姜黃素對大鼠睪丸缺血再灌注損傷的干預作用

黃 蓉 汪 清 韋思明 潘杭麗 浙江醫(yī)學高等?？茖W校臨床醫(yī)學系 杭州 310053

姜黃素對大鼠睪丸缺血再灌注損傷的干預作用

黃 蓉 汪 清 韋思明 潘杭麗 浙江醫(yī)學高等?？茖W校臨床醫(yī)學系 杭州 310053

目的 觀察姜黃素對大鼠睪丸缺血再灌注損傷的影響。方法 將60只成年雄性SD大鼠隨機分為對照組、缺血再灌注組和治療組，每組20只。對照組大鼠施行左側(cè)睪丸假手術。缺血再灌注組大鼠在左側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)720度2h后復位。治療組大鼠接受與缺血再灌注組相同的外科手術，并于睪丸復位時給予姜黃素（200mg/kg）尾靜脈注射。復位后4h，每組一半的大鼠行睪丸切除術，測定黃嘌呤氧化酶活性、丙二醛水平和血紅素加氧酶-1蛋白表達水平。復位后3個月，剩余大鼠行睪丸切除術，分析睪丸生精功能。結(jié)果 單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復位引起同側(cè)睪丸黃嘌呤氧化酶活性、丙二醛水平和血紅素加氧酶-1蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），睪丸生精功能明顯下降（P＜0.05）。姜黃素干預后，同側(cè)睪丸黃嘌呤氧化酶活性和丙二醛水平顯著下降（P＜0.05），血紅素加氧酶-1蛋白表達水平明顯提高（P＜0.05），睪丸生精功能明顯改善（P＜0.05）。結(jié)論 姜黃素通過抑制黃嘌呤氧化酶活性、提高血紅素加氧酶-1蛋白表達水平，減少活性氧含量，從而保護睪丸生精功能。

大鼠；睪丸扭轉(zhuǎn)復位；缺血再灌注損傷；姜黃素

圖1 三組大鼠睪丸的血紅素加氧酶-1的Western blot代表性結(jié)果。1L和1R表示對照組左側(cè)（即同側(cè)）和右側(cè)（即對側(cè)）睪丸；2L和2R表示缺血再灌注組同側(cè)和對側(cè)睪丸；3L和3R表示治療組同側(cè)和對側(cè)睪丸。

圖2 睪丸組織學。A（HE ×100）：對照組雙側(cè)睪丸及缺血再灌注組和治療組的對側(cè)睪丸均顯示了正常的曲細精管直徑、生精細胞層數(shù)和精子發(fā)生。B（HE ×100）：缺血再灌注組同側(cè)睪丸顯示了曲細精管萎縮、生精細胞層數(shù)減少，精子發(fā)生停止。C（HE ×50）：治療組同側(cè)睪丸顯示多數(shù)曲細精管正常，僅少數(shù)曲細精管異常（箭頭所指處）。

睪丸扭轉(zhuǎn)又稱精索扭轉(zhuǎn)，是指精索沿其縱軸旋轉(zhuǎn)，精索內(nèi)血管受壓阻塞，導致睪丸缺血甚至壞死。復位是治療睪丸扭轉(zhuǎn)的現(xiàn)有方法，可以恢復血供，避免睪丸缺血壞死。睪丸復位后即使存活，但隨后出現(xiàn)睪丸生精功能損傷。睪丸扭轉(zhuǎn)復位后的損傷是一個缺血再灌注損傷，目前缺乏相應的臨床治療。本研究建立大鼠睪丸缺血再灌注損傷模型，探討姜黃素對睪丸缺血再灌注損傷的影響。

1 實驗材料

1.1 動 物 成年雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量250～300g，由上海實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（滬）2012-0002。

1.2 藥物及試劑 姜黃素、β-肌動蛋白抗體和黃嘌呤來源于Sigma公司。丙二醛試劑盒系南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。血紅素加氧酶-1抗體購于Stressgen公司。

2 實驗方法

2.1 大鼠睪丸缺血再灌注損傷模型建立及治療 用隨機數(shù)余數(shù)分組法將60只成年雄性SD大鼠隨機分為對照組、缺血再灌注組和治療組，每組20只。用氯胺酮（50mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉后，施行以下手術。對照組：通過左側(cè)髂腹股溝切口暴露左側(cè)睪丸，用11/0縫線穿過睪丸白膜，放睪丸入陰囊內(nèi)，關閉切口。缺血再灌注組：通過同樣的切口暴露左側(cè)睪丸，將睪丸繞精索逆時針旋轉(zhuǎn)720度，在睪丸白膜與陰囊肉膜之間用11/0縫線縫合固定，保持睪丸缺血狀態(tài)。2h后，拆除縫線，將睪丸繞精索順時針旋轉(zhuǎn)720度，恢復血供，睪丸仍然存活，關閉切口。治療組：施行與缺血再灌注組一樣的外科手術，但在睪丸復位時，從尾靜脈注入姜黃素（200mg/kg）。復位后4h，每組取10只大鼠行雙側(cè)睪丸切除術，測定睪丸中黃嘌呤氧化酶活性、丙二醛水平和血紅素加氧酶-1蛋白表達水平。復位后3個月，每組剩余10只大鼠行雙側(cè)睪丸切除術，分析睪丸生精功能。

2.2 黃嘌呤氧化酶活性和丙二醛水平測定 以黃嘌呤為底物，采用分光光度法測定睪丸組織黃嘌呤氧化酶活性。采用硫代巴比妥酸法測定睪丸組織丙二醛水平。

2.3 血紅素加氧酶-1蛋白表達水平測定 采用Western blot法檢測睪丸組織血紅素加氧酶-1蛋白表達水平。血紅素加氧酶-1與內(nèi)參照β-肌動蛋白的條帶密度比值代表血紅素加氧酶-1蛋白表達水平。

2.4 睪丸生精功能評估 切下睪丸做成石蠟切片，蘇木蘇-伊紅染色。顯微鏡下觀察睪丸曲細精管，測量曲細精管直徑，并行Johnsen評分。

3 結(jié)果

3.1 丙二醛水平和黃嘌呤氧化酶活性 與對照組比較，缺血再灌注組同側(cè)睪丸（即左側(cè)睪丸，也就是缺血再灌注睪丸）組織丙二醛水平和黃嘌呤氧化酶活性顯著升高（P＜0.05）；治療組同側(cè)睪丸組織的上述兩個指標明顯低于缺血再灌注組同側(cè)睪丸（P＜0.05）；三組對側(cè)睪丸（即右側(cè)睪丸）之間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 三組大鼠睪丸丙二醛水平和黃嘌呤氧化酶活性比較（±s）

表1 三組大鼠睪丸丙二醛水平和黃嘌呤氧化酶活性比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與同組對側(cè)睪丸比較，△P＜0.05；與缺血再灌注組同側(cè)睪丸比較，▲P＜0.05

?

3.2 血紅素加氧酶-1蛋白表達水平 缺血再灌注組同側(cè)睪丸血紅素加氧酶-1表達水平明顯高于對照組（P＜0.05）；治療組同側(cè)睪丸的表達水平顯著高于缺血再灌注組同側(cè)睪丸（P＜0.05）；三組對側(cè)睪丸之間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1（插頁），表2。

表2 三組大鼠睪丸血紅素加氧酶-1蛋白表達水平比較（±s）

表2 三組大鼠睪丸血紅素加氧酶-1蛋白表達水平比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與同組對側(cè)睪丸比較，△P＜0.05；與缺血再灌注組同側(cè)睪丸比較，▲P＜0.05

組別對照組缺血再灌注組治療組n/只10 10 10同側(cè)睪丸1.16±0.25 5.28±0.41*△9.20±0.45▲△*對側(cè)睪丸1.08±0.23 1.11±0.21 1.13±0.26

3.3 睪丸生精功能 與對照組比較，缺血再灌注組同側(cè)睪丸的曲細精管直徑和Johnsen評分明顯降低（P＜0.05）；治療組同側(cè)睪丸的上述指標顯著高于缺血再灌注組同側(cè)睪丸（P＜0.05）；三組對側(cè)睪丸曲細精管直徑和Johnsen評分比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3和圖2（插頁）。

4 討論

睪丸缺血時，由于鈣離子內(nèi)流引起細胞內(nèi)鈣濃度升高，導致黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶。此外，缺血時ATP降解為次黃嘌呤。再灌注時，大量氧隨血液進入缺血組織，黃嘌呤氧化酶將次黃嘌呤和氧轉(zhuǎn)化為超氧陰離子、過氧化氫等活性氧。活性氧半衰期短，很難直接定量。丙二醛是活性氧引起細胞膜脂質(zhì)過氧化的穩(wěn)定末端產(chǎn)物，通常作為活性氧的間接指標[1]。本研究顯示，與對照組比較，缺血再灌注組缺血再灌注損傷睪丸的黃嘌呤氧化酶活性和丙二醛水平明顯升高（P＜0.05），這表明睪丸缺血再灌注后，黃嘌呤氧化酶活性顯著升高，引起活性氧大量產(chǎn)生?；钚匝跬ㄟ^氧化細胞膜脂質(zhì)、蛋白和DNA等途徑導致組織損傷[2]。本研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注組同側(cè)睪丸丙二醛水平明顯升高，睪丸生精功能顯著下降（P＜0.05），提示活性氧的大量產(chǎn)生嚴重損傷睪丸生精功能。

表3 三組大鼠睪丸曲細精管直徑和Johnsen評分比較（±s）

表3 三組大鼠睪丸曲細精管直徑和Johnsen評分比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與同組對側(cè)睪丸比較，△P＜0.05；與缺血再灌注組同側(cè)睪丸比較，▲P＜0.05

組別對照組缺血再灌注組治療組n/只10 10 10曲細精管直徑/μm Johnsen評分/分同側(cè)睪丸255.06±16.25 190.82±20.36*△229.17±24.20▲△對側(cè)睪丸251.67±13.28 253.96±13.73 254.31±15.04同側(cè)睪丸9.28±0.49 3.64±0.89*△7.86±0.94▲△對側(cè)睪丸9.35±0.51 9.30±0.57 9.42±0.53

姜黃素是從植物姜黃的根莖中提取的主要成份，具有抗氧化、抗炎等功效[3-4]。已有研究報道，姜黃素能降低活性氧含量，減輕心、肺、腎的缺血再灌注損傷[3]。本研究顯示，姜黃素治療顯著降低缺血再灌注損傷睪丸黃嘌呤氧化酶活性和丙二醛水平，提高睪丸生精功能，表明姜黃素可通過抑制黃嘌呤氧化酶活性減少活性氧產(chǎn)生，從而保護睪丸生精功能。姜黃素已應用于臨床治療骨關節(jié)炎，取得良好效果，未發(fā)現(xiàn)嚴重的副作用[4]。因此，臨床上可將姜黃素用于睪丸扭轉(zhuǎn)復位后治療。

血紅素加氧酶-1能將血紅素降解為鐵、一氧化碳和膽綠素，后者能被膽綠素還原酶轉(zhuǎn)化為膽紅素。膽綠素和膽紅素都擁有抗氧化的特性。研究表明，姜黃素能誘導腎上皮細胞、血管平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞的血紅素加氧酶-1表達上調(diào)，減輕活性氧引起的損傷[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠缺血再灌注損傷睪丸丙二醛水平和血紅素加氧酶-1蛋白表達水平明顯增高（P＜0.05），提示睪丸缺血再灌注后，活性氧的大量產(chǎn)生誘導血紅素加氧酶-1表達上調(diào)。與缺血再灌注組同側(cè)睪丸比較，姜黃素干預后血紅素加氧酶-1蛋白表達水平顯著提高，丙二醛水平降低，提高睪丸生精功能。表明姜黃素通過誘導血紅素加氧酶-1表達上調(diào)，降低活性氧水平，從而保護睪丸生精功能。因此，誘導血紅素加氧酶-1表達上調(diào)可能是姜黃素減輕睪丸缺血再灌注損傷重要機制之一。

單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復位是否會引起對側(cè)睪丸損傷，目前仍有爭議。有學者認為，單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復位通過免疫等機制引起對側(cè)睪丸損傷[6]，也有學者持否定態(tài)度[7]。本研究中，單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復位引起同側(cè)睪丸丙二醛水平、黃嘌呤氧化酶活性、血紅素加氧酶-1表達水平和睪丸生精功能發(fā)生顯著改變，然而對側(cè)睪丸未見任何改變。因此，我們認為單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復位不會導致對側(cè)睪丸損傷。

本研究結(jié)果證實，姜黃素通過抑制黃嘌呤氧化酶活性，提高血紅素加氧酶-1蛋白表達水平，降低活性氧含量，從而減輕睪丸缺血再灌注損傷。

［1］Bilommi R，Nawas BA，Kusmayadi DD，et al.The effects of glutathione on malondialdehyde expression and seminiferous tubule damage in experimental testicular torsion-detorsion in Wistar rats［J］.J Pediatr Urol，2013，9（6 Pt B）：1059-1063.

［2］Ozturk H，Ozturk H，Terzi EH，et al.Interleukin 10 reduces testicular damage in experimental testicular ischemia/reperfusion injury［J］.Urology，2014，83（2）：508.e1-6.

［3］Aydin MS，Caliskan A，Kocarslan A，et al.Intraperitoneal curcumin decreased lung,renal and heart injury in abdominal aorta ischemia/reperfusion model in rat［J］.Int J Surg，2014，12（6）：601-605.

［4］Henrotin Y，Gharbi M，Dierckxsens Y，et al.Decrease of a specific biomarker of collagen degradation in osteoarthritis，Coll2-1，by treatment with highly bioavailable curcumin during an exploratory clinical trial［J］.BMC Complement Altern Med，2014，14（1）：159.

［5］Son Y，Lee JH，Chung HT，et al.Therapeutic roles of heme oxygenase-1 in metabolic diseases：curcumin and resveratrol analogues as possible inducers of heme oxygenase-1［J］.Oxid Med Cell Longev，2013，2013：639541.

［6］Minutoli L，Antonuccio P，Squadrito F，et al.Effects of polydeoxyribonucleotide on the histological damage and the altered spermatogenesis induced by testicular ischaemia and reperfusion in rats［J］.Int J Androl，2012，35（2）：133-144.

［7］Cayan S，Saylam B，Tiftik N，et al.Rho-kinase levels in testicular ischemia-reperfusion injury and effects of its inhibitor，Y-27632，on oxidative stress，spermatogenesis，and apoptosis［J］.Urology，2014，83（3）：675.e13-18.

Effect of Curcumin on Testicular Ischemia-Reperfusion Injury of Rats

HUANG Rong,WANG Qing,WEISiming,PAN Hangli.Department of Clinical Medicine,Zhejiang Medical College,Hangzhou(310053),China

Objective To investigate the effect of curcumin on testicular ischemia-reperfusion injury（IRI）of rats.Methods Sixty adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups:control group,IRI group,and IRI+curcumin group of 20 rats in each group.Rats in control group underwent a sham operation on left testis.In IRI group,left testis was rotated 720°for 2h.Rats in IRI+curcumin group received the same surgical procedure as IRI group and intravenous administration of curcumin（200mg/kg）at testicular detorsion.Orchiectomy was performed on half of rats in each group at 4h after detorsion for measurement of the activity of xanthine oxidase, the level of malondialdehyde and heme oxygenase-1 protein.Orchiectomy was performed on the half of rats in each group at 3 months after detorsion to analyze testicular spermatogenesis.Results Unilateral testicular torsiondetorsion caused significant increase in xanthine oxidase activity,malondialdehyde level,and heme oxygenase-1 protein expression level,and significant decrease in testicular spermatogenesis in ipsilateral testes（all P＜0.05）.Rats treated with curcumin had significant decrease in xanthine oxidase activity and malondialdehyde level and significant increase in heme oxygenase-1 protein expression level and testicular spermatogenesis in ipsilateral testes（all P＜0.05）.Conclusion Curcumin protects testicular spermatogenesis by inhibiting xanthine oxidase activity and elevating heme oxygenase-1 protein expression level to reduce overgeneration of reactive oxygen species.

rats；testicular torsion-detorsion；ischemia-reperfusion injury；curcumin

2014-07-11

修回日期：2014-07-28

韋思明，Tel：15268133671；E-mail：wsm1971@hotmail.com