幾丁糖電紡膜封堵腦脊液漏即刻效果的實(shí)驗(yàn)研究

郭興鋒侯春林*竇源東林曄雷德橋

論著·實(shí)驗(yàn)研究

幾丁糖電紡膜封堵腦脊液漏即刻效果的實(shí)驗(yàn)研究

郭興鋒1侯春林1*竇源東1林曄2雷德橋1

目的研究自行研制的幾丁糖電紡膜防腦脊液漏的即刻效果。方法健康成年的新西蘭家兔5只，取頭部正中切口在雙側(cè)顱頂部對(duì)稱開直徑約1.2cm大小的圓形骨窗；剪去0.8mm×0.8mm大小的硬腦膜組織，并將合適大小的幾丁糖膜置入實(shí)驗(yàn)側(cè)硬膜缺損區(qū)；對(duì)照側(cè)僅行硬腦膜切除而不行硬腦膜修補(bǔ)以作對(duì)照；再于顱骨中線處鉆一小孔，透明導(dǎo)管通過小孔置入硬膜膜下，見腦脊液從導(dǎo)管中反流，緩慢推入美藍(lán)溶液，共重復(fù)5次實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 幾丁糖電紡膜與創(chuàng)面粘附良好，能有效地密封創(chuàng)面，注射美藍(lán)后，實(shí)驗(yàn)側(cè)無美藍(lán)滲出，即使膜的下方聚集大量美藍(lán)也未見從粘貼邊緣漏出，而對(duì)照側(cè)美藍(lán)一直處于滲出狀態(tài)。結(jié)論 幾丁糖電紡膜組明顯優(yōu)于空白對(duì)照組，有明確的封堵腦脊液效果。

幾丁糖電紡膜；腦脊液漏

硬腦膜缺損是神經(jīng)外科臨床上經(jīng)常面臨的問題，開放性顱腦損傷、腫瘤侵犯腦膜、過分電灼腦膜等因素均可導(dǎo)致術(shù)中硬膜無法關(guān)閉，形成缺損。而對(duì)于大面積硬膜缺損的修補(bǔ)較為困難，往往需要采用人工硬膜替代材料。在神經(jīng)外科或脊柱外科手術(shù)中，用替代材料修補(bǔ)缺損的硬膜對(duì)于維持解剖學(xué)的完整和保護(hù)腦組織是十分必要的。目前臨床上使用的人工硬膜幾乎都是合成材料，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，成本高，如強(qiáng)生硬腦膜補(bǔ)片[1]，雖然能有效封堵腦脊液漏，但價(jià)格高昂。幾丁糖[2]已證實(shí)是一種組織相容性良好的天然高分子材料，具有止血、抑菌、促進(jìn)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)[3]等功能，傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的幾丁糖膜脆性大，與組織黏附性差，縫合強(qiáng)度不足，本實(shí)驗(yàn)新西蘭家兔使用的材料，是以單一幾丁糖為原料、通過電紡技術(shù)制成幾丁糖電紡膜(chitosan electrospun membrane,CEM)，強(qiáng)度大、厚度薄、柔韌性好，體外生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其物理性能適合作為防止腦脊液漏及防粘連的材料，本實(shí)驗(yàn)擬通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究該敷料防腦脊液漏即刻效果，術(shù)后防止腦脊液流出，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑、儀器

幾丁糖電紡膜(本課題組自行研制)；美蘭及導(dǎo)管(第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院手術(shù)室提供)；新西蘭兔、異戊巴比妥鈉粉劑及實(shí)驗(yàn)器械耗材等其他物品(由第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。

1.2 幾丁糖電紡膜的制備方法和基本性能特征。

將0.13g幾丁糖溶解于10ml六氟異丙醇和乙酸的混合溶液 (乙酸體積分?jǐn)?shù)為2%)中，在室溫下攪拌一晚形成均一穩(wěn)定的溶液。之后將幾丁糖溶液轉(zhuǎn)移到注射器中，注射器針頭處連接高壓電源。溶液供給流量通過微流泵控制在5ml/ h，施加的電壓為15kv，高壓端同接地端的距離為15cm，所使用滾筒的旋轉(zhuǎn)速度為100rpm。通過此過程，可收集到幾丁糖納米纖維膜，其纖維絲直徑為 300nm左右、厚度在0.13mm左右。將收集得到的幾丁糖納米纖維膜在室溫下放置一晚后，繼續(xù)在37℃真空烘箱內(nèi)干燥一晚，之后根據(jù)需要裁剪成具有特定形狀和尺寸的幾丁糖硬腦膜修補(bǔ)材料。

圖1 幾丁糖電紡膜

1.3 動(dòng)物模型制備及分組

取健康成年的新西蘭家兔5只，19月，體重2.3～3.1kg，雌雄不限。用3%戊巴比妥鈉按30mg/kg行兔耳緣靜脈注射麻醉，將頭部固定于動(dòng)物手術(shù)頭架上。備皮消毒后，取頭部正中切口縱行切開頭皮，分離顳肌及顱骨骨膜，用微型磨鉆在雙側(cè)顱頂部對(duì)稱開直徑約1.2cm大小的圓形骨窗；再于手術(shù)顯微鏡下剪去0.8 mm×0.8cm大小的硬膜組織，并將適當(dāng)大小幾丁糖膜置入左側(cè)硬膜缺損區(qū)，過硬腦膜腔邊緣 5 mm，直接貼敷，覆蓋硬腦膜缺損區(qū)域。用Prolene縫線(5-0縫線)，在定點(diǎn)縫合固定，防止移動(dòng)[4]。右側(cè)僅行硬腦膜切除而不行硬腦膜修補(bǔ)以作對(duì)照。再于顱骨中線處鉆一小孔，透明導(dǎo)管通過小孔置入蛛網(wǎng)膜下腔，見腦脊液從導(dǎo)管中反流，緩慢不間斷注射美藍(lán)溶液設(shè)定恒壓注射器 (輸液泵)注射壓力為800mm水柱，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于正常成人腦脊液壓力(80～200mm水柱)，每只家兔觀察時(shí)間為30秒。共重復(fù)了5次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果一致。(彩圖見插頁）

圖2 模型制作：a雙側(cè)開對(duì)稱骨窗；b剪去實(shí)驗(yàn)側(cè)硬膜組織；c剪去空白對(duì)照側(cè)硬膜組織；d顱中線處置入透明導(dǎo)管于硬膜下

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

通過向硬腦膜內(nèi)緩慢注射美藍(lán)溶液，觀察美藍(lán)溶液漏出情況以評(píng)價(jià)幾丁糖電紡膜在術(shù)中封堵腦脊液漏的即刻效果。

2 結(jié)果

注射美藍(lán)過程中，實(shí)驗(yàn)側(cè)一直未見美藍(lán)從幾丁糖電紡膜修復(fù)的硬膜缺損處周圍流出，而對(duì)照側(cè)美藍(lán)從硬腦膜缺損處大量流出，詳見實(shí)驗(yàn)照片。（彩圖見插頁）

圖3 推入美藍(lán)效果觀察：a貼膜縫合固定后推入美藍(lán)溶液(導(dǎo)管中見美藍(lán)；b推入后第1秒(見美藍(lán)從對(duì)照側(cè)流出)；c第2秒(對(duì)照側(cè)美藍(lán)增多)；d第3秒(對(duì)照側(cè)美藍(lán)大量增加，實(shí)驗(yàn)側(cè)未見)；e第4秒(見右側(cè)大量美藍(lán)，實(shí)驗(yàn)側(cè)仍然未見美藍(lán)露出，敷貼效果好)

3 討論

在施行脊柱、頭顱手術(shù)后，普遍存在腦脊液漏。發(fā)生腦脊液漏后，目前常用的處理方法包括傷口加壓包扎、術(shù)區(qū)持續(xù)引流，經(jīng)皮蛛網(wǎng)膜下腔引流等[1]，但效果均不夠理想，可導(dǎo)致一系列并發(fā)癥，如顱內(nèi)感染、切口遷延不愈、癲癇發(fā)作[2]。Lee,L[3]經(jīng)過回顧十年的病例資料研究表明術(shù)后癲癇發(fā)作 (14.81%)、感染 (9.05%)，出血 (1.65%)和其他 (0.82%)被確定的并發(fā)癥。因此防止腦脊液漏是一個(gè)亟待解決的問題，對(duì)于小的缺損，可以采用自體組織如肌筋膜等進(jìn)行修復(fù)，但文獻(xiàn)報(bào)道在軟腦膜損傷的情況下，但容易因?yàn)檎尺B導(dǎo)致癲癇發(fā)生的隱患，其綜合效果不理想；而對(duì)于大面積硬膜缺損的修補(bǔ)較為困難，往往需要采用人工硬膜替代材料。Matsumoto,Y[4]等成功應(yīng)用人工硬膜硬腦膜替代硬腦膜，封閉硬腦膜下腔，恢復(fù)正常解剖結(jié)構(gòu)，觀察14年后沒有觀察到明顯的變化。人工硬膜的應(yīng)用在預(yù)防和治療腦脊液漏方面有此獨(dú)到之處，有利于降低癲癇等術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生率，沒有引起顱內(nèi)感染的增加。目前研究者們已發(fā)明很多種類的生物材料，如絲素蛋白膜、羊膜、生物膠原、高分子聚合材料及殼聚糖 (幾丁糖)為材料人工硬膜等[5,6]，以上材料都存在各自的不足之處，如絲素蛋白膜在制作工藝上有不少缺陷，仍有待進(jìn)一步改進(jìn)；羊膜在取材方法難以控制，而且與交聯(lián)劑的選擇方面值得進(jìn)一步探索和研究；生物膠原空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不明顯，不利于自身成纖維細(xì)胞支撐與附著；高分子聚合材料因?yàn)榫哂猩飳W(xué)毒性，而且理化性能也有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確證。幾丁糖具備良好的組織相容性，可以被機(jī)體降解吸收，而且在體內(nèi)幾乎不引起任何免疫排斥反應(yīng)，具有良好的成膜性，把幾丁糖制成具有一定超微的結(jié)構(gòu)的裝置，我們將它制作成膜的形式，放置在手術(shù)部位，如肌腱、神經(jīng)以及可能發(fā)生相互粘連的損傷組織之間作為一種隔膜，起到阻隔的作用，因?yàn)閯?chuàng)傷組織修復(fù)愈合需要2～3周，這種隔膜有效的將新生組織相互間隔，由于幾丁糖可以被機(jī)體慢慢吸收，一般在數(shù)月內(nèi)可以吸收完畢，這時(shí)創(chuàng)傷組織已完全愈合，而且?guī)锥√悄ぶ車梢孕纬梢粚幼泽w組織膜從而起到封堵腦脊液及防粘連作用[7]；同時(shí)，殼聚糖止血效果好，可有效的防止纖纖維蛋白絲聚集。幾丁糖作為膜制品，目前有些報(bào)道[8，9]，但這些膜制品幾乎都沒有應(yīng)用到臨床，因?yàn)檫@些膜制品還有很多缺陷和不足之處，與我們理想的人工硬膜制品還有相當(dāng)程度的差距，主要有：幾丁糖膜與人體自身組織貼服性不佳；脆性較大，手術(shù)操作時(shí)難以對(duì)其進(jìn)行包裹固定，縫合的強(qiáng)度明顯不足；由于復(fù)合了其他原料，植入前期出現(xiàn)不明原因的輕度炎癥反應(yīng)和異物反應(yīng)。理想的硬膜修補(bǔ)材料必須具有：①應(yīng)在物理性能上與人硬膜相似，具有一定的彈性、韌性，并經(jīng)得起縫合，能有效的恢復(fù)硬膜下腔的完整性；②具有良好的生物相容性；③能為硬膜的自體修復(fù)提供支架，以利于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)和移動(dòng)，從而促使硬膜再生，新硬膜形成后，移植物能被逐漸吸收，以防長(zhǎng)期存在于體內(nèi)的異物給身心帶來不良影響；④不增加術(shù)后感染率和顱內(nèi)血腫發(fā)生率；⑤對(duì)周圍神經(jīng)組織無損害，不傳播疾??；⑥易于消毒儲(chǔ)存，經(jīng)濟(jì)易得，使用方便。本課題經(jīng)過多年探索，研制了新型幾丁糖膜，我們稱之為幾丁糖電紡膜，通過電紡技術(shù)以單一幾丁糖為原料制備而成。幾丁糖電紡膜與腦膜敷貼性優(yōu)異，固定牢靠，與創(chuàng)面粘附良好，能有效地密封創(chuàng)面。生物相容性良好，從即刻效果看，幾丁糖電紡膜質(zhì)地柔軟，與創(chuàng)面粘附良好，能有效地密封創(chuàng)面從而封堵腦脊液漏，對(duì)腦組織無損傷；實(shí)驗(yàn)過程中，我們觀察發(fā)現(xiàn)，幾丁糖電紡膜與硬膜接觸后，能快速從干燥狀態(tài)變?yōu)闈駶?rùn)狀態(tài)粘于硬膜外與破損處，膜的縫合強(qiáng)度大，即使用角針也不易使膜破裂，濕潤(rùn)后縫合效果更佳，縫線目的是防止手術(shù)及術(shù)后幾丁糖電紡膜位置移動(dòng)，與封堵硬膜破損無關(guān)。注射美藍(lán)后，實(shí)驗(yàn)側(cè)無美藍(lán)滲出，而對(duì)照側(cè)美藍(lán)一直處于滲出狀態(tài)。但該材料用于修復(fù)硬腦膜缺損的遠(yuǎn)期轉(zhuǎn)歸，組織相容性如何，能否完全降解吸收，吸收后原缺損處能否形成膜樣組織等，后續(xù)實(shí)驗(yàn)我們將通過組織學(xué)(HE染色，masson染色)，免疫組化，電鏡等方法進(jìn)一步評(píng)價(jià)其遠(yuǎn)期療效。期望其下方能新生一層類似硬腦膜的新生纖維組織膜，具備硬膜重建功能，同時(shí)具備一定程度抗感染、促進(jìn)創(chuàng)面愈合功能，遠(yuǎn)期防腦脊液漏效果明確。當(dāng)新生纖維膜組織修補(bǔ)完成缺損區(qū)域之后，幾丁糖電紡膜逐步被自體組織降解、吸收、當(dāng)完全吸收，新生纖維組織膜完全替代硬腦膜，達(dá)到了具有實(shí)際意義的硬腦膜重建。由于幾丁糖電紡膜具備以下優(yōu)點(diǎn)：以單一幾丁糖為原料，大大降低了生產(chǎn)成本；通過靜電紡絲技術(shù)制成，強(qiáng)度大、厚度薄、柔韌性好，術(shù)中能較好包裹及縫合固定。其物理性能非常適合作為術(shù)中防止腦脊液漏的材料；由于其原料豐富，價(jià)格低廉，容易取得，具有非常廣闊的臨床應(yīng)用前景。

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Experimental study of immediate effect of chitosan electrospun membrane plugging cerebrospinal fluid leakage

Guo Xingfeng1,Hou Chunlin1,Dou Yuandong1,et al.1 Department of Orthopetic Surgery,Changzheng Hospital of the Second Military Medical University,Shanghai,200003;2 Institute of Nephrology,Changzheng Hospital,Shanghai, 200003,China

Objective To study the immediate prevention effect of cerebrospinal fluid leakage by using self-developed chitosan electrospun membrane.Methods Took 5 healthy adult New Zealand rabbits,via midline incision of head,made circular bone window,about 1.2cm in diameter,in the bilateral parietal skull symmetrically.Cut 0.8 mm×0.8mm cerebral dura mater,put suitably sized Chitosan membrane into the experimental side of dural defect area;simultaneously,on the other side,only cut and not repaired cerebral dura mater as control group.Drill a small hole in the midline of skull,put a transparent tube through the hole into the subdural,saw cerebrospinal fluid reflux from the tube,and injected methylene blue solution slowly.Repeat for 5 times.Results Chitosan electrospun membrane adheres well to the wound and sealed the wounds effectively.After injecting methylene blue solution,no effusion happened on the experimental side,even there gathered a large number of methylene blue under the membrane,no solution exposed from the edge of film,while on the other side,the control group had methylene blue oozed all the time.Conclusion Chitosan membrane group was superior to the controls,the plugging effect on cerebrospinal fluid leakage can be determined.

Chitosan electrospun membrane;Cerebrospinal fluid leakage

R318.08;Q813.1

A

10.3969/j.issn.1672-5972.2014.04.001

swgk2013-12-0269

郭興鋒(1980-)男，博士在讀，主治醫(yī)師，研究方向：創(chuàng)傷骨科與修復(fù)重建外科，生物材料。

*[通訊作者]侯春林(1945-)男，教授，博士導(dǎo)師，研究方向：創(chuàng)傷骨科與修復(fù)重建，生物材料。

2013-12-09)

1第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院骨科醫(yī)院，上海 200003；2第二軍醫(yī)大學(xué)腎病研究所，上海 200003