白鮮皮水提物對ApoE-／-小鼠動脈粥樣硬化晚期病變形成的影響

王麗麗，呂新勇，李 琳，李志強，，李彥林，蕭 偉，許 揚

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇連云港 222002）

白鮮皮為蕓香科植物白鮮（Dictamnus dascarpus Turcz）的干燥根皮。因其具有清熱燥濕、祛風(fēng)解毒的功效，在傳統(tǒng)中藥學(xué)上歸為清熱燥濕類。臨床主要用于皮膚病如濕熱瘡毒、皮膚瘙癢、濕疹、風(fēng)疹、疥癬、瘡癩、風(fēng)濕熱痹、黃疸尿赤等的治療［1］，但其在心血管疾病中是否具有治療作用的研究甚少。筆者［2］的前期研究中，發(fā)現(xiàn)白鮮皮水提物（cortex dictamni aqueous extract，CDAE）可明顯抑制載脂蛋白E基因缺損（ApoE-／-）小鼠早期動脈粥樣硬化病變的形成，顯示了白鮮皮對于干預(yù)心血管疾病具有初步作用。在此基礎(chǔ)上，筆者進(jìn)一步研究了CDAE對ApoE-／-晚期動脈粥樣硬化的影響，并探討了相關(guān)的作用機制。

1 材料

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 ApoE-／-小鼠，♀，6周齡，體質(zhì)量 15～16 g。購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心［SCXK（京）2006－0008］。飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所 SPF級動物房內(nèi)［SCXK（京）2008－0019］。20℃，12 h晝夜交替。

1.1.2 藥材 白鮮皮（分別購于河北安國藥材市場及北京仟草中藥飲片有限公司，產(chǎn)地遼寧，由本研究所鄒忠梅教授鑒定，樣品保存號：NO.010001850001）生藥100 g。利用2 L蒸餾水4℃冷浸24 h，超聲波提取25 min過濾，再重復(fù)2次加入2 L蒸餾水超聲波提取25 min過濾，合并提取液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上80℃濃縮至100 ml，即得含生藥量1 000 g·L－1的白鮮皮水提物。

1.1.3 儀器 上海亞榮RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日立7060全自動生化分析儀，美國Beckman XL-90超速離心機，美國Beckman Coulter離心管切割機，美國Hamilton MicroLab 500稀釋器，德國Leica 1900冰凍切片機，德國Leica DM4000M正置顯微鏡，美國Bio-Tek酶標(biāo)儀，上海儀器有限公司UV-2102C／PC／PCS型分光光度計。

1.1.4 試劑 血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）試劑盒（中生北控生物科技股份有公司，北京），油紅 O染料（Sigma，USA），PBS（中杉金橋生物技術(shù)有限公司，北京），OCT包埋劑（日本櫻花精機株式會社，東京），膠原蛋白酶Ⅰ、胰蛋白酶（Sigma，USA）。HPLC檢測所用標(biāo)準(zhǔn)品為白鮮堿（批號：111654－200301）、黃柏酮（批號：111923－201102）、梣酮（批號：111700－200602）（中國食品藥品檢定研究院，北京）。

2 方法

2．1 HPLC分析 色譜條件為：Waters色譜儀，色譜分析柱Thermo Synronis aQDim C18柱（5μm，250 mm×4.6 mm），流動相為甲醇 ∶水（60∶40，V／V），流速為1 ml·min－1，檢測波長為236 nm，進(jìn)樣量為20μl，柱溫設(shè)置為30℃（Fig 1）。

Fig 1 CDAE analyzed by HPLC

2.2 動物分組 60只6周齡的ApoE-／-♀小鼠，所有小鼠均以高脂飼科（含0.3%膽固醇，20%脂肪，其余成分與普通飼料相同，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物研究所）喂養(yǎng)，自由攝食和飲水。喂養(yǎng)高脂飼料至12周，測定各組小鼠的血脂4項，對TC高于10 mmol·L－1的小鼠作為研究對象，隨機分成 CDAE高、中、低劑量組和對照組4組，每組10只。

2.3 給藥方法 CDAE 1000 g·L－1分別稀釋成高、中、低3個濃度，每組按每只每天3.2、1.6、0.8 g·kg－1劑量灌胃，空白對照組按相同劑量給予稀釋藥物用的滅菌純凈水。每兩周稱重1次，調(diào)整給藥量，連續(xù)給藥6周（Fig 2）。

2.4 血脂測定 每組給藥前后測定血脂各項指標(biāo)，包括TC、TG、LDL-C、HDL-C。各組小鼠于給藥前后禁食 12 h，眼眶取血，5 000 r·min－1離心10 min，分離上層血清，－80℃保存。實驗結(jié)束后，用日立全自動生化儀一次全部測定完畢。

2.5 主動脈粥樣硬化病變面積定量 各組給藥結(jié)束后，小鼠經(jīng)乙醚麻醉后開胸，以滅菌PBS液（0.01 mol·L－1，pH＝7.2）經(jīng)心室灌流5 min后，分離主動脈根部和升主動脈，OCT包埋，制作厚6μm冰凍切片。從第1張血管腔及主動脈瓣可見處開始留取切片，每只鼠連續(xù)切80張。每5張抽取1張切片（共16張）作油紅O染色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。組織切片在40倍顯微鏡下攝取圖像，參照文獻(xiàn)［3－4］的方法作病變面積定量分析，用Image Pro Plus 6.0（Media Cybernetics，USA）軟件分析斑塊面積，計算斑塊面積占血管總面積之比。

Fig 2 Protocol for feeding and administration of CDAE

2.6 平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的測定

2.6.1 原代平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng) 大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的培養(yǎng)參照文獻(xiàn)報道的方法［4］，取180～200 g♂ SD大鼠，脫臼處死后浸泡在75%酒精中消毒片刻，無菌條件下迅速取出胸主動脈，放入D-Hanks液中沖洗，去除血管周圍結(jié)締組織，刮除血管內(nèi)膜，剝離出中膜，在青霉素小瓶中剪成約1 mm×1 mm碎塊，加入0.25%膠原蛋白酶I，置入37℃搖床中，消化過夜。將消化好的組織塊1 000 r·min－1離心10 min，倒去上清液，加入20%FCS的DMEM培養(yǎng)基，吹打混勻后，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每3 d換液1次。選用4～6代的細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞通過形態(tài)學(xué)及α-SM actin免疫組織化學(xué)方法鑒定。

2.6.2 VSMC增殖反應(yīng)的測定 采用MTT法。取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入0.1 ml含大鼠VSMC的培養(yǎng)液（細(xì)胞數(shù) 1.0×108·L－1），在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，換為含CDAE的培養(yǎng)液，使其終濃度為 12.5、6.25、3.125、1.56 g·L－1，繼續(xù)培養(yǎng)至24、48、72 h，分別于每孔加入20μl MTT（5 g·L－1，PBS），繼續(xù)孵育 4 h。棄上清，晾干后加入 100 μl DMSO，震蕩15 min后用酶標(biāo)儀檢測（波長570 nm），按文獻(xiàn)方法［5］計算抑制率。

2.6.3 VSMC遷移能力的測定 采用Transwell小室法［6－7］。在 Boyden小室中下層加入200μl含有趨化因子 PDGF-BB的 DMEM培養(yǎng)基，給藥組為PDGF-BB加不同濃度的CDAE，陰性對照組為單純DMEM培養(yǎng)基。VSMC經(jīng)胰酶消化后計數(shù)，配制成1.0×108·L－1。將200μl細(xì)胞懸液加入 Boyden小室上層中，中間置以孔徑8μm的聚碳酸酯膜，37℃孵育4 h后，吸棄多余培養(yǎng)液，使用棉棒仔細(xì)去除聚碳酸酯膜上的未遷移細(xì)胞，D-hanks液清洗2次，用無水乙醇固定10 min，蘇木精染色10 min，蒸餾水沖洗。將濾膜置載玻片（下室面朝上），以中性樹膠封片，在顯微鏡下（200×）隨機計數(shù)5個視野中的細(xì)胞數(shù)，實驗重復(fù)3次。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS16.0軟件，根據(jù)資料要求進(jìn)行方差分析。

3 結(jié)果

3.1 給藥前后對動物體重的影響 各組給藥前后均稱量體重，對照組、CDAE低、中、高劑量組的體重分別為（20.64±1.14）g、（21.04±0.95）g、（21.65±0.60）g、（21.38±1.40）g，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理各組間差異無顯著性（P＞0.05），說明CDAE給藥后對小鼠體重?zé)o明顯影響。同時，對各組小鼠的攝食情況觀察表明，對照組和3個給藥組小鼠攝食和飲水均正常，活潑程度亦未見明顯差異。

3.2 給藥前后血脂各項指標(biāo)的變化 實驗結(jié)束后采集小鼠血液，離心分離血清，測定各組小鼠血清脂質(zhì)水平（Tab 1）。結(jié)果表明，與對照組比較，3個給藥組血清中TC、TG、LDL-C含量均有一定下降（Tab 1），TC值 CDAE中劑量組差異有顯著性（P＜0.01），TG含量在CDAE低、中劑量組下降較明顯（P＜0.01），LDL-C值 CDAE低、中、高劑量組均有明顯下降（低、高劑量組，P＜0.05；中劑量組 P＜0.01），HDL-C值中劑量組差異有顯著性（P＜0.01）。

3.3 給藥后對動脈粥樣硬化病變面積的影響ApoE-／-小鼠于6周齡開始給予高脂負(fù)荷飼料至18周齡，誘導(dǎo)晚期動脈粥樣硬化病變的形成。從第12周齡起，分別給予低、中、高劑量的CDAE，空白對照組給予溶劑，至第18周時處死小鼠，取主動脈弓組織制作病理切片，計算病變面積比率。實驗結(jié)果表明，CDAE低、中、高劑量組與空白對照組相比較，動脈粥樣硬化斑塊面積均見減少（Fig 3）。定量分析表明，CDAE低、中、高劑量組的病變面積比率分別（24.2±2.4）%、（20.1±2.9）%、（17.3±4.3）%，對照組為（25.8±3.7）%。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，CDAE中、高劑量組病變面積與對照組比較差異有顯著性（P＜0.05，P＜0.01），而低劑量組與對照組比較則無明顯差異（P＞0.05）。

Fig 3 Cortex dictamni aqueous extracts inhibit advanced atherosclerosis in ApoE-deficient mice（n＝8）

3．4 CDAE對大鼠VSMC增殖影響 實驗結(jié)果表明，與空白對照組比較，CDAE在給藥濃度為12.5 g·L－1時，對VSMC的增殖呈現(xiàn)出明顯的抑制作用，當(dāng)CDAE濃度達(dá)50 g·L－1時，細(xì)胞的抑制率分別達(dá)到89%，97%和82%。可以看出，隨著CDAE濃度的增高，對VSMC增殖的抑制作用不斷增強（Tab 2）。

3.5 CDAE對大鼠VSMC遷移的影響 考察了在PDGF誘導(dǎo)下，大鼠VSMC平滑肌遷移的情況，設(shè)陰性對照組、PDGF誘導(dǎo)組和CDAE組進(jìn)行觀察。結(jié)果表明，PDGF能明顯誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的遷移，PDGF誘導(dǎo)組與陰性對照組比較，細(xì)胞遷移數(shù)從（25.6±6.3）個增加為（44.8±9.4）個，含 12.5 g·L－1CDAE培養(yǎng)基的細(xì)胞遷移數(shù)為（28.1±7.1）個。CDAE組與 PDGF誘導(dǎo)組間差異有顯著性（P＜0.01），說明CDAE在體外條件下對平滑肌細(xì)胞遷移有明顯的抑制作用。

Tab 1 Comparison of serum lipid contents in mice of 4 groups（ˉx±s，n＝8）

Tab 2 Absorbing value of various groups

4 討論

迄今的研究表明，白鮮皮具有明顯的抗心肌缺血［8］、抗炎［9－10］、抑制免疫反應(yīng)［11－12］的作用，這一系列的作用與動脈粥樣硬化的發(fā)病機制具有密切的關(guān) 聯(lián) 性［13］。 筆 者 前 期 研 究 表 明［2］，CDAE 對ApoE-／-小鼠早期動脈粥樣硬化的形成具有明顯的抑制作用。與其他干預(yù)動脈粥樣硬化的藥物不同的是，CDAE在抑制早期動脈粥樣硬化病變形成的同時，對血脂水平并無明顯的影響，而明顯升高血清抗氧化酶的活性，并降低人血清LDL的氧化易感性。

本實驗繼續(xù)觀察了CDAE對ApoE-／-小鼠晚期動脈粥樣硬化病變的影響。實驗結(jié)果表明，CDAE對晚期動脈粥樣硬化斑塊的形成同樣具有較強的抑制作用，并具有量效關(guān)系。與CDAE干預(yù)ApoE-／-小鼠早期動脈粥樣硬化病變形成機制不同的是，CDAE連續(xù)給藥后，血脂水平明顯下降，顯示CDAE可通過降低血脂水平而抑制晚期動脈粥樣硬化復(fù)雜病變的形成和發(fā)展。從給藥后對血脂各成分的抑制效果分析，CDAE連續(xù)給藥后，不僅對TC、TG、LDLC具有明顯的降低作用，而且提升了HDL-C水平，促進(jìn)了機體本身對于血中脂質(zhì)的代謝和利用。本實驗給藥仍采用前期研究中的小鼠給藥劑量（根據(jù)人用劑量換算），從抑制動脈粥樣硬化斑塊面積的效果上看體現(xiàn)了量效關(guān)系，但在降低血脂水平方面CDAE中劑量組效果非常明顯（P＜0.01），而高劑量組效果僅LDL-C有明顯下降，這與筆者在研究CDAE的長期毒性實驗中，大劑量給藥后肝臟ALT、Alkaline phosphatase指標(biāo)有所上升具有一定的關(guān)聯(lián)性（數(shù)據(jù)待發(fā)表），表明CDAE大劑量給藥后可能對肝臟功能有所影響。

研究表明，在動脈粥樣硬化晚期復(fù)雜病變形成機制中，血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）的增殖和遷移是病變過程中起著重要的作用因素。當(dāng)血管受損時，血管中膜的VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，由合成型轉(zhuǎn)變成收縮型，相對穩(wěn)定的細(xì)胞開始增生，從中膜遷移到內(nèi)膜，從而形成新生內(nèi)膜和動脈粥樣硬化斑塊病變。而內(nèi)膜損傷后，黏附、聚集的血小板釋放的血小板衍生生長因子 （platelet derived growth factor，PDGF）已被確認(rèn)與 VSMC增殖有關(guān)［14］。為了研究CDAE對晚期動脈粥樣硬化的作用機制，我們分離了大鼠主動脈弓的平滑肌細(xì)胞，探討了給藥對大鼠VSMC增殖和遷移的影響。結(jié)果表明，CDAE不同劑量對VSMC的增殖有一定的抑制作用，在不同時間節(jié)點上，給藥濃度和細(xì)胞生長的抑制率具有量效關(guān)系；同時，CDAE可以明顯降低平滑肌細(xì)胞的遷移數(shù)量。表明CDAE可能直接阻斷平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的信號傳導(dǎo)通路，從而減少ApoE-／-小鼠動脈粥樣硬化晚期復(fù)雜病變的形成。有關(guān)分子機制需進(jìn)一步深入研究。

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