芩術(shù)四物湯中單體化合物的鎮(zhèn)痛抗炎作用Δ

黃道秋，李風(fēng)，秦旭華，彭騰，李柏群，鄭祥本，楊紅兵（.重慶三峽中心醫(yī)院，重慶 404000；.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 6007）

痛經(jīng)發(fā)病率高，給婦女的身心健康和工作、學(xué)習(xí)帶來了嚴(yán)重的影響?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)常采用非甾體抗炎藥治療痛經(jīng)[1-3]，但非甾體抗炎藥物只是對癥止痛，不能從根本上解決問題。祖國醫(yī)學(xué)在治療本病方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。芩術(shù)四物湯是古方芩術(shù)丸和四物湯裁減方，由黃芩、白術(shù)、當(dāng)歸、川芎、白芍等構(gòu)成。其藥味精簡，藥物配伍平和而巧妙，養(yǎng)血活血，行氣利水，寓意深刻，凡證見血虛、血瘀、濕阻、肝郁、脾虛等虛實(shí)夾雜者，均可用之。該方在重慶三峽中心醫(yī)院應(yīng)用，總有效率在85%以上。該方的乙酸乙酯萃取部位通過鑒定得到14個化合物，其中大部分化合物來源于黃芩[4]。有研究表明，該方中當(dāng)歸、白芍兩藥對子宮平滑肌的收縮頻率及平均肌張力有抑制作用，且兩藥合用其作用增強(qiáng)[5]。開展該方有效成分的實(shí)驗(yàn)研究，不僅有可能揭示臨床驗(yàn)方芩術(shù)四物湯治療痛經(jīng)的現(xiàn)代機(jī)制，并通過現(xiàn)代的分離和提取技術(shù)，有可能從傳統(tǒng)驗(yàn)方中尋找并開發(fā)出新型安全治療痛經(jīng)的有效藥物，從而為進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用芩術(shù)四物湯奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

小鼠自主活動記錄儀（成都泰盟科技有限公司）；DSY-1-2孔型電熱恒溫水浴鍋（北京國華醫(yī)療器械廠）；FA2004N型電子天平（上海民怡儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

沒食子酸、黃芩苷由成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)教研室彭騰副教授提供（純度＞98%），實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水（含0.5%吐溫80，助溶）配成所需濃度的混懸液備用；曲馬多（批號:012100901）、布洛芬軟膠囊（批號:168120701）購自石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司；艾司唑侖片（常州四藥制藥有限公司，批號:20080227）；0.6%冰醋酸（分析純，重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司，批號:20120320）；甲醛溶液（成都市科龍化工試劑廠，批號:20120320）。

1.3 動物

清潔級KM小鼠，♀，體質(zhì)量18～22 g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供[實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號:SCXK（川）2008-11]。

2 方法

2.1 芩術(shù)四物湯中單體化合物的鎮(zhèn)痛作用研究

2.1.1 芩術(shù)四物湯中單體化合物對熱板所致小鼠疼痛反應(yīng)的影響 將小鼠放入溫度（55±0.5℃）已控制好的熱板上，立即觸摸“計(jì)時”按鈕開始計(jì)時，并蓋上有機(jī)玻璃罩避免小鼠躍出，仔細(xì)觀察，待小鼠舔后足時馬上再次觸摸“計(jì)時”按鈕而鎖定時間，該時間為小鼠的痛閾值（凡是在5 s內(nèi)出現(xiàn)舔后足及超過60 s不舔后足，或逃避跳躍的小鼠棄置不用）。80只KM小鼠隨機(jī)均分為8組，即模型（等容蒸餾水，含0.5%吐溫80）組，曲馬多（40mg/kg）組，沒食子酸高、中、低劑量（68.6、34.3、17.2mg/kg）組，黃芩苷高、中、低劑量（120、60、30mg/kg）組，ig給藥。分別測定ig給藥前，給藥后5、30、60、90、120min時小鼠的痛閾值。若小鼠放入熱板儀中60 s仍無反應(yīng)，應(yīng)將小鼠取出，痛閾值按60 s計(jì)。

2.1.2 芩術(shù)四物湯中單體化合物對醋酸所致小鼠疼痛反應(yīng)的影響 80只KM小鼠隨機(jī)均分為8組，即模型（等容蒸餾水，含0.5%吐溫80）組，布洛芬（40mg/kg）組，沒食子酸高、中、低劑量（68.6、34.3、17.2mg/kg）組，黃芩苷高、中、低劑量（120、60、30mg/kg）組。于末次給藥30min后，每只小鼠ip 0.5%冰醋酸0.2ml/20 g，立即將小鼠單只放入小鼠籠內(nèi)，觀察15min內(nèi)各鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)的潛伏期（ip醋酸后至第1次扭體反應(yīng)出現(xiàn)的時間）和扭體次數(shù)。

2.1.3 芩術(shù)四物湯中單體化合物對甲醛所致小鼠疼痛反應(yīng)的影響 分組與給藥同“2.1.1”項(xiàng)下方法。于末次給藥30min后，每只小鼠左側(cè)足趾處注射1%甲醛25μl/只，立即觀察小鼠0～5min、15～30min內(nèi)的舔足次數(shù)。

2.2 芩術(shù)四物湯中單體化合物的抗炎作用研究

2.2.1 芩術(shù)四物湯中單體化合物對二甲苯所致炎癥模型小鼠的影響 80只KM小鼠隨機(jī)均分為8組，即模型（等容蒸餾水，含0.5%吐溫80）組，地塞米松（2.0mg/kg）組，沒食子酸高、中、低劑量（68.6、34.3、17.2mg/kg）組，黃芩苷高、中、低劑量（120、60、30mg/kg）組。ig給藥30min后將30μl二甲苯均勻涂抹于每只小鼠的右耳兩面。致炎60min后，小鼠脫頸處死，分別剪下左右耳片，打孔器取相同部位打孔，電子天平稱質(zhì)量。耳腫脹度的計(jì)算公式:腫脹度（mg）＝腫脹耳片質(zhì)量－未腫脹耳片質(zhì)量；腫脹抑制率計(jì)算公式:腫脹抑制率＝（模型組平均腫脹度－用藥組平均腫脹度）/模型組平均腫脹度×100%。

2.2.2 芩術(shù)四物湯中單體化合物對模型小鼠棉球肉芽腫的影響 分組與給藥同“2.2.1”項(xiàng)下方法。小鼠于右腹部消毒后剪開1 cm長小口，以血管鉗擴(kuò)松皮下組織，用鑷子將質(zhì)量為10mg的滅菌干棉球植入腋部皮下，切口涂紅霉素軟膏，術(shù)后2 d每天注射硫酸慶大霉素0.05ml/只，以防感染。由手術(shù)當(dāng)天起ig給藥，每天1次，連續(xù)7 d。末次給藥24h后處死小鼠，打開原切口，將棉球連同周圍結(jié)締組織一起取出，剔除脂肪組織，放烘箱60℃6h烘干后稱質(zhì)量，減去原棉球質(zhì)量即為肉芽腫干質(zhì)量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 芩術(shù)四物湯中單體化合物對熱板刺激致小鼠疼痛反應(yīng)的影響

與模型組比較，沒食子酸高、中、低劑量組與黃芩苷高、中、低劑量組ig給藥5、30、60、90、120min后痛閾值無明顯改變（P＞0.05）。芩術(shù)四物湯中單體化合物對熱板刺激致小鼠疼痛反應(yīng)的影響見表1。

表1 芩術(shù)四物湯中單體化合物對熱板刺激致小鼠疼痛反應(yīng)的影響（，n＝10）Tab 1 Effects of monomeric compound in Qinshu siwu decoction on pain response of mice induced by hot plate（，n＝10）

表1 芩術(shù)四物湯中單體化合物對熱板刺激致小鼠疼痛反應(yīng)的影響（，n＝10）Tab 1 Effects of monomeric compound in Qinshu siwu decoction on pain response of mice induced by hot plate（，n＝10）

與模型組比較:＊P＜0.01vs.model group:＊P＜0.01

組別模型組曲馬多組沒食子酸高劑量組沒食子酸中劑量組沒食子酸低劑量組黃芩苷高劑量組黃芩苷中劑量組黃芩苷低劑量組劑量，mg/kg給藥后痛閾值，s 4068.634.317.21206030給藥前痛閾值，s 14.50±4.7815.78±3.9512.55±3.0113.46±3.9513.08±4.5514.20±3.3013.20±3.4014.50±3.305min 10.79±3.4731.46±9.96＊12.42±3.4714.68±6.4213.07±4.1718.50±8.6019.10±11.5021.20±12.5030min 10.61±3.6339.06±11.23＊12.33±3.5612.58±4.5910.63±2.0625.90±12.5014.40±12.3019.80±11.6060min 12.93±4.7912.61±4.0510.72±3.5110.95±3.3311.35±2.5514.30±8.3010.60±60.4023.00±13.2090min 14.53±5.4511.78±2.8111.88±3.0810.08±2.6912.23±2.3413.80±5.908.40±4.4010.10±5.20120min 15.76±7.4412.39±3.8012.01±3.4814.10±3.1016.81±8.5118.90±14.609.80±4.9017.80±16.30

3.2 芩術(shù)四物湯中單體化合物對醋酸致小鼠疼痛反應(yīng)的影響

與模型組比較，黃芩苷高劑量組小鼠扭體反應(yīng)潛伏期延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；沒食子酸高、中劑量組與黃芩苷高、中劑量組小鼠扭體次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。芩術(shù)四物湯中單體化合物對醋酸致小鼠疼痛反應(yīng)的影響見表2。

3.3 芩術(shù)四物湯中單體化合物對甲醛致小鼠疼痛反應(yīng)的影響

與模型組比較，給藥0～5min時，沒食子酸高劑量組小鼠舔后足次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；給藥15～30min時，沒食子酸高、中、低劑量組與黃芩苷高劑量組小鼠舔后足次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。芩術(shù)四物湯中單體化合物對甲醛致小鼠疼痛反應(yīng)的影響見表3。

3.4 芩術(shù)四物湯中單體化合物對二甲苯致小鼠耳腫脹和模型小鼠棉球肉芽腫的影響

與模型組比較，沒食子酸高、中、低劑量組與黃芩苷高、中、低劑量組小鼠耳腫脹度減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；沒食子酸高劑量組與黃芩苷高、中劑量組小鼠棉球肉芽腫干質(zhì)量減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。芩術(shù)四物湯中單體化合物對二甲苯致小鼠耳腫脹和模型小鼠棉球肉芽腫的影響見表4。

表2 芩術(shù)四物湯中單體化合物對醋酸致小鼠疼痛反應(yīng)的影響（，n＝10）Tab 2 Effects of monomeric compound in Qinshu siwu decoction on pain response of mice induced by acetic acid（，n＝10）

表2 芩術(shù)四物湯中單體化合物對醋酸致小鼠疼痛反應(yīng)的影響（，n＝10）Tab 2 Effects of monomeric compound in Qinshu siwu decoction on pain response of mice induced by acetic acid（，n＝10）

與模型組比較:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model group:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別模型組布洛芬組沒食子酸高劑量組沒食子酸中劑量組沒食子酸低劑量組黃芩苷高劑量組黃芩苷中劑量組黃芩苷低劑量組扭體次數(shù)30.5±12.212.4±8.9＊＊18.9±10.2＊20.4±9.5＊31.0±10.614.8±11.2＊＊16.3±7.7＊＊22.7±6.9劑量，mg/kg 4068.634.317.21206030扭體反應(yīng)潛伏期，s 8.8±5.316.9±4.6＊＊11.3±7.59.8±4.27.9±4.417.1±7.2＊＊11.4±3.19.1±3.5

表3 芩術(shù)四物湯中單體化合物對甲醛致小鼠疼痛反應(yīng)的影響（，n＝10）Tab 3 Effects of monomeric compound in Qinshu siwu decoction on pain response of mice induced by formaldehyde（，n＝10）

表3 芩術(shù)四物湯中單體化合物對甲醛致小鼠疼痛反應(yīng)的影響（，n＝10）Tab 3 Effects of monomeric compound in Qinshu siwu decoction on pain response of mice induced by formaldehyde（，n＝10）

與模型組比較:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model group:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別模型組曲馬多組沒食子酸高劑量組沒食子酸中劑量組沒食子酸低劑量組黃芩苷高劑量組黃芩苷中劑量組黃芩苷低劑量組舔后足次數(shù)（15～30min），次205.8±128.7128.2±59.5＊49.7±26.1＊＊113.1±85.1＊96.1±48.2＊＊102.7±77.2＊150.3±56.1164.9±64.6劑量，mg/kg 4068.634.317.21206030舔后足次數(shù)（0～5min），次69.9±21.537.1±17.3＊46.5±17.9＊63.8±28.058.8±27.764.2±24.457.1±8.263.3±42.5

表4 芩術(shù)四物湯中單體化合物對二甲苯致小鼠耳腫脹和模型小鼠棉球肉芽腫的影響（，n＝10）Tab 4 Effects of monomeric compound in Qinshu siwu decoction on ear edema induced by dimethyl-benzen and tampon granuloma（，n＝10）

表4 芩術(shù)四物湯中單體化合物對二甲苯致小鼠耳腫脹和模型小鼠棉球肉芽腫的影響（，n＝10）Tab 4 Effects of monomeric compound in Qinshu siwu decoction on ear edema induced by dimethyl-benzen and tampon granuloma（，n＝10）

與模型組比較:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model group:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別模型組地塞米松組沒食子酸高劑量組沒食子酸中劑量組沒食子酸低劑量組黃芩苷高劑量組黃芩苷中劑量組黃芩苷低劑量組棉球肉芽腫干質(zhì)量，mg 18.5±3.579.6±2.55＊＊13.2±5.81＊14.5±5.0816.4±6.5511.8±5.01＊12.8±3.05＊15.8±4.37劑量，mg/kg 耳腫脹抑制率，%2.068.634.317.21206030耳腫脹度，mg 5.1±1.93.5±1.8＊2.4±1.3＊3.8±1.6＊3.2±1.3＊2.7±2.3＊2.5±2.3＊3.2±1.7＊31.3753.3132.2937.9447.0650.9837.25

4 討論

現(xiàn)代藥理研究表明，沒食子酸是白芍的活性成分，有止痛、抗炎、抗氧化、護(hù)心和抗血管生成等作用[6-11]。黃芩苷是黃芩中的有效成分之一，具有降壓、鎮(zhèn)靜、保肝、消炎、抗腫瘤等多種藥理作用[12]。本研究表明，芩術(shù)四物湯的單體化合物沒食子酸、黃芩苷對醋酸及甲醛所致小鼠疼痛反應(yīng)具有明顯抑制作用（P＜0.01或P＜0.05）；能明顯減輕二甲苯所致小鼠耳腫脹和減輕小鼠棉球肉芽腫干質(zhì)量（P＜0.05）；且沒食子酸作用較黃芩苷明顯。這可能與臨床驗(yàn)方芩術(shù)四物湯治療痛經(jīng)的作用機(jī)制密切相關(guān)，值得進(jìn)一步研究。

[1]張惜陰.實(shí)用婦產(chǎn)科學(xué)[M].2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2003:833.

[2]熊亞莉.原發(fā)性痛經(jīng)的治療進(jìn)展[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，30（2）:232.

[3]高玉潔.非甾體抗炎藥物的臨床應(yīng)用及安全性評價[J].實(shí)用藥物與臨床，2009，12（2）:122.

[4]袁海梅，彭騰，黃道秋，等.芩術(shù)四物湯乙酸乙酯萃取部位化學(xué)成分研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（3）:136.

[5]朱敏，段金廒，唐于平，等.四物湯及其組方藥物對小鼠離體子宮收縮的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（5）:149.

[6]Tunalier Z，Ko?ar M，Küpeli E，et al.Antioxidant，antiinflammatory，anti-nociceptive act-ivities and composition of Lythrum salicaria L.extracts[J].J Ethnopharmacol，2007，110（3）:539.

[7]Sheu MJ，Chou PY，Cheng HC，et al.Analgesic and antiinflammatory activities of a water extract of Trachelospermum jasminoides（Apocynaceae）[J].J Ethnopharmacol，2009，126（2）:332.

[8]Mudnica Ivana，Moduna Darko，Rastijab Vesna，et al.Antioxidative and vasodilatory effects of phenolic acids in wine[J].Food Chem，2010，119（3）:1205.

[9]Sapkota K，Park SE，Kim JE，et al.Antimelanogenic and antioxidant properties of gallic acid[J].Biosci Biotechnol Biochem，2010，74（8）:1527.

[10]Priscilla DH，Prince PS.Cardioprotective effect of gallic acid on cardiac troponin-T，cardiac marker enzymes，lipid peroxidation products and antioxidants in experimenttally induced myocardial infarction in Wistar rats[J].Chemi Biol Interacti，2009，172（2/3）:118.

[11]Liu Z，Schwimer J，Liu D，et al.Gallic acid is partially responsible for the antiangiogenic activities of Rubus leaf extract[J].Phytother Res，2006，20（9）:806.

[12]黃志軍.黃芩苷藥理作用研究進(jìn)展[J].天津藥學(xué)，2012，24（3）:61.