異硫氰酸芐酯誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤U-87 MG細胞凋亡及其機制的研究

李文明，吳 琦，朱 彧

（1.北京紅惠新醫(yī)藥科技有限公司，北京 102600；2.天津市環(huán)湖醫(yī)院檢驗科，天津市腦血管與神經(jīng)變性重點實驗室，天津 300060）

原發(fā)性腦腫瘤長在有限的顱腔空間中，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成傷害，極易危及生命。在原發(fā)性腦腫瘤中，膠質(zhì)瘤最為常見，約占50%，而在惡性腦腫瘤中，腦膠質(zhì)瘤的比例則高達80%［1］，預(yù)后較差，中位生存期不超過2年［2－3］，尋找新的有效的治療方法仍然是十分必要的。

異硫氰酸鹽是一類天然的小分子化合物，這類化合物普遍存在于十字花科植物如綠花椰菜，卷心菜和水芹菜中。到目前為止，已經(jīng)報道了幾十種天然的或半合成的異硫氰酸鹽，以萊菔硫烷（sulforaphane，SFN）、苯乙基異硫氰酸酯（phenethyl isothiocyanate，PEITC）和異硫氰酸芐酯（BITC）具有較高的生理活性［4］。其中，BITC對腦膠質(zhì)瘤這一惡性腫瘤的抑制作用的研究仍然較少，因此本研究著重探討B(tài)ITC對人腦膠質(zhì)瘤細胞系U-87 MG的抑制作用和其中的機制。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 人腦膠質(zhì)瘤U-87MG細胞系購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所；細胞培養(yǎng)基購自Gibco公司；BITC購自Sigma公司；MTS檢測試劑、real time-PCR檢測試劑盒購自Promega公司；細胞凋亡和細胞周期檢測試劑盒購自BD Biosciences；ROS檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；單克隆檢測抗體購自Santa Cruz公司；轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄活性報告基因檢測試劑盒購自Promega；ECL免疫印跡底物試劑盒購自Millipore公司；FACS Aria流式細胞儀購自BD公司；Multiskan Spectrum酶標儀和PikoReal PCR儀購自Thermo公司。

1.2 細胞及培養(yǎng)體系 U-87 MG細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、飽和濕度，采用0.25%胰酶-EDTA消化傳代。

1．3 MTS法檢測BITC對腫瘤細胞增殖的抑制作用 取對數(shù)生長期的細胞配制為3×107·L－1的細胞懸液，100μl／孔接種到96孔微孔板中，培養(yǎng)過夜。向相應(yīng)試驗孔分別加入 0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50和100μmol·L－1的 BITC，繼續(xù)培養(yǎng) 72 h，吸去培養(yǎng)基，按照試劑盒說明書加入MTS試劑，培養(yǎng)2 h后，以酶標儀測定OD值（A490nm波長）。細胞增殖抑制率／%＝（1－BITC處理組OD值／對照組OD值）×100%，細胞達到50%抑制率時所對應(yīng)的BITC濃度即為其IC50值。

1．4 流式細胞術(shù)檢測腫瘤細胞凋亡和ROS生成取對數(shù)生長期的腫瘤細胞接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，為檢測BITC對腫瘤細胞凋亡的作用，分別加入 PBS或10、20μmol·L－1的 BITC到試驗孔中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，胰酶消化收集細胞，PI／Annexin V室溫避光染色15 min，用流式細胞儀檢測凋亡細胞。

取對數(shù)生長期的腫瘤細胞接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，為檢測BITC對腫瘤細ROS的誘導(dǎo)作用，分別加入PBS或2和5μmol·L－1的BITC到試驗孔中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，胰酶消化收集細胞，DCFHDA室溫避光染色30 min，用流式細胞儀檢測細胞活性氧（ROS）產(chǎn)生。

1．5 Western blot法檢測腫瘤細胞凋亡相關(guān)基因的表達 取對數(shù)生長期的腫瘤細胞接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別加入PBS或2和5μmol·L－1的BITC到試驗孔中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，消化、離心、收集、裂解細胞后提取細胞總蛋白。以BCA法測定細胞裂解液中的總蛋白含量，取100μg總蛋白以12%SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1h后，洗滌3次，加入單克隆抗體（Bcl-2，1∶500；Survivin，1∶500；caspase-3，1∶400；caspase-8，1∶400；p-JNK，1∶400；β-actin，1∶5 000）室溫孵育4 h，洗滌3次，以HRP連接的二抗室溫孵育2 h，洗滌3次，以ECL試劑盒顯示免疫反應(yīng)條帶。β-actin作為蛋白加樣內(nèi)參照。

1．6 Real time-PCR檢測腫瘤細胞凋亡相關(guān)基因的mRNA表達 取對數(shù)生長期的腫瘤細胞接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別加入PBS或2和5 μmol·L－1的 BITC到試驗孔中，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，用TRIzol法提取各組總RNA，用Real time PCR試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄得到 cDNA。Bcl-2上游引物序列：5′-ACGGGGTGAACTGGGGGAGGA-3′，下游引物序列：5′-TGTTTGGGGCAGGCATGTTGACTT-3′；Survivin上游 引 物 序 列：5′-CTCTACATTCAAGAACTGGCC-3′，下游引物序列：5′-TTGGCTCTTTCTCTGTCCAG-3′；β-actin上游引物序列：5′-TGAGCGCGGCTACAGCTT-3′，下 游 引 物 序 列： 5′-TCCTTAATGTCACGCACGATTT-3′；94℃變性3 min后，按下述條件擴增40個循環(huán)：95℃ 5 s，65℃ 35 s，72℃ 60 s，循環(huán)后72℃延伸5 min。

1.7 轉(zhuǎn)錄因子核轉(zhuǎn)錄活性檢測 取對數(shù)生長期的腫瘤細胞接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)染AP-1熒光報告質(zhì)粒，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，更換新鮮培養(yǎng)基，分別加入PBS或2和5μmol·L－1的BITC到試驗孔中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后根據(jù)試劑說明書的方法，檢測AP-1的轉(zhuǎn)錄活性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 計量資料以ˉx±s表示，采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結(jié)果

2．1 BITC可明顯抑制U-87 MG的體外生長 用MTS方法評價BITC作用72h對U-87MG體外生長的抑制作用，從試驗結(jié)果看，BITC具有明顯的抑制作用，3次重復(fù)試驗測得 IC50均值為（15.2±1.2）μmol·L－1，見 Fig 1。

Fig 1 Inhibitory effect of BITC on the U87MG cell line proliferation（ˉx±s，n＝6）

Fig 2 Effect of BITC on the apoptosis-induced ROS expression in U87MG cell line（Bars indicate SD，n＝3）

2．2 BITC明顯地促進細胞凋亡和ROS產(chǎn)生 為研究BITC對細胞凋亡的作用，我們選取10和20 μmol·L－1BITC進行研究，10和 20μmol·L－1BITC作用24 h后凋亡率分別為29.3%和68.6%（P＜0.05）。2和5μmol·L－1BITC作用腫瘤細胞24 h后，抑制率為3.8%和11.6%，分別為無毒（抑制率＜5%）和低毒（抑制率＜15%）濃度，我們采用上述兩種濃度進行后續(xù)研究，以排除細胞增殖抑制對結(jié)果的影響。2和5μmol·L－1BITC作用腫瘤細胞24 h后，ROS產(chǎn)生分別為對照組的3.76倍和6.07倍（P＜0.05），表明 BITC介導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用可能與其誘發(fā)細胞氧化損失有關(guān)，見Fig 2。

2．3 BITC調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白 Bcl-2、Survivin、caspase-3和caspase-8表達 為進一步研究BITC誘導(dǎo)細胞凋亡的機制，我們檢測了凋亡相關(guān)蛋白表達的變化。結(jié)果顯示，經(jīng)BITC誘導(dǎo)凋亡的細胞，其促凋亡蛋白caspase-3和caspase-8的水平均明顯上升，抑凋亡蛋白Bcl-2和Survivin明顯下降（Fig 3），2和5μmol·L－1的 BITC作用24 h后，Bcl-2 mRNA表達分別是對照組的32.7%和19.2%（P＜0.05），Survivin mRNA表達分別是對照組的41.3%和22.7%（P＜0.05）。

2．4 BITC可促進JNK磷酸化和抑制AP-1轉(zhuǎn)錄活性 為了考察BITC誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的信號通路，我們研究了BITC對一些關(guān)鍵信號通路上的關(guān)鍵蛋白的作用。研究發(fā)現(xiàn)，BITC促進了與細胞凋亡緊密相關(guān)的JNK蛋白磷酸化（Fig 4）和AP-1轉(zhuǎn)錄活性，2和5μmol·L－1的 BITC作用24 h后，AP-1轉(zhuǎn)錄活性分別是對照組的42.5%和26.7%（P＜0.05）。

Fig 3 Effect of BITC on apoptosis related gene expression in U87MG cell line

Fig 4 Effect of BITC on phosphorylation of JNK of U87MG cell line

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是最常見的惡性腦部原發(fā)性腫瘤，化療是其常用的治療方法之一，因此尋找有效的藥物是膠質(zhì)瘤研究的重點［5－6］。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，十字花科植物中的異硫氰酸酯可以降低癌癥的患病率，其中BITC是活性較高的異硫氰酸酯之一，然而BITC對腦膠質(zhì)瘤的作用還未得到充分研究。

Pro-caspase-8可被激活轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨腸aspase-8，經(jīng)caspase的級聯(lián)反應(yīng)激活下游的效應(yīng)caspase-3，導(dǎo)致細胞凋亡。Survivin是重要的凋亡抑制蛋白，研究表明其可通過直接抑制凋亡終末效應(yīng)酶caspase-3活性來阻斷細胞凋亡過程［7］。Bcl-2可通過改變線粒體巰基的氧化還原狀態(tài)，降低胞內(nèi)的氧化還原電位抑制細胞凋亡［8－9］。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)BITC可抑制U-87MG細胞體外增殖，其 IC50為15.2μmol·L－1。為了進一步探討B(tài)ITC抑制腫瘤生長的機制，我們考察了BITC對腫瘤細胞凋亡的誘導(dǎo)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在較高濃度下（10和20μmol·L－1）BITC可明顯促進細胞凋亡。為了消除細胞凋亡對后續(xù)試驗的影響，我們采用無毒濃度（細胞抑制率＜5%）和低毒濃度（細胞抑制率＜15%）繼續(xù)探討B(tài)ITC對腫瘤細胞凋亡的作用機制，我們發(fā)現(xiàn)在2（無毒濃度）和5μmol·L－1（低毒濃度）BITC作用下，BITC可抑制 Survivin表達，上調(diào)其下游的caspase-3和caspase-8表達。同時，我們發(fā)現(xiàn)BITC可使U-87 MG細胞內(nèi)的ROS水平明顯上升，同時抑制Bcl-2表達，說明氧化損傷在BITC誘導(dǎo)凋亡中發(fā)揮重要作用，與文獻報道相一致［10］。

JNK是MAPK通路重要的信號分子，被認為與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切聯(lián)系，可作為多種惡性腫瘤的分子治療靶點。JNK被磷酸化激活后可進入細胞核，抑制轉(zhuǎn)錄因子AP-1，調(diào)控下游凋亡相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達，或者通過直接調(diào)節(jié)Bcl-2轉(zhuǎn)錄和表達，影響細胞凋亡。同時，也有報道認為ROS可直接激活JNK活性，進而誘導(dǎo)細胞凋亡［11］。在對信號通路的研究中，我們發(fā)現(xiàn)BITC可上調(diào)JNK活性，下調(diào)AP-1活性。這與JNK和AP-1活性的改變可抑制腫瘤細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡的報道相一致，可能是BITC抑制腫瘤生長，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的機制之一。

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