應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)［16］。

水酶法提油技術(shù)簡單，操作安全，效率高，此法得油質(zhì)量高，色澤淺，此外，水酶法提油還有生產(chǎn)過程能耗低，無揮發(fā)性有機物，污染少，易處理等優(yōu)點［17］。國內(nèi)外對火麻仁油的研究主要集中在其抗氧化性質(zhì)［18］、脂肪酸組成和氧化穩(wěn)定性［19］等方面。而對于火麻仁油的提取則多見于超臨界 CO2萃取法［20－21］，利用水酶法提取火麻油鮮見報道。因此，本研究擬采用響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化水酶法提取火麻油的工藝參數(shù)，旨在為工業(yè)化應(yīng)用水酶法提取火麻仁油提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火麻仁:廣西絕特投資有限公司，收獲于2013年1月，干燥后于自封袋中密封，陰涼干燥處保存?zhèn)溆?中性蛋白酶、堿性蛋白酶、甘露聚糖酶:北京鴻寶順科技有限公司;纖維素酶:北京華章未央科技有限公司;胰酶:阿波羅試劑(北京)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

L－535R離心機:長沙湘儀離心機有限公司;RRH－100萬能高速粉碎機:歐凱萊芙(香港)實業(yè)有限公司;DHG－9055A電熱鼓風干燥箱:上海一恒科學儀器有限公司;HH－6數(shù)顯恒溫水浴鍋:金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.3 水酶法提取火麻仁油工藝

稱取20 g粉碎的火麻仁，裝入250 mL燒杯中，按1∶5的料液比加入100 mL的去離子水，置于90℃下的水浴鍋中滅酶10 min后冷卻。加入單一酶或者復合酶進行酶解(單一酶與復合酶種類見表1)，再在90℃條件下的水浴鍋中滅酶10 min，冷卻后用50 mL的離心管在4 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心15 min，用1 mL移液槍小心移取上層清油和少許的乳化層裝入10 mL的離心管，再次離心15 min，移取上層清油，稱得清油質(zhì)量，計算得油率，篩選出最佳的酶制劑。

清油提取率=清油質(zhì)量(g)/原料含油量(g)×100%

表1 單因素試驗處理表

1.4 火麻仁中油脂含量檢測

采用索氏提取法［22］。

1.5 單因素試驗

利用表1試驗參數(shù)按照1.3中操作提取火麻仁油，每種處理做3次重復。

1.6 響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化試驗

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用中心組合試驗設(shè)計(CCD)以甘露聚糖酶用量(X1)、胰酶用量(X2)、甘露聚糖酶作用時間(X3)、胰酶作用時間(X4)4個因素為自變量，以火麻仁油提取率(Y)為響應(yīng)值，其因素水平編碼如表2。響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果見表3。

表2 中心組合設(shè)計因素水平編碼表

表3 中心組合試驗設(shè)計結(jié)果及預測值

1.7 數(shù)據(jù)分析

單因素試驗數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0軟件進行方差分析和多重比較;響應(yīng)面優(yōu)化采用 Design Expert 8.06軟件進行多元回歸擬合及工藝參數(shù)優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果分析

索氏提取法測得火麻仁的脂肪質(zhì)量分數(shù)為26.1%。不同酶處理得到的火麻仁油提取率平均值、標準誤及差異顯著性如圖1所示。單一蛋白酶處理時，中性蛋白酶(N)提油率最高(42.91%)，且明顯高于胰酶(T)和堿性蛋白酶(A)(P＜0.05)?？赡茉蚴腔鹇槿手械挠椭幸徊糠忠灾鞍?、脂多糖的形式存在，且這些復合物對油脂有一定的包埋作用，阻礙了油脂的浸出。中性蛋白酶(N)的加入使復合物得到分解有利于油脂的釋放，提高出油率［23］。

圖1 不同酶對火麻仁油提取率的影響

復合酶(2種和3種酶復合)作用提油率較單一酶作用提油率提高并不顯著(P＞0.05)(M+T作用除外)?？赡苁怯捎诨鹇槿手卸嗵呛枯^少，多糖酶對提油率的貢獻較小。M+T作用其提油率(49.80%)比 T處理的提油率(31.42%)提高了約18.40%(P＜0.05)。由于甘露聚糖酶對火麻仁中多糖和脂多糖的酶解，提高出油率;也有研究表明甘露聚糖酶能顯著提高胰蛋白酶活性［24］。

單因素試驗結(jié)果表明，M和T復合較適合提取火麻仁油。為進一步確定其最適添加量和作用時間對火麻仁油提取率的影響，并得到最佳工藝參數(shù)以便實際生產(chǎn)，進而本研究采用中心組合設(shè)計對M和T的添加量及作用時間等參數(shù)進行優(yōu)化并建立其提油率回歸模型。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗結(jié)果分析

2.2.1 火麻仁油回歸模型的建立及顯著性檢驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，綜合考慮經(jīng)濟效益及火麻仁油品質(zhì)，確定各因素的最佳水平值范圍，采用中心組合設(shè)計進行四因素五水平試驗，試驗結(jié)果見表3。將所得的試驗數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.06軟件進行多元回歸擬合和工藝參數(shù)的優(yōu)化，得到以提油率為目標函數(shù)的二次回歸方程:

式(1)中，甘露聚糖酶用量 X1、胰酶用量X2、甘露聚糖酶作用時間X3和胰酶作用時間X4在設(shè)計中均經(jīng)量綱線性編碼處理，因此，方程中各項系數(shù)絕對值的大小直接反映了各因素對指標值的影響程度，系數(shù)的正負反映了影響的方向。表4中X2、X4偏回歸系數(shù)顯著(P＜0.01)，可知胰酶用量、胰酶作用時間對火麻仁油提取率影響顯著;二次項X42偏回歸系數(shù)顯著(P＜0.05)，其他各項均未達到顯著水平。

為進一步對該回歸模型進行顯著性檢驗，對火麻仁油提取的數(shù)學模型進行方差分析(表4)，方程變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，該模型回歸顯著(P ＜0.05)，失擬項不顯著(P ＞0.05)，說明未知因素對結(jié)果干擾很小，該模型能基本反映2種酶的添加量和作用時間與提油率的關(guān)系?？梢杂么四Ｐ蛠矸治龊皖A測水酶法提取火麻籽油的結(jié)果。因此，上述二次回歸方程模型合適。由F檢驗可以得到因子貢獻率為:X2＞X4＞X3＞X1，即胰酶用量(T)＞胰酶作用時間(T)＞甘露聚糖酶(M)作用時間＞甘露聚糖酶用量(M)。

表4 中心組合設(shè)計方差分析

2.2.2 火麻仁油提取的響應(yīng)面分析與優(yōu)化

圖2為不同變量交互作用對提油率影響的響應(yīng)面圖。圖2a顯示胰酶用量和甘露聚糖酶用量對火麻仁油提取率的響應(yīng)面圖和等高線圖。隨著甘露聚糖酶用量的變化(1 000～2 000 U/g)，火麻仁油提取率先增大后減小，約在1 895 U/g達到最大值。而提油率隨著胰酶的用量增加而增大。圓形等高線表明胰酶用量和甘露聚糖酶用量二者交互作用對提油率影響不顯著(P＜0.05)。圖2b顯示，隨著甘露聚糖酶的作用時間的增加，提油率先增大后減小。橢圓形的等高線表明甘露聚糖酶用量及其作用時間交互作用對提油率影響不顯著。圖2c顯示，火麻仁油提取率隨著胰酶作用時間的增加，先增加后減少。甘露糖聚酶用量對提取率影響較小的原因，可能是由于火麻仁中多糖含量太少［25］，或是由于火麻仁中多糖與脂肪復合物較少，即脂多糖含量較少不足以影響油脂的提取率。圓形等高線說明胰酶作用時間和甘露聚糖酶用量交互作用對提油率影響不顯著。由圖2d可知，火麻仁油提取率與胰酶用量呈正相關(guān)。主要由于火麻仁中蛋白含量較高，胰酶對其蛋白質(zhì)的酶解作用使得油脂浸出更加容易。圓形等高線顯示兩者交互作用對提油率影響不顯著。圖2e表明，隨著胰酶作用時間的延長提油率先升高后降低，并且趨勢較平緩，同時提油率也隨著胰酶用量的增加而增大。但是胰酶作用時間及其用量的交互作用對提油率影響不顯著。圖2f表明，胰酶作用時間和甘露聚糖酶作用時間對火麻油提取率的影響。圓形等高線顯示甘露聚糖酶作用時間和胰酶作用時間交互作用對提油效果影響不顯著。

圖2 不同變量交互作用對提油率影響的響應(yīng)面圖

2.3 火麻仁油提取最佳條件的確立和試驗驗證

在選取的各因素范圍內(nèi)，根據(jù)回歸模型通過Design Expert 8.06軟件分析得出，火麻仁油最佳提取條件為:甘露聚糖酶用量1 896 U/g，酶解溫度69℃，pH為8，酶解時間1.68 h，再加入500 U/g胰酶，pH為8，40℃條件下酶解2 h，火麻仁油的提取率預測值為62.49%。考慮到實際操作的便利，確定火麻仁油提取工藝條件為:甘露聚糖酶用量1 900 U/g，酶解溫度70℃，pH 為8，酶解1.7 h，再加入500 U/g胰酶，pH為8，40℃下酶解2 h。將此工藝條件擴增相應(yīng)比例后，對300 g火麻仁進行油脂提取，試驗做3次重復，得到平均提油率為61.95%。響應(yīng)值的試驗值與回歸方程預測值吻合良好，說明該模型能較好地預測實際生產(chǎn)中火麻仁油提取率。

3 結(jié)論

3.1 采用中心組合設(shè)計和響應(yīng)面優(yōu)化得到了甘露聚糖酶用量，甘露聚糖酶作用時間，胰酶用量，胰酶作用時間4個因素與火麻仁油提取率的回歸方程，方差分析結(jié)果表明該模型回歸顯著(P＜0.05)，失擬項不顯著(P＞0.05)，說明該方程能用來預測火麻仁油提取率隨各參數(shù)變化的規(guī)律。

3.2 優(yōu)化得到最佳工藝條件為:甘露聚糖酶1 900 U/g，在溫度為70℃、pH為8的條件下酶解1.7 h，再用500 U/g胰酶，溫度為40℃、pH為8的條件下酶解2 h，提油率可達到62.49%。

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