過表達(dá)Akt1細(xì)胞株的構(gòu)建及鑒定

潘姝花，鄭婷婷，鄭旭升，吳登偉，陳培遠(yuǎn)，許傳蓮

（浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州310018）

過表達(dá)Akt1細(xì)胞株的構(gòu)建及鑒定

潘姝花，鄭婷婷，鄭旭升，吳登偉，陳培遠(yuǎn)，許傳蓮

（浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州310018）

Akt1是細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵信號分子，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、生長、遷移、侵襲，以及抑制細(xì)胞凋亡，抵抗化療和放療等重要作用。文章通過構(gòu)建pLJM1-Akt1重組質(zhì)粒，利用慢病毒侵染的方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至K562、Bel-7404細(xì)胞，用嘌呤霉素篩選得到Akt1穩(wěn)定過表達(dá)的Bel-7404/Akt1、K562/Akt1細(xì)胞株，通過Western bloting分析細(xì)胞株中Akt1的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：Bel-7404/Akt1與K562/Akt1細(xì)胞中Akt1表達(dá)量明顯高于野生型Bel-7404細(xì)胞與K562細(xì)胞，成功構(gòu)建過表達(dá)Akt1的K562/Akt1、Bel-7404/Akt1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。Akt1過表達(dá)細(xì)胞株的成功構(gòu)建為尋找和篩選高效、低毒、強(qiáng)特異性的Akt1抑制劑以及逆轉(zhuǎn)細(xì)胞多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）的研究提供了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

Akt1；重組質(zhì)粒；病毒侵染

0 引 言

Akt是一種處于PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（又稱Akt或PKB通路）核心部位的絲氨酸/蘇氨酸激酶，存在由不同的基因編碼的Aktl/PKBα、Akt2/ PKBβ、Akt3/PKBγ3種亞型，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、生長、抑制細(xì)胞凋亡等作用。另外，Akt在促進(jìn)細(xì)胞遷移、侵襲，以及促進(jìn)血管生成，抵抗化療和放療等方面也起著重要作用［1-2］。Akt是存在于人類染色體中的鼠類胸腺瘤病毒（t-8 strain from AKR/J mouse，Akt8）致癌基因的同源物，已被定義為癌基因［3-4］，在多種腫瘤中均存在異常表達(dá)和活化現(xiàn)象，如卵巢癌、胃癌、乳腺癌等［5-7］。目前，國內(nèi)外關(guān)于PI3K/Akt信號通路與藥物耐藥性關(guān)系的研究越來越多，并且該通路被認(rèn)為是化療耐藥治療的新靶點(diǎn)［2］。許多研究表明化療藥物可增加Akt活化水平，使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生藥物化療耐受，深入研究Akt作用機(jī)制，可為腫瘤基因治療、抗腫瘤藥物開發(fā)提供新靶點(diǎn)［8-9］。

本研究選用p LJM1慢病毒載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒p LJM1-Akt1，并運(yùn)用病毒侵染的方法篩選得到Akt1穩(wěn)定高表達(dá)K562與Bel-7404細(xì)胞株。本研究旨在運(yùn)用慢病毒載體的優(yōu)勢構(gòu)建Akt1高表達(dá)細(xì)胞株，為尋找和篩選高效、低毒、強(qiáng)特異性的Akt1抑制劑以及MDR的研究提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并為后續(xù)深入研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

DNA限制性內(nèi)切酶Age I和Eco R I購自Takara公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TOYOBO公司；Akt1抗體購自Cell Signaling公司；Akt1引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。慢病毒載體p LJM1、包裝載體（psPAX2、pMD2.G）和大腸桿菌菌株Stbl 3由浙江理工大學(xué)新元醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)研究所保存。

1.2 細(xì)胞株

人腎上皮細(xì)胞293T、人肝癌細(xì)胞Bel-7404、人慢性髓性白血病細(xì)胞K562均為浙江理工大學(xué)新元醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所保存。

1.3 重組載體構(gòu)建

提取Bel-7404細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cD-NA模板，以Akt1上游引物（Former primer，F(xiàn)P）：5′-CGCACCGGTATGAGCGACGTGGCTATTGTGAA-3′；下游引物（Reverse primer，RP）：5′-CCGGAATTCTCAGGCCGTGCCGCTGG-3′擴(kuò)增Akt1片段。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；98℃變性10 s，60℃退火30 s，68℃延伸1 min，反應(yīng)為30個(gè)循環(huán)；繼續(xù)68℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收。Akt1目的片段和p LJM1載體均用限制性內(nèi)切酶Age I和Eco R I在37℃同時(shí)酶切2.5 h。將酶切回收的Akt1基因產(chǎn)物與載體p LJM1片段用T4連接酶進(jìn)行連接，置于16℃水浴中連接過夜，得到重組質(zhì)粒p LJM1-Akt1，并經(jīng)質(zhì)粒PCR、雙酶切及測序鑒定。

1.4 慢病毒包裝

取7.5×105/dish 293T細(xì)胞接種至直徑10 cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)50%左右，換成6 mL無血清MFM培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h；取10μg p LJM1-Akt1（或p LJM1），3.5μg p MD2.G，5.5μg psPAX2至400μL無血清MFM培養(yǎng)基中；取另一FP管中加入20μL Transfers至400μL無血清MFM培養(yǎng)基中，室溫孵育5 min。混合兩FP管培養(yǎng)基輕輕吹打混合均勻，室溫孵育20 min，逐滴加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中。細(xì)胞于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后換成10%血清的DMFM培養(yǎng)基培養(yǎng)；培養(yǎng)24 h后，觀察293T細(xì)胞，約有30%左右的細(xì)胞死亡，此時(shí)收集培養(yǎng)基（已經(jīng)有慢病毒產(chǎn)生）。繼續(xù)加入6 mL 10%血清的DMFM培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h后再收獲一次病毒。將兩次收獲的病毒液合并，可用孔徑為0.45μm的針頭濾器過濾去除293T細(xì)胞，取濾液感染K562、Bel-7404細(xì)胞。

1.5 病毒包裝成功與否鑒定

收集轉(zhuǎn)染48 h后的293T細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液收集蛋白，通過Western blot檢測是否成功包裝p LJM1-Akt1慢病毒。

1.6 慢病毒感染及穩(wěn)定株的篩選

K562細(xì)胞、Bel-7404細(xì)胞在感染前2 h分別換新鮮的含10%FBS的RPMI-1640、DMFM培養(yǎng)基6 mL，滴加4 mL病毒液感染細(xì)胞；并于12 h后第二次感染細(xì)胞。24 h后換含5%FBS的RPMI-1640和DMFM培養(yǎng)，感染兩天后用0.6μg/mL的嘌呤霉素（puromycin）進(jìn)行篩選。以未感染的K562細(xì)胞、Bel-7404細(xì)胞作為對照，每隔兩天換一次選擇性培養(yǎng)基，最優(yōu)濃度為在3～5 d內(nèi)殺死所有對照組細(xì)胞的濃度。細(xì)胞傳代后繼續(xù)用0.6μg/mL的puromycin進(jìn)行篩選。

1.7 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株驗(yàn)證

細(xì)胞篩選5～6次后，收集K562細(xì)胞、Bel-7404細(xì)胞及其未感染對照K562細(xì)胞、Bel-7404細(xì)胞，進(jìn)行Western blot檢測目的蛋白Akt1的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的產(chǎn)物擴(kuò)增

提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。Akt1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物如圖1，片段大小在1 400 bp左右，與目的片段Akt1相符。

圖1 目的片段Akt1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 重組質(zhì)粒p LJM1-Akt1的PCR鑒定

目的片段Akt1和載體pLJM1雙酶切后，經(jīng)T4連接酶連接后，在無抗性的LB液體培養(yǎng)基中活化后，涂布至含有Amp抗性的LB固體培養(yǎng)基平板上，經(jīng)12 h左右挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒做質(zhì)粒PCR鑒定，圖2的鑒定結(jié)果顯示，存在陽性克隆且片段大小在1400 bp左右，與預(yù)期目的片段Akt1相符。

圖2 重組質(zhì)粒p LJM1-Akt1的PCR鑒定

2.3 重組質(zhì)粒p LJM1-Akt1的酶切鑒定結(jié)果

重組p LJM1-Akt1質(zhì)粒提取后，進(jìn)行單/雙酶切鑒定，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒經(jīng)Eco R I酶切后得到單一條帶，經(jīng)Age I和Eco R I雙酶切后得到兩條條帶，且與目的片段Akt1大小（1 443 bp左右）以及p LJM1質(zhì)粒大?。? 083 bp）相符，具體結(jié)果見圖3。

圖3 重組質(zhì)粒pLJM1-Akt1的單雙酶切鑒定圖

2.4 測序鑒定結(jié)果

測序結(jié)果顯示，構(gòu)建的重組質(zhì)粒目的片段Akt1的堿基序列正確。

2.5 p LJM1-Akt1與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

載體p LJM1帶有FGFP熒光蛋白的標(biāo)簽，能產(chǎn)生綠色熒光蛋白，在熒光顯微鏡下能看到大量綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率達(dá)50%以上，結(jié)果見圖4所示。

圖4 pLJM1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T的熒光顯微鏡觀察（100×）

2.6 包裝的慢病毒W(wǎng)estern blot檢測

收集轉(zhuǎn)染48 h后的293T細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液收集蛋白，通過Western blot檢測是否包裝成功p LJM1-Akt1慢病毒。結(jié)果如圖5所示，293T/Akt1細(xì)胞株中Akt1表達(dá)量明顯高于野生型293T/WT細(xì)胞，說明p LJM1-Akt1慢病毒包裝成功。

圖5 293T/Akt1和293T/WT細(xì)胞中的Akt1表達(dá)量

2.7 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的驗(yàn)證

經(jīng)篩選得到穩(wěn)定的Bel-7404/Akt1、K562/Akt1細(xì)胞株后，收取Bel-7404/Akt1、Bel-7404細(xì)胞、K562/Akt1細(xì)胞和K562細(xì)胞，進(jìn)行Western blot檢測目的蛋白Akt1的表達(dá)，結(jié)果見圖6。圖6可見，Bel-7404/Akt1細(xì)胞株中Akt1表達(dá)量明顯高于野生型Bel-7404細(xì)胞，K562/Akt1細(xì)胞株中Akt1表達(dá)量明顯高于野生型K562細(xì)胞。

圖6 Bel-7404/Akt1、Bel-7404/WT和K562/Akt1、K562/WT細(xì)胞中的Akt1表達(dá)量

3 討 論

Akt激酶是PI3K/Akt通路中關(guān)鍵信號分子，在促進(jìn)細(xì)胞增殖、生長，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞遷移、侵襲，促進(jìn)血管生成，抵抗化療和放療等方面具有重要作用，在多種癌細(xì)胞中異常表達(dá)［1-2］。

有研究發(fā)現(xiàn)在胃癌AGS細(xì)胞中上調(diào)PI3K/ Akt的表達(dá)可導(dǎo)致P-gp相關(guān)及不相關(guān)藥物耐藥［10］。Simon等［11］報(bào)道抑制Akt的活力可以促進(jìn)多藥耐藥胃癌細(xì)胞凋亡、逆轉(zhuǎn)耐藥及增強(qiáng)胰腺癌耐藥株對吉西他濱的敏感性。Yuan等［12］發(fā)現(xiàn)過度活化的Akt可以通過抑制凋亡信號激酶（ASK）并且抑制ASK下游JNK和P38的活性，從而產(chǎn)生耐藥性。Jin等［13］發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞株MCF對紫杉醇、5-Fu以及阿霉素的耐藥與PI3K/Akt的活性升高有關(guān)，而抑制PI3K/Akt可以逆轉(zhuǎn)MCF7的耐藥性。這些結(jié)果均表明，Akt與腫瘤細(xì)胞耐藥密切相關(guān)。

Aktl是Akt家族成員之一，不但影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡，而且對許多腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移也有影響。磷酸化的Aktl可以促進(jìn)纖維肉瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、人類胰腺癌細(xì)胞等多種癌細(xì)胞的侵襲能力［14-16］。有研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Akt1異常表達(dá)，并且在癌細(xì)胞的遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用［17］。Aktl在喉癌組織中也異常表達(dá)，且與其病理分化程度和喉癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［18］。另有研究發(fā)現(xiàn)通過RNA干擾Aktl基因沉默具有抑制喉癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡等作用，因此，Aktl可作為喉癌基因治療的候選新靶點(diǎn)［19］。這些結(jié)果均表明，Aktl在不同的腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用。

深入研究PI3K/Akt通路在多藥耐藥中的具體機(jī)制可能為腫瘤治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。本研究用慢病毒感染的方法，篩選得到Akt1高表達(dá)細(xì)胞株Bel-7404/Akt1、K562/Akt1細(xì)胞，為尋找和篩選更加高效、低毒、強(qiáng)特異性的Akt1抑制劑和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥癌細(xì)胞凋亡的后續(xù)研究提供研究模型。

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EstabIishment and Identification of Over Expression of Akt1 CeII Strain

PAN Shu-hua，ZHENG Ting-ting，ZHENG Xu-sheng，WU Deng-wei，CHEN Pei-yuan，XU Chuan-Lian
（College of Life Science，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018，China）

Akt1 is a key signal molecule in cell signal transduction pathways，which promotes cell growth，proliferation，migration and invasion，inhibits cell apoptosis and resists chemotherapy and radiotherapy.This study establishes the p LJM1-Akt1 recombinant plasmids and transfects the recombinant plasmids into K562 and Bel-7404 cells with the method of virus infection.We obtained stable Bel-7404/ Akt1 and K562/Akt1 over expressed by Akt1 through puromycin screening.Akt1 expression in the cell strain was analyzed through Western bloting.The results show that the expression quantity of Akt1 in K562/Akt1 and Bel-7404/Akt1 cells is significantly more than that in wild K562 and Bel-7404 cells；stable and transfected cell strains of K562/Akt1 and Bel-7404/Akt1 of over expressed Akt1 are successfully established.The successful establishment of over expressed Akt1 cell strain provides experimental model for seeking and screening efficient，low-toxicity，strong-specificity Akt1 inhibitors and studying reverse multidrug resistance（MDR）.

Akt1；recombinant plasmid；virus infection

Q786

A

（責(zé)任編輯：許惠兒）

1673-3851（2014）04-0462-05

2013-12-04

潘姝花（1988-），女，浙江富陽人，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物方面的研究。

許傳蓮，F(xiàn)-mail：chuanlianxu@163.com