微波輔助堿法降解黃曲霉毒素工藝對米蛋白品質(zhì)的影響

王 勇 趙秀平 王 韌 王 莉羅小虎 唐小俊 魏振承 張名位 陳正行

(江南大學(xué)食品學(xué)院糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1，無錫 214122)

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所2，廣州 510610)

米蛋白因其氨基酸配比合理、生物價(jià)高、蛋白質(zhì)效用比率高以及低過敏性等特點(diǎn)，被營養(yǎng)界公認(rèn)為優(yōu)質(zhì)植物蛋白質(zhì)［1］。但由于稻谷在田間、貯藏和加工等環(huán)節(jié)容易染上黃曲霉和寄生曲霉等而產(chǎn)生黃曲霉毒素，導(dǎo)致米制品(如米蛋白)中黃曲霉毒素含量不符合國家標(biāo)準(zhǔn)(≤10 μg/kg)。在發(fā)霉嚴(yán)重的情況下，稻米將被銷毀，給相關(guān)企業(yè)和部門造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［2－3］。因此，有效降解發(fā)霉稻米中的黃曲霉毒素逐步成為提高糧食利用率、保護(hù)糧食的重要措施之一。

在實(shí)際生產(chǎn)過程中，通常采用傳統(tǒng)堿法工藝制備高回收率、高純度米蛋白［4］。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)［5］，以添加不同黃曲霉毒素B1(AFB1)初始濃度(20、40、60、80和100 μg/kg)的加標(biāo)染毒稻米為原料，傳統(tǒng)堿法所制備的米蛋白中AFB1殘留濃度均超標(biāo);然而，在堿法制備米蛋白的基礎(chǔ)上，經(jīng)優(yōu)化，采用單位體積微波功率750 W/L對不同AFB1初始濃度的米蛋白上清液分別輔助處理 0.2、3.1、5.6、7.2 和 8.6 min，所制備的米蛋白中 AFB1殘留濃度(8.71、9.97、9.90、9.95 和9.94 μg/kg)均符合國標(biāo)。上述微波輔助堿法降解AFB1的有效性已得到驗(yàn)證，但降解后其對米蛋白品質(zhì)的影響仍需進(jìn)一步研究。

微波是一種頻率介于300 MHz與300 GHz之間的電磁波，能夠引起極性分子振動(dòng)從而對食品物料產(chǎn)生影響，作為一種新型非熱技術(shù)被逐步廣泛應(yīng)用于食品加工過程中［6］。微波對蛋白功能性質(zhì)的影響顯著，國內(nèi)外對此有大量的研究［7－10］。本試驗(yàn)選取米蛋白的回收率及純度、溶解性、乳化性、起泡性、持水性和持油性等基本性質(zhì)與功能特性作為檢測指標(biāo)，評估微波輔助堿法降解AFB1過程中微波對米蛋白品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

稻米樣品:市售，研磨粉碎過80～100目，篩下物密封，4℃冷藏，經(jīng)測定，蛋白質(zhì)6.28%(干基);AFB1標(biāo)品:純度 ＞99.0%，Alexis;MycosepTM226 MFC:Romer Labs;Folin－酚乙試劑:Sigma;胰蛋白酶:丹麥Novozyme公司。

華燁HYP－1 020定氮消化爐:上海纖檢儀器有限公司;FJ－200高速分散均質(zhì)機(jī):上海標(biāo)本模型廠;MZG1 500S型微波實(shí)驗(yàn)儀:南京匯研微波系統(tǒng)工程有限公司;FreeZone型冷凍干燥機(jī):Labconco公司;高效液相色譜儀Agilent 1260 Infinity(熒光檢測器，激發(fā)波長200～700 nm，發(fā)射波長280～900 nm):Agilent公司;MAPADA UV－1800紫外分光光度計(jì):上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 微波輔助堿法制備無毒米蛋白優(yōu)化工藝

加標(biāo)染毒稻米(AFB1初始濃度分別為20、40、60、80 和100 μg/kg)以料液比 1∶8 浸入 0.06 mol/L NaOH溶液中，不斷攪拌60 min，8 000 r/min離心10 min取上清液;采用單位體積微波功率750 W/L對不同 AFB1初始濃度的上清液分別處理 0.2、3.1、5.6、7.2 和8.6 min，冷卻至室溫;調(diào) pH 6，滴加過量 α －淀粉酶反應(yīng)1 h酶解上清液中殘留的淀粉，再調(diào)pH 4.6，滅酶、酸沉，離心取沉淀，水洗2次，冷凍干燥，得到米蛋白制品。經(jīng)測定［11］，所得到的米蛋白制品中AFB1殘留濃度均符合國標(biāo)。

1.2.2 米蛋白回收率及純度的測定

采用微量凱氏定氮法［12］測定稻米及米蛋白制品中蛋白質(zhì)含量，米蛋白回收率及純度表達(dá)式如下:

回收率R/%=(米蛋白制品含量×P)/稻米中總蛋白質(zhì)含量×100

純度P/%=米蛋白制品蛋白測定含量/米蛋白制品含量×100

1.2.3 米蛋白功能特性及營養(yǎng)性質(zhì)的測定

1.2.3.1 米蛋白溶解度的測定［13］

采用Lowry法。米蛋白樣品研磨后過80目篩，以pH 7.0的0.05 mol/L磷酸二氫鉀－氫氧化鈉緩沖液配成10 g/L的濃度，25℃電磁攪拌1 h，6 000 r/min離心10 min，用Lowry法在分光光度計(jì)640 nm處測定上清液的OD值，先獲得牛血清白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線，再測定上清液中蛋白質(zhì)含量。米蛋白樣品總蛋白質(zhì)含量使用微量凱氏定氮法測定。米蛋白溶解度用氮溶解度指數(shù)NSI表示，表達(dá)式如下:

氮溶解度指數(shù)NSI/%=上清液中蛋白質(zhì)含量/米蛋白樣品總蛋白質(zhì)含量×100

1.2.3.2 米蛋白乳化性的測定［14］

采用濁度法。取1 g/L濃度的蛋白溶液63 mL于250 mL燒杯中，加入27 mL大豆色拉油;用高速分散均質(zhì)機(jī)在12 000 r/min轉(zhuǎn)速下分散2 min;用注射器從底部取0.1 mL乳狀液，迅速與5 mL 1 g/L SDS溶液混合均勻，在500 nm波長下比色，記錄吸光度(E0);10 min后再從底部取0.1 mL乳狀液，同樣稀釋，比色，記錄吸光度(Et)。蛋白質(zhì)的乳化能力以乳化能力指數(shù)E0和乳化穩(wěn)定性指數(shù)ESI表示，其中:

ESI/min=E0×t/(E0－Et)

1.2.3.3 米蛋白起泡性的測定［15－16］

用0.05 mol/L磷酸二氫鉀－氫氧化鈉緩沖液(pH 7.0)配成1 g/L米蛋白樣品，取100 mL用高速分散均質(zhì)機(jī)在10 000 r/min轉(zhuǎn)速下分散2 min;轉(zhuǎn)入250 mL量筒，迅速記錄溶液與泡沫總體積V0，將上述體系靜置30 min后，測出下層析出液的體積Vt。

起泡性FC/%=(V0－100)/100×100

起泡穩(wěn)定性/%=Vt/V0×100

1.2.3.4 米蛋白持水、持油能力的測定［1，16］

持水性:準(zhǔn)確稱取蛋白質(zhì)樣品W0于50 mL離心管中，加入10 mL去離子水，用漩渦混合器混勻，然后4 500 r/min離心15 min，傾去上清液，將離心管斜置 30 min，稱重 Wt。

持油性:準(zhǔn)確稱取大米蛋白樣品W0于50 mL離心管中，加入5 mL大豆色拉油，用漩渦混合器混勻，然后4 500 r/min離心15 min，吸去上層未吸附油，稱重Wt。

持水能力(持油能力)/g=(Wt－W0)/W0

1.2.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)重復(fù)3次，采用OriginPro 9.0作圖和SPSS 17.0進(jìn)行ANOVA方差分析(Tukey分析均值差異的顯著性，顯著水平P≤0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波對米蛋白回收率及純度的影響

本研究中，每組投料量為1 L，考察單位體積微波功率750 W/L處理不同時(shí)間對米蛋白回收率及純度的影響。如圖1所示，與堿法制備米蛋白相比，微波輔助堿法制備米蛋白的回收率(F=1.889，P=0.542 ＞0.05)及純度(F=2.378，P=0.209 ＞0.05)變化不顯著，回收率為77.34%～78.57%，純度為93.71%～94.35%，表明微波對米蛋白回收率及純度的影響不大。

圖1 微波對米蛋白回收率及純度的影響(n=3)

2.2 微波對米蛋白溶解性的影響

溶解度是蛋白質(zhì)的基本物理性質(zhì)之一，會(huì)影響蛋白質(zhì)的其他功能性質(zhì)及實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。在高頻微波場中，蛋白質(zhì)極性分子與水分子變成有序極性分子并且發(fā)生高速的振蕩、碰撞、摩擦和擠壓作用，產(chǎn)生巨大的熱量，引起蛋白質(zhì)等極性分子基團(tuán)電性質(zhì)變化，從而使蛋白質(zhì)功能性質(zhì)發(fā)生變化［18］。如圖2所示，相比堿法制備米蛋白，經(jīng)微波輔助堿法制備米蛋白的溶解性顯著增強(qiáng);隨著微波處理時(shí)間的延長，米蛋白溶解性也不斷提高，當(dāng)微波處理時(shí)間超過7.2 min時(shí)，米蛋白溶解性變化不顯著。蛋白質(zhì)的溶解性與其表面疏水與親水作用有很大的關(guān)聯(lián)。由于微波的熱效應(yīng)，蛋白分子之間發(fā)生了交聯(lián)，蛋白小分子聚合成大分子，而且交聯(lián)部位很可能集中于疏水基團(tuán)，以至于米蛋白親水性提高，溶解性提高。這與國內(nèi)外研究人員對此所做的相關(guān)研究不盡相同。熊犍等［8］研究表明，隨著微波功率和微波處理時(shí)間的增加，大豆蛋白的溶解性先提高后下降，而Hafez等［9］認(rèn)為微波可使大豆蛋白的溶解性顯著下降。這可能是由于大豆分離蛋白親水性強(qiáng)，微波處理使蛋白質(zhì)親水基團(tuán)交聯(lián)，疏水基團(tuán)暴露得更多，從而導(dǎo)致溶解性下降。

圖2 微波對米蛋白溶解性的影響(n=3)

2.3 微波對米蛋白乳化性的影響

乳化性是蛋白質(zhì)的重要功能之一，是指蛋白質(zhì)將油和水結(jié)合形成油水乳狀液保持穩(wěn)定的能力，具體包括乳化性和乳化穩(wěn)定性2個(gè)方面［1］。由圖3可知，在0～3.1 min，隨著微波處理時(shí)間的延長，米蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性逐漸增強(qiáng)，處理3.1 min時(shí)米蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性最強(qiáng)，但隨著微波處理時(shí)間的進(jìn)一步延長，其乳化性和乳化穩(wěn)定性呈下降趨勢。微波場誘導(dǎo)米蛋白分子產(chǎn)生極化現(xiàn)象，維持蛋白空間結(jié)構(gòu)的非共價(jià)鍵被破壞，蛋白分子部分展開，分子柔性提高，更多的分子結(jié)合到油－水界面;同時(shí)，蛋白分子內(nèi)部的疏水殘基暴露在蛋白表面，其表面疏水性增強(qiáng)，故米蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性增強(qiáng)。但是，當(dāng)微波處理時(shí)間進(jìn)一步延長時(shí)，蛋白分子進(jìn)一步展開，極化的蛋白分子之間相互吸引，通過非共價(jià)鍵重新形成大分子聚集體，分子柔性降低，表面疏水性減弱，故乳化性及乳化穩(wěn)定性呈下降趨勢。

圖3 微波對米蛋白乳化性的影響(n=3)

2.4 微波對米蛋白起泡性的影響

起泡性是指蛋白質(zhì)攪打起泡的能力，而起泡穩(wěn)定性則是泡沫保持穩(wěn)定的能力。由圖4可知，微波輔助處理可提高米蛋白起泡性，但是隨著微波處理時(shí)間的延長其起泡穩(wěn)定性先提高后下降。微波場誘導(dǎo)米蛋白分子產(chǎn)生極化現(xiàn)象，非共價(jià)鍵被破壞，蛋白分子部分展開，其內(nèi)部的疏水殘基暴露在蛋白表面，促進(jìn)蛋白分子間相互作用和水－空氣界面的形成，形成更穩(wěn)定的二維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和界面膜，故起泡性和起泡穩(wěn)定性增強(qiáng)。但隨著微波處理時(shí)間進(jìn)一步延長，蛋白分子進(jìn)一步展開，其內(nèi)部的疏水基團(tuán)和巰基進(jìn)一步暴露，極化的蛋白分子之間通過非共價(jià)鍵重新形成分子聚集體，水－空氣界面膜的穩(wěn)定性下降，因此起泡穩(wěn)定性呈下降趨勢［19］。

圖4 微波對米蛋白起泡性的影響(n=3)

2.5 微波對米蛋白持水性、持油性的影響

蛋白質(zhì)的持水性、持油性是食品儲(chǔ)藏及加工過程中非常重要的指標(biāo)［16］。由圖5可知，微波處理可明顯降低米蛋白的持水能力，但可提高米蛋白的持油能力。微波加熱使米蛋白變性進(jìn)而聚集成大分子聚合體，從而減少米蛋白的比表面積和極性基團(tuán)與水的有效結(jié)合，使得米蛋白的水合能力因蛋白質(zhì)間相互作用的增強(qiáng)而降低，反之，卻提高了米蛋白的持油能力。

圖5 微波對米蛋白持水性和持油性的影響(n=3)

3 結(jié)論

本研究表明，在單位體積微波功率750 W/L條件下，隨著微波處理時(shí)間(0.2、3.1、5.6、7.2 和 8.6 min)的延長，微波輔助堿法制備無毒米蛋白的回收率及純度的變化不顯著，溶解性、起泡性和持油性顯著提高，起泡穩(wěn)定性、乳化性及乳化穩(wěn)定性先提高后下降，而持水性呈下降趨勢。因此在確保米蛋白安全無毒的前提下，微波輔助堿法降解AFB1優(yōu)化工藝對米蛋白品質(zhì)有一定的影響，并且總體上呈現(xiàn)較好的趨勢，但該工藝對米蛋白結(jié)構(gòu)的影響有待于進(jìn)一步研究，從結(jié)構(gòu)層面上深入分析其對米蛋白品質(zhì)的影響。

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