升陽益胃湯對腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠血鈣基因相關(guān)肽及5-羥色胺的影響

曾耀明 鄭偉偉 余維微 陳余圣 林上助 浙江中醫(yī)藥大學附屬溫州中醫(yī)院消化科 溫州 325000

升陽益胃湯對腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠血鈣基因相關(guān)肽及5-羥色胺的影響

曾耀明 鄭偉偉 余維微 陳余圣 林上助 浙江中醫(yī)藥大學附屬溫州中醫(yī)院消化科 溫州 325000

目的 觀察升陽益胃湯對腹瀉型腸易激綜合征（IBS）大鼠血漿鈣基因相關(guān)肽（CGRP）、血清5-羥色胺（5-HT）的影響。方法 取清潔級健康雄性SD大鼠60只，其中10只為空白對照組，60只采用束縛應(yīng)激+夾尾刺激法誘導(dǎo)腹瀉型IBS大鼠模型，造模成功后隨機分為模型對照組、得舒特組及升陽益胃湯低、中、高劑量組，各10只，觀察大鼠稀便率，放免法檢測大鼠血漿CGRP、血清5-HT含量。結(jié)果 升陽益胃湯治療后，大鼠稀便率下降，與模型組、得舒特組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；模型組大鼠血清5-HT水平明顯高于空白組，血漿CGRP水平則稍低于空白組（P＜0.05）；治療后得舒特組、升陽益胃湯各劑量組血清5-HT均較模型組明顯下降（P＜0.05），而各組之間血漿CGRP水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論 升陽益胃湯能明顯減輕腹瀉型IBS模型大鼠腹瀉癥狀，減少腹瀉型IBS模型大鼠血清5-HT的合成和分泌，但對血CGRP無明顯影響。

大鼠；腸易激綜合征；升陽益胃湯；鈣基因相關(guān)肽；5-羥色胺

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一類常見的功能性胃腸病，以慢性反復(fù)發(fā)作的腹痛、腹部不適伴有排便習慣改變?yōu)樘卣?。西藥治療效果不甚理想，我們近年發(fā)現(xiàn)升陽益胃湯對腹瀉型IBS患者效果顯著，但作用機制不明，故本研究擬觀察升陽益胃湯對腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠的治療作用，并探討其作用機制?，F(xiàn)報道如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 10周齡健康清潔級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量（300±20g）。許可證號：SCXK（浙）2010-0150，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供。所有動物在有恒定溫度、濕度及晝夜光線的房間飼養(yǎng)，自由進食、進水。適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后進行實驗。飼養(yǎng)期間每日8:00～16:00時給予恒定燈光照明。

1.2 藥品及試劑 升陽益胃湯由黃芪、半夏、人參、甘草、獨活、防風、白芍等14味藥物組成，購買于溫州市中醫(yī)院中藥房，并由我院制劑室制備。得舒特片（化學成分匹維溴銨，法國蘇威制藥廠生產(chǎn)，規(guī)格：50mg/片，注冊證號H20040759）。大鼠5-HT放免試劑盒（北京解放軍總醫(yī)院東北免疫技術(shù)研究所）；大鼠CGRP放免試劑盒（北京解放軍總醫(yī)院東北免疫技術(shù)研究所）。

1.3 主要器材 MJ-182型放射免疫γ計數(shù)器（上海原子核研究所日環(huán)儀器廠生產(chǎn)）；Allegra25R型臺式高速冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特出品）；BX51型反射熒光顯微鏡（OLYMPUS）。

2 實驗方法

2.1 動物分組 60只SD大鼠隨機分為空白對照組10只和造模組50只，待造模成功后再隨機分為模型組、得舒特組和升陽益胃湯低、中、高劑量組，每組10只。

2.2 模型制作 參照文獻[1]方法，以束縛應(yīng)激+夾尾刺激法誘導(dǎo)腹瀉型IBS大鼠模型。具體操作步驟如下：造模組大鼠每10只同籠，用紗布條束縛其后肢，使大鼠活動受到一定程度限制，并用裹有海綿的夾子夾大鼠尾巴近端1/3處，注意不損傷皮膚，使其激怒，尋釁與其它大鼠撕打，從而激怒全籠打斗，觀察大鼠激怒應(yīng)激反應(yīng)，刺激時間持續(xù)30min，每次都增加5min?？瞻讓φ战M不予處理，常規(guī)飼養(yǎng)。造模時間共14天。

2.3 給藥方法 造模成功后第2天起，各組大鼠分別灌胃給藥，實驗劑量按照試驗動物研究“等效劑量”的計算方法[2]。各組大鼠分別灌2mL溶液:其中升陽益胃湯高、中、低劑量組分別含生藥量為3、1.5、0.75g/mL；得舒特組用蒸餾水配制成40mg/mL混懸液，給藥體積為20mL/（kg·d）；空白對照組和模型對照組灌服生理鹽水作為安慰對照。每天1次，各組連續(xù)給藥14天。

2.4 觀察指標

2.4.1 大鼠稀便率 各用藥組和模型組治療后每天記錄大鼠的稀便次數(shù)及總大便數(shù)。干便與稀便的區(qū)分以濾紙上有無污跡為標準，總和稀便率=總和稀便次數(shù)/總和大便次數(shù)，實驗結(jié)束統(tǒng)計分析各組大鼠的總和稀便率。

2.4.2 血清5-HT含量、血漿CGRP含量測定 大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后，于頸總動脈取血放射免疫法分別測定血清5-HT含量、血漿CGRP含量，嚴格按照試劑盒操作步驟進行。

2.4.3 小腸病理組織學檢查 用頸椎脫位斷髓法分別處死大鼠后，沿腹部正中切開，分離小腸組織，用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，蠟塊以4μm厚連續(xù)切片，常規(guī)伊紅染色。

2.5 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用（±s） 表示，采用單因素方差分析，首先進行方差齊性檢驗，當方差齊性時用Bonferroni法進行比較，當方差不齊時用Tamhane’s T2法。

3 實驗結(jié)果

3.1 一般情況觀察 造模組大鼠第7天開始逐漸出現(xiàn)神疲乏力，活動減少，四肢無力，背毛逐漸失去光澤，喜臥嗜睡,腹瀉等癥狀。于造模第14天大鼠出現(xiàn)雙目無視，外觀干癟瘦小，被毛枯槁，豎毛拱背，乏力懶動，大便稀溏等表現(xiàn)，證明造模成功?？瞻讓φ战M大鼠眼睛有神，活動快速，形體飽滿，被毛濃密而有光澤，飲食、飲水適中，大小便正常。得舒特組大鼠于治療后第5天起大鼠腹瀉癥狀減輕，大便數(shù)量減少、質(zhì)變硬，乏力懶動表現(xiàn)未見明顯改善。升陽益胃湯低、中、高劑量組大鼠于治療后第7天起，一般情況逐漸好轉(zhuǎn)，進食量增加，活躍情況增強，毛色漸光澤，腹瀉癥狀減輕，大便數(shù)量減少、質(zhì)變硬，其中大劑量組較小劑量組改善明顯。

3.2 各組大鼠稀便率比較 與空白組比較，模型組大鼠稀便率明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，得舒特組、升陽益胃湯低、中、高劑量組稀便率均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），升陽益胃湯中、高劑量組稀便率顯著低于得舒特組（P＜0.05），低劑量組稀便率雖低于得舒特組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；升陽益胃湯各劑量組比較，高劑量組優(yōu)于中、低劑量組（P均＜0.05）。見表1。

3.3 各組大鼠血清5-HT、血漿CGRP水平比較 與空白組比較，模型組、得舒特組、升陽益胃湯低劑量組血清5-HT水平均顯著增高（P均＜0.05）；與模型組比較，得舒特組、升陽益胃湯低、中、高劑量組血清5-HT水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；與得舒特組比較，升陽益胃湯中、高劑量組5-HT水平顯著降低（P均＜0.05）；升陽益胃湯高劑量組5-HT明顯低于中、低劑量組（P＜0.05）。見表2。

表1 各組大鼠稀便率比較（±s）

表1 各組大鼠稀便率比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與得舒特組比較，▲P＜0.05；與升陽益胃湯中、低劑量組比較，★P＜0.05

組別n/只 稀便率/%空白組模型組得舒特組升陽益胃湯低劑量組升陽益胃湯中劑量組升陽益胃湯高劑量組10 10 10 10 10 10 14.34±3.36 23.48±6.32* 16.30±5.58△14.76±3.32△11.91±2.54△▲8.50±4.46△△▲★

模型組CGRP水平顯著低于空白組（P＜0.05），各實驗組CGRP水平顯著高于模型組（P均＜0.05）；各實驗組間CGRP水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組大鼠血清5-HT、血漿CGRP水平比較（±s） ng/L

表2 各組大鼠血清5-HT、血漿CGRP水平比較（±s） ng/L

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與得舒特組比較，▲P＜0.05；與升陽益胃湯中、低劑量組比較，★P＜0.05

組別空白組模型組得舒特組升陽益胃湯低劑量組升陽益胃湯中劑量組升陽益胃湯高劑量組n/只10 10 10 10 10 10 5-HT 137.34±17.96 203.71±34.62* 165.30±17.58*△160.88±14.59*△145.36±13.57△▲128.50±15.46△△▲★CGRP 42.06±1.65 38.36±2.22* 44.10±1.44△43.20±3.19△43.51±2.87△42.29±3.08△

3.4 各組大鼠小腸病理組織學檢查 各組大鼠小腸未見明顯組織損傷，組織切片普通HE染色均有輕度的中性粒細胞浸潤，間質(zhì)無明顯水腫，屬于輕度，見圖1（封三）。

4 討論

國內(nèi)報道IBS患病率約為0.82%～5.67%[3]。IBS發(fā)病與胃腸道動力異常、內(nèi)臟高敏感性、腸道炎癥和免疫反應(yīng)、心理-社會因素等有關(guān)，其中內(nèi)臟高敏性增高是其特征性的主要病理生理基礎(chǔ)[4]。

5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）又稱為血清素，來源于色氨酸的代謝，人體大約95%的5-HT來源于腸道，其中90%的5-HT儲存于腸嗜鉻細胞（enterochromaffincell，EC）中，10%存在于腸神經(jīng)系統(tǒng)，其能激動胃腸道平滑肌5-HT2受體或腸壁內(nèi)神經(jīng)節(jié)細胞5-HT4受體均可以引起胃腸道平滑肌收縮，使胃腸道張力增加，腸蠕動加快。近年研究發(fā)現(xiàn)5-羥色胺系統(tǒng)改變與IBS患者腹痛、腹瀉和內(nèi)臟感覺異常等癥狀密切相關(guān)[4]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，造模成功后模型組血清5-HT水平顯著升高（P＜0.05）。而模型大鼠經(jīng)藥物治療后，升陽益胃湯組及得舒特組血清5-HT水平降低（P＜0.05），說明通過應(yīng)用升陽益胃湯可能通過調(diào)控腸道5-HT的合成和分泌，而改善大鼠的腹瀉癥狀，而升陽益胃湯各組又較得舒特組有更優(yōu)的治療效果，血清5-HT下降也更為明顯。

鈣基因相關(guān)肽（calction generelated peptide，CGRP）是一種腦腸肽，廣泛分布于外周、中樞及腸神經(jīng)系統(tǒng)，在心血管、神經(jīng)、運動及消化系統(tǒng)中都起著重要作用。研究顯示，CGRP在胃腸道不僅介導(dǎo)痛覺產(chǎn)生和痛覺過敏，而且也能調(diào)節(jié)胃腸運動功能[5]。本研究結(jié)果表明，與空白組比較，模型組血漿CGRP水平顯著降低（P＜0.05），而其余各組所測得結(jié)果并無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），提示在以后的IBS治療研究中血中CGRP水平可能不適合用作判斷療效的指標。

中醫(yī)無“腸易激綜合征”病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)與特征，屬于中醫(yī)“腸郁”、“泄瀉”、“便秘”、“腹痛”等范疇。該病發(fā)病機錯綜復(fù)雜，中醫(yī)認為多為情志失調(diào)、肝郁虛，或飲食所傷，脾胃虛弱。升陽益胃湯出自金·李東垣的《脾胃論》，由黃芪、半夏、人參、甘草、獨活、防風、白芍等14味藥物組成，有益氣升陽、清熱除濕之功，適用于脾胃虛弱而濕邪不化，陽氣不升之證，癥見倦怠嗜臥，四肢無力，食不知味，泄瀉等癥。本研究發(fā)現(xiàn)，升陽益胃湯各劑量組均能有效降低腹瀉型IBS大鼠血液中的5-HT含量，且能有效緩解腹瀉癥狀，改善大鼠的生存狀態(tài)，且優(yōu)于西藥得舒特組，但對血中CGRP的含量未見明顯影響。升陽益胃湯對IBS的治療機制可能與調(diào)控腸道5-HT合成和分泌有關(guān)，其療效與用藥劑量相關(guān)。

［1］Williams CL，Villar RG，Peterson JM，et al.Stress-induced changes in intestina1 transit in the rat：a mode1 for irritable bowe1 syndrome［J］.Gastroenterology，1988，94（3）：611-21.

［2］趙偉，孫國志.不同種實驗動物間用藥量換算［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2010，（5）：52-53.

［3］何宛蓉.腸易激綜合征流行病學研究現(xiàn)狀與進展［J］.胃腸病學與肝病學雜志，2012，21（1）：83-88.

［4］周應(yīng)初，周鶴俊，劉斌.5-HT在腸易激綜合征發(fā)病機制中的研究現(xiàn)狀［J］.胃腸病學，2011，16（7）：445-448.

［5］陳羽，羅和生，梁成柏，等.腸易激綜合征血清中降鈣素基因相關(guān)肽的變化［J］.胃腸病學和肝病學雜志，2011，20（7）：653-655.

Effect of Shengyang Yiwei Decoction on Serum CGRP and 5-hydroxytryptamine in Rats with Irritable BowelSyndrome

ZENG Yaoming,ZHENG Weiwei,YU Weiwei,CHEN Yusheng,LIN Shangzhu.Department of Gastroenterology,Wenzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine,Wenzhou(325000),China

Objective To investigate the effect of Shengyang Yiwei decoction on serum CGRP and 5-hydroxytryptamine（5-HT）in rats with irritable bowel syndrome（IBS）.Methods Sixty SPF SD rats were randomly divided into normal control group,model group,dicetel group,Shengyang Yiwei decoction group（low,moderate,and high dose）with 10 rats in each group.Except for normal control group,the model of IBS was made by binding stress and clasping rats tails in other groups.Changes of diarrhea rate were observed.Radioimmunoassay was used to detect the level of CGRP and 5-HT in plasma.Results The diarrhea rates in Shengyang Yiwei decoction groups were decreased after treatment as compared with that in model group and dicetel group（P＜0.05,P＜0.01）.The content of 5-HT in plasma in model group was higher than that in normal control group,while the level of CGRP in model group was lower than that in normal control group（P＜0.05）.After treatment,the contents of 5-HT in plasma in dicetel group and Shengyang Yiwei decoction group were decreased than those in model group（P＜0.05）,while the levels of CGRP had no statistical significance among all groups（P＞0.05）.Conclusion Shengyang Yiwei decoction can alleviate the symptom of diarrhea,inhibit 5-HT synthesis and secretion,but does not affect the level of CGRP in rats with IBS.

rats；irritable bowel syndrome；Shengyang Yiwei decoction；CGRP；5-hydroxytryptamine

2014-03-20

修回日期：2014-06-04

浙江省溫州市醫(yī)藥衛(wèi)生科研項目（No.2011A014）

曾耀明，Tel：13867704929，0577-88223631；E-mail：sunnyzeng2012@hotmail.com