烏魯木齊大氣PM2.5對質(zhì)粒DNA的損傷研究

蘇都爾·克熱木拉,胡 穎,迪麗努爾·塔力甫*,邵龍義,買麗克扎提·買合木提 (.新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830046；.中國礦業(yè)大學(xué)資源與地球科學(xué)系煤炭資源與安全開采國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京00083)

PM2.5能夠通過呼吸等途徑進(jìn)入人體,并沉積在呼吸道甚至肺泡中.又因 PM2.5可以富集、攜帶多種致癌和有毒物質(zhì),如 PAHs、重金屬元素等,對人體健康的危害非常大[1].到目前為止,關(guān)于大氣顆粒物對人體健康的影響機(jī)制有許多假說,其中一種被廣泛接受的觀點(diǎn)是氧化性損傷假說,即顆粒物表面生物可利用的過渡金屬離子會(huì)產(chǎn)生自由基,這些自由基是顆粒物產(chǎn)生氧化性損傷的主要原因[2-3].有研究表明,氧化性損傷是形成組織和器官纖維化的重要原因[4]和導(dǎo)致由吸煙引起的肺病如慢性阻塞性肺病,特別是肺氣腫的原因一致[5].

質(zhì)粒DNA評價(jià)法是一種定量測量活性氧對質(zhì)粒DNA氧化性損傷能力的體外方法[6],其基本原理是顆粒物表面攜帶的自由基會(huì)對超螺旋DNA產(chǎn)生氧化性損傷,最初引起超螺旋DNA松弛,進(jìn)一步使 DNA線化.這種損傷引起不同形態(tài)DNA在電泳儀中的運(yùn)動(dòng)速度不同,使這些 DNA從瓊脂糖凝膠中分離開來.使用靈敏的顯像測密術(shù)測量線狀和松弛狀(被破壞)的DNA占總DNA的比例,可以定量評價(jià)顆粒物對質(zhì)粒 DNA造成的損傷.

目前用質(zhì)粒DNA對顆粒物毒理方面的研究主要集中在北京、哈爾濱、澳門、鄭州等城市[7-10],而對烏魯木齊大氣顆粒物研究還鮮見報(bào)道.烏魯木齊位于亞洲中心,南鄰塔克拉瑪干沙漠,北鄰古爾班通古特沙漠,市區(qū)三面被最高海拔高度為5000m 的天山圍繞,而北面的通道卻把準(zhǔn)葛爾盆地的固體顆粒帶入市區(qū);在長達(dá) 6個(gè)月的采暖期有 1/3的時(shí)間都被霧霾天氣所籠罩.在有關(guān)烏魯木齊 PM2.5的研究中,對其生物活性研究還鮮見報(bào)道.因此,研究利用質(zhì)粒 DNA評價(jià)法檢測烏魯木齊大氣PM2.5對質(zhì)粒造成破壞達(dá)到30%時(shí)所需要的顆粒物劑量(TD30),以揭示PM2.5對人體健康的影響,對認(rèn)識烏魯木齊大氣 PM2.5的活性氧對人體健康的影響具有重要的意義,同時(shí)也可為烏魯木齊大氣顆粒物控制工作提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

高壓滅菌的蒸餾水和 HPLC級水(Fisher,UK), X174-RF DNA(Promega,USA),溴酚藍(lán)/丙三醇染色劑和 TBE(Tris-Borate-EDTA)緩沖液(Sigma,USA),瓊脂糖(agarose),溴化乙錠(濃度為10mg/mL, AMRESCO,USA).

采樣儀器由日本產(chǎn) NL20型串級式大氣顆粒物采樣頭、轉(zhuǎn)子流量計(jì)、真空泵組成,采樣濾膜為聚碳酸酯膜 (直徑為:47mm;孔徑為:0.6mm).

1.2 采樣

采樣點(diǎn)設(shè)在位于烏魯木齊市的新疆大學(xué)(42°45′32″N～44°08′00″N,86°37′33″E～88°58′24″E)5號樓樓頂,空氣入口與地面距離約為 15m.采樣點(diǎn)距烏魯木齊市主干道勝利路 200m,距新疆大學(xué)鍋爐房 500m,后臨家屬院,左右鄰教學(xué)樓,前200m范圍為綠化地帶.采樣頭設(shè)定流量為20L/min,時(shí)間設(shè)定為 24h.采樣時(shí)間為 2012年 1月～12月,共采集樣品44個(gè).

濾膜放入恒溫恒濕箱中平衡 24h.用十萬分之一的精密電子天平(Sartorious CPA225D德國產(chǎn))稱重.采樣后的濾膜恒溫恒濕 48h,再次稱重.通過差減法(采樣后的濾膜質(zhì)量減去采樣前的濾膜質(zhì)量)計(jì)算出顆粒物的質(zhì)量濃度,具體采樣信息如表1所示.

表1 PM2.5樣品采集信息Table 1 Sample information of airborne PM2.5collected in Urumqi

1.3 質(zhì)粒DNA損傷評價(jià)實(shí)驗(yàn)

根據(jù)顆粒物的質(zhì)量加入適量的無菌水,將樣品配成濃度為1000μg/mL的溶液,震蕩20h左右,使樣品上的顆粒物從濾膜上脫落下來.震蕩結(jié)束,取出每個(gè)樣品中的溶液將其分為兩部分,一份(全樣)放入冰箱待用,另一份在 13000r/min下離心 80min,取出上清液作為水溶樣.全樣和水溶樣每個(gè)濃度等級的總體積為50μL,其中有1.8μL的DNA(按 2μL 算),7μL 的染色劑和 41μL(41μL 溶液體積=原始溶液體積+無菌水體積),每個(gè)樣品預(yù)設(shè)定 1000,800,600,400,200μg/mL 5個(gè)濃度等級,原始溶液體積的計(jì)算公式為 1000×X=等級濃度×41.各樣品準(zhǔn)備 6個(gè)微量離心管(5個(gè)濃度等級再加1個(gè)超純滅菌水樣)編好順序.離心管中首先加入1.8μL的X174-RF DNA(Promega,USA).再加入計(jì)算得到的原始溶液量.再加入計(jì)算得到無菌水.封口后在渦旋震蕩器上輕輕震蕩 6h.取出樣品再在離心機(jī)中離心30min后,在每一個(gè)離心管中加入 7μL的溴酚藍(lán)/丙三醇染色劑待用:將2.6g瓊脂糖和 42mLTBE 緩沖液加到500mL的錐形瓶中,再加超純滅菌水至 420mL,將錐形瓶放入微波爐加熱至溶液完全清澈后取出,等待溶液冷卻至 60℃左右時(shí),向錐形瓶中加入10μL溴化乙錠后將錐形瓶中的溶液緩慢倒入放有 2個(gè)梳子的凝膠淺槽,每個(gè)梳孔中注入20μL樣品、X174-RF DNA和染色劑三者的混合物,并在在電泳槽兩端的溶液中各加 20μL溴化乙錠.在40V電壓和30mA電流下通電16h后,使用紫外凝膠成像系統(tǒng)(英國Synoptics公司)對凝膠成像.再使用Syngene Genetools軟件(英國Synoptics公司)對凝膠中不同形態(tài)DNA的光密度進(jìn)行定量分析和統(tǒng)計(jì)(不同顆粒物劑量對DNA的損傷要減去H2O對質(zhì)粒DNA的損傷),根據(jù)不同濃度等級顆粒物造成的 DNA損傷量進(jìn)行線性回歸,得出造成 30%DNA損傷的顆粒物的濃度,即TD30值.TD30值越小,則該顆粒物對質(zhì)粒 DNA的氧化性損傷能力越強(qiáng),對人體健康影響越大.實(shí)驗(yàn)過程在中國礦業(yè)大學(xué)煤炭資源與安全開采國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(環(huán)境與健康實(shí)驗(yàn)室)完成.

2 結(jié)果與討論

2.1 PM2.5質(zhì)量濃度分析

由表 1可見采樣期間,烏魯木齊大氣 PM2.5的質(zhì)量濃度最大值為150.58μg/m3,出現(xiàn)在1月24日,最小值為 21.18μg/m3,出現(xiàn)在 5月 13日.1月24日是中國農(nóng)歷的大年初二,因?yàn)楸夼谌挤诺仍蛟斐僧?dāng)天的烏魯木齊大氣PM2.5的質(zhì)量濃度最大.在全年采集的樣品中 1/4樣品的質(zhì)量濃度高于或等于國家標(biāo)準(zhǔn)(75μg/m3).

就季節(jié)性分布而言(圖 1),冬季(12、1、2月份)PM2.5質(zhì)量濃的日平均值為 66.13μg/m3,春季(3、4、5月份)PM2.5質(zhì)量濃的日平均值為60.85μg/m3,夏季(6、7、8 月份)PM2.5質(zhì)量濃的日平均值為 45.91μg/m3,秋季(9、10、11月份)PM2.5質(zhì)量濃的日平均值為 60.64μg/m3.可以得出 PM2.5的質(zhì)量濃度冬季最高,其次是春季和秋季,夏季最低,春季和秋季的平均值差別不大.

圖1 烏魯木齊PM2.5的質(zhì)量濃度的季節(jié)性變化Fig.1 Seasonal variation of mass concentrations of PM2.5 in Urumqi

由于烏魯木齊霧霾天氣主要集中出現(xiàn)在冬季,使得大氣光照較弱、日照時(shí)間短、逆溫出現(xiàn)頻率增大、大氣對流不活躍等不利于空氣中污染物質(zhì)擴(kuò)散的因素較多,從而導(dǎo)致顆粒物濃度較高.而 6～8月是較典型的夏季季節(jié),溫暖、濕潤雨量充滯,雨水的沖刷及其他氣象因素使得大多時(shí)候空氣的質(zhì)量較好[11].

2.2 PM2.5對質(zhì)粒DNA的氧化性損傷

2.2.1 不同季節(jié) DNA 的氧化性損傷 烏魯木齊大氣不同季節(jié) PM2.5全樣和水溶部分的 TD30值如表2所示.

表2 烏魯木齊市PM2.5樣品的全樣和水溶部分的TD30值(μg/mL)Table 2 TD30 of whole sample and corresponding watersoluble fraction of PM2.5 collected from Urumqi in different seasons (μg/mL)

由表2可見,同一采樣點(diǎn)不同季節(jié)不僅TD30值差異較大,而且全樣和水溶部分對質(zhì)粒 DNA的氧化性損傷也有差異.全樣對質(zhì)粒 DNA的氧化性損傷出現(xiàn)冬季最大,春季和夏季次之,秋季最低的季節(jié)性變化特征.

冬季 PM2.5全樣和水溶部分樣的 TD30值的平均值分別為 440,474μg/mL,最低可以觀測到的值分別為35,43μg/mL;秋季全樣和水溶部分樣的平均值分別為535,600μg/mL;春季平均值分別為491,721μg/mL;夏季平均值分別為 503,666μg/mL.可以看出,烏魯木齊大氣 PM2.5無論是全樣還是水溶部分樣對質(zhì)粒DNA的氧化性損傷均具有冬季最大,秋季最低的季節(jié)性變化特征.

造成這種季節(jié)性差異的可能原因是冬季靜風(fēng)頻率高、逆溫層厚、污染物較長時(shí)間不易擴(kuò)散,再加上燃煤、汽車尾氣等排放的大量燃煤飛灰和煙塵集合體長時(shí)間漂浮在大氣中[12],吸附了大量的有毒有害物質(zhì),從而導(dǎo)致冬季 PM2.5對質(zhì)粒DNA的氧化性損傷較大.而烏魯木齊秋季氣候較干燥,風(fēng)速較大,不利于污染物的聚集和有毒有害物質(zhì)的吸附.

2.2.2 特殊氣象條件下的PM2.5對質(zhì)粒DNA的氧化性損傷 表2中的樣品5-26和6-13是在陣雨過后采集,因此,兩個(gè)樣品全樣和水溶部分樣的TD30值分別為 1620,247,1570,601μg/mL,即兩個(gè)樣品全樣的 TD30值在所有樣品中最大,對質(zhì)粒DNA 的氧化性損傷最小.另外,兩個(gè)樣品全樣的TD30值是水溶部分樣的6.6和2.6倍,可能是由于降水的作用加速了大氣中水溶性離子的形成使得吸附于顆粒相中的水溶性離子增多,而使得水溶部分樣的TD30值小.

2.2.3 PM2.5全樣和水溶部分對質(zhì)粒DNA的氧化性損傷差異分析 一般認(rèn)為,大氣 PM10的肺毒性來自水溶組分[7].而Imrich等[13]研究指出,濃縮的大氣顆粒物中的不可溶部分引起了肺泡巨噬細(xì)胞(AM)的生物反應(yīng).由圖 2可見,2012年全年采集樣品除以上兩個(gè)特殊樣品外,同一樣品的全樣和水溶樣TD30值相差較大,絕大部分樣品全樣的 TD30值均小于水溶部分樣的 TD30值,表示全樣的毒性大于相應(yīng)的水溶部分樣.

圖2 PM2.5樣品的全樣和水溶部分的TD30值Fig.2 TD30 of whole sample and corresponding water-soluble fraction of PM2.5

2.2.4 TD30值與氣象因素的相關(guān)性分析 為了探明氣相因素(大氣溫度、濕度、風(fēng)速)對 PM2.5氧化性損傷能力的影響,選用SPSS軟件對PM2.5樣品的全樣及水溶部分的TD30值與氣相因素之間進(jìn)行了相關(guān)性分析,其結(jié)果如表3所示.

由表3可以看出,全樣TD30值與平均溫度在0.05水平上顯著正相關(guān),即采樣時(shí)溫度越高全樣TD30值越大,全樣的氧化損傷能力越小;但全樣TD30值與平均風(fēng)速、相對濕度之間沒有相關(guān)關(guān)系;水溶樣TD30值與平均風(fēng)速和相對濕度之間的相關(guān)性概率P＜0.01,說明相關(guān)性非常顯著,而且水溶樣 TD30值與平均風(fēng)速正相關(guān),即風(fēng)速越大TD30值越大顆粒物的氧化性損傷能力就越小;水溶樣TD30值與相對濕度是負(fù)相關(guān),及相對濕度越大TD30值越小,濕度越大顆粒物的氧化性損傷能力就越大.水溶樣TD30值與平均溫度之間沒有相關(guān)關(guān)系.

2.3 TD30值與相應(yīng)質(zhì)量濃度的相關(guān)性分析

可吸入顆粒物的質(zhì)量濃度不僅是流行病學(xué)調(diào)查研究的基礎(chǔ),也是目前空氣質(zhì)量的主要標(biāo)準(zhǔn)之一.從圖 3可知,無論是全樣還是水溶樣的TD30與質(zhì)量濃度之間沒有明顯的相關(guān)趨勢.若顆粒物的質(zhì)量濃度對氧化損傷起決定作用,那么應(yīng)該 TD30值隨濃度的增大而減少,但結(jié)果并非完全如此.

對全樣來說,以樣品 1-24和 12-30為例,當(dāng)PM2.5的質(zhì)量濃度高達(dá) 150.58μg/m3時(shí),全樣的TD30值高達(dá) 450μg/mL,即該樣品氧化性損傷能力反而小;當(dāng) PM2.5的質(zhì)量濃度等于 48.51μg/m3時(shí),全樣的TD30值為35μg/mL,表現(xiàn)出較大的氧化性損傷能力.而對樣品 8-4來說,質(zhì)量濃度只有24.3μg/m3,但其全樣的 TD30值為 270μg/mL,樣品2-28、4-11、10-2、11-1、12-24等均出現(xiàn)相似的情況.

表3 PM2.5全樣和水溶樣TD30值與環(huán)境因素的相關(guān)性Table 3 Correlation between TD30 of whole sample and corresponding water-soluble fraction with corresponding environmental factors

圖3 PM2.5全樣和水溶樣TD30值與其質(zhì)量濃度之間的關(guān)系Fig.3 Correlation between TD30 of whole sample and corresponding water-soluble fraction with corresponding Massconcentrations

就水溶樣來說,以樣品4-22、7-7和1-24為例.當(dāng) PM2.5的質(zhì)量濃度等于 57.64μg/m3時(shí),水溶樣的TD30值為1758μg/mL,即該樣品的氧化性損傷能力很小;當(dāng)質(zhì)量濃度等于34.38μg/m3時(shí),水溶樣的TD30值為69μg/mL,表現(xiàn)出較大的氧化損傷能力.對樣品 1-24來說,其質(zhì)量濃度高達(dá)150.58μg/m3時(shí),水溶樣的 TD30值只等于480μg/mL,其損傷能力居中.但也有部分樣品出現(xiàn)質(zhì)量濃度和TD30值成正比或成反比的情況,如樣品1-4、1-11、1-21都是隨著質(zhì)量濃度的減少其 TD30值也減少,即氧化性損能力傷增大;而樣品 1-31、2-1、2-14隨著質(zhì)量濃度的增大TD30反而減少,即氧化性損傷能力增大.因此僅以顆粒物的質(zhì)量濃度來評價(jià)大氣顆粒物氧化性損傷能力大小的方法并不能真實(shí)地反映其對人體健康的危害程度,其決定作用的還是顆粒物的化學(xué)組成及其表面吸附的有害成分[14].

3 結(jié)論

3.1 采樣期間 PM2.5的質(zhì)量濃度最大值為150.58μg/m3,最小值為 21.18μg/m3.2012年烏魯木齊 PM2.5的質(zhì)量濃度冬季最高,其次是春季和秋季,夏季最低,春季和秋季PM2.5的質(zhì)量濃度差值不大.

3.2 PM2.5全樣對質(zhì)粒DNA的氧化性損傷冬季最大,春節(jié)和夏季次之,秋季最低;PM2.5水溶部分樣對質(zhì)粒DNA的氧化性損傷具有冬季最大、夏季次之、春節(jié)較低,秋季最低的季節(jié)性變化特征.絕大部分 PM2.5樣品全樣的的 TD30值小于水溶部分樣的TD30值.

3.3 在陣雨后采集的兩個(gè)樣品的全樣和水樣分別 D30值分別為 1620μg/mL 和 1570μg/mL,明顯大于相應(yīng)的水溶部分的 D30值 601μg/mL、247μg/mL.

3.4 全樣 TD30值與平均溫度在 0.05水平上顯著正相關(guān),即溫度越高全樣 TD30值越大,氧化損傷能力越小.水溶樣TD30值與平均風(fēng)速在0.01水平上顯著正相關(guān),與相對濕度顯著負(fù)相關(guān),說明風(fēng)速越大顆粒物的氧化性損傷能力就越小,濕度越大顆粒物的氧化性損傷能力就越大.

3.5 PM2.5的氧化性損傷能力與相應(yīng)的質(zhì)量濃度之間沒有明顯的相關(guān)性.

[1]呂森林,陳小慧,吳明紅,等.上海市PM2.5的物理化學(xué)特征及其生物活性研究 [J].中國環(huán)境科學(xué), 2007,28(3):472-477.

[2]肖正輝,邵龍義,張開寧,等.蘭州市大氣的生物活性來源研究[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2009,29(6):1294-1301.

[3]肖正輝,邵龍義,張 寧,等.蘭州市大氣 PM10對質(zhì)粒 DNA 的損傷 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2009,29(6):561-566.

[4]Poli Parola M. Oxidativedamageandfibrogenesis [J]. FreeRadieal Biology and Medieine, 1996,22:287-305.

[5]Rahmanl Maenee W. Roleofoxidants/antioxidantsinsmok-ingindueed]ungdlseases [J]. Free Radieal Biology and Medieine,1996,21(5):669-681.

[6]呂森林,邵龍義,吳明紅,等.北京PM10的生物活性與微量元素的相關(guān)性研究 [J]. 中國科學(xué) D輯 地球科學(xué), 2006,36(8):777-784.

[7]迪麗努爾·塔力甫,亞力昆江,阿布力孜·伊米提.烏魯木齊市可吸入顆粒物污染水平及其與氣象因素的相關(guān)性分析 [J]. 干旱環(huán)境監(jiān)測, 2011,25(2):90-94.

[8]肖正輝,邵龍義,張 寧,等.蘭州市冬季PM10的微觀形貌和粒度分布 [J]. 遼寧工程技術(shù)大學(xué)學(xué)報(bào), 2007,26(1):147-150.

[9]沈蓉蓉,邵龍義,王志石,等.澳門冬季大氣 PM10基于 DNA損傷的毒理學(xué)研究 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2009,29(9):991-996.

[10]時(shí)宗波,邵龍義,Jones J P,等.城市大氣可吸人顆粒物對質(zhì)粒A的氧化性損傷 [J]. 科學(xué)通報(bào), 2004,49(7):673-678.

[11]劉彥飛.哈爾濱市可吸入顆粒物物理化學(xué)特征及生物活性研究[D]. 北京:中國礦業(yè)大學(xué), 2004.

[12]李鳳菊、邵龍義、楊淑申,等.鄭州大氣PM10的形貌特征及生物活性研究 [J]. 環(huán)境科學(xué), 2008,28(9):2654-2658.

[13]Imrich A, Ning Y Y, Kobzik L. Insoluble components ofconcentrated air particles mediated alveolar macrophage responses invitro [J]. Toxicity and Applied Pharmacology, 2000,167:140-150.

[14]李金娟.城市可吸入顆粒物的生物活性研究 [D]. 北京:中國礦業(yè)大學(xué), 2006.