HO—1對肺氣腫大鼠ICAM—1、MIP—2表達的影響

王恩光　李建強　吳軍芳等

[摘要] 目的 觀察HO-1對肺氣腫大鼠模型肺組織ICAM-1和MIP-2表達的影響。方法 復(fù)制肺氣腫大鼠模型，并用Hemin干預(yù)，收集BALF行細胞計數(shù)并分類檢查；采用免疫組織化法檢測大鼠支氣管肺組織HO-1、ICAM-1表達，ELISA方法檢測肺組織勻漿中MIP-2的含量。結(jié)果 與模型組比較，干預(yù)組肺組織中HO-1表達顯著增加（P<0.05）。肺氣腫組大鼠模型中不僅ICAM-1在支氣管肺組織的表達較干預(yù)組顯著增加（P<0.05），而且BALF中的白細胞計數(shù)和中性粒細胞計數(shù)均與ICAM-1表達呈顯著正相關(guān)（r=0.85、0.84，P均<0.01）；模型組肺組織勻漿中MIP-2含量較干預(yù)組明顯增加，而且BALF中的白細胞計數(shù)和中性粒細胞計數(shù)均與MIP-2含量呈顯著正相關(guān)（r=0.89、0.89， P均<0.01）。 結(jié)論 ICAM-1和MIP-2在肺氣腫中明顯增加，HO-1可降低ICAM-1、MIP-2的表達，這可能是HO-1在肺氣腫中抗炎反應(yīng)的作用機制之一。

[關(guān)鍵詞] 血紅素加氧酶-1；肺氣腫；ICAM-1；MIP-2

[中圖分類號] R563.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）11-0007-03

[Abstract] Objective To observe the effect of HO-1 on expressions of ICAM-1 and MIP-2 in lung tissue of rats with emphysema. Methods Established emphysema rat models and using Hemin to interven. BALF were collected to count the total and differential cell counts. HO-1 and ICAM-1 expressions in pulmonary tissues of rat were detected by immunohistochemistry. The content of MIP-2 in lung tissues was detected by ELISA. Results Compared to the emphysema group， the expression of HO-1 in control group were significantly positive（P<0.05）. The expression of ICAM-1 in lung of the emphysema group was significantly higher than those in control group （P<0.05） and was positively correlated with the leukocyte numbers and neutrophil in BALF in the model group（r=0.85， 0.84 respectively， P all <0.01）. The content of MIP-2 in lung tissues of the emphysema were significantly higher than those in control group（P<0.05）. In the model group， the leukocyte numbers and neutrophil in BALF were positively correlated with the levels of MIP-2 in lung tissues（r=0.89， 0.89 respectively， P all <0.01）. Conclusion HO-1 might significantly alleviate emphysema by inhibiting the expressions of ICAM-1 and MIP-2.

[Key words] Heme oxygenase-1； Emphysema； ICAM-1； MIP-2

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一種可以預(yù)防和治療的疾病，主要累及肺部，也是導致高致殘率和高致死率的一種常見呼吸系統(tǒng)慢性疾病[1]。其發(fā)病機制尚不完全清楚，一般認為COPD是以氣道的慢性炎癥為主要特征，由多種炎性細胞、細胞因子、炎癥介質(zhì)共同作用。血紅素加氧酶（HO）是血紅素分解代謝的限速酶，研究發(fā)現(xiàn)血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗增生的細胞保護效應(yīng)。目前對于HO-1在肺部疾病中作用的研究已有了突破性進展，研究證實血紅素加氧酶-1參與了COPD、肺動脈高壓、哮喘等的發(fā)生、發(fā)展[2-4]。有研究表明吸煙可誘導COPD患者氣管平滑肌細胞HO-1表達增加[5]，HO-1對氧化應(yīng)激的異常反應(yīng)可能與COPD的發(fā)生有關(guān)，小鼠肺組織腺病毒介導的HO-1 cDNA 轉(zhuǎn)染能明顯減輕其彈力蛋白誘導的肺氣腫[6]。Yamada等[7]研究發(fā)現(xiàn)，HO-1基因的多態(tài)性與肺氣腫易感性相關(guān)。這表明HO-1在COPD的發(fā)病過程中具有一定的保護作用，但目前其機制尚不完全清楚。本研究通過干預(yù)肺氣腫大鼠HO-1表達，觀察其病理變化并檢測大鼠支氣管肺組織細胞間黏附分子1（ICAM-1）的表達和肺組織勻漿巨噬細胞炎癥蛋白2（MIP-2）的含量，探討ICAM-1和MIP-2與肺氣腫發(fā)病機制的關(guān)系；通過觀察HO-1對ICAM-1、MIP-2的影響，探討其在肺氣腫防治中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 動物與主要試劑

雄性Wistar大鼠（山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供）18只，體重（200±20）g，HO-1抗體（美國Abcam公司），ICAM-1抗體（武漢博士德公司），MIP-2酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（武漢博士德公司）。

1.2 動物分組與造模

8周齡健康雄性Wistar大鼠18只，適應(yīng)性飼養(yǎng)兩周，隨機分為3組，每組各6只：①正常未暴露組（對照組）；②煙霧暴露組（模型組），將大鼠放入自制的玻璃箱中，每日用點燃的猴王牌香煙（焦油11 mg/支）熏約10 min，掀開箱蓋休息5 min，重復(fù)煙霧暴露，每日2次上述煙霧暴露，每周5 d，連續(xù)20周；③Hemin+煙霧暴露組（干預(yù)組），在每周首次煙霧暴露前24 h開始腹腔注射Hemin 25 μmol/kg，連續(xù)3 d，而對照組和模型組均用等毫升生理鹽水腹腔注射。20周時同時處死3組實驗動物取材做相關(guān)檢測。

1.3 BALF的白細胞計數(shù)及分類計數(shù)

實驗動物用戊巴比妥麻醉固定，處死，開胸，游離出雙肺及氣管，結(jié)扎右主支氣管，用5 mL注射器從氣管下部注入生理鹽水3 mL反復(fù)灌洗3次，回收率在80%以上。使用毛細吸管吸取新鮮制備混勻的 BALF，在顯微鏡下行白細胞計數(shù)。剩余的BALF立即在4℃下離心（2000 rpm，8 min），離心后取沉渣物涂片，采用瑞氏染色法按細胞形態(tài)學行細胞分類計數(shù)。

1.4 肺組織標本制作

取大鼠右肺上葉肺組織，置于10%甲醛液中固定，石蠟包埋后行HE染色，并行病理形態(tài)學觀察和免疫組化檢測。取右肺下葉肺組織，研磨成勻漿，行酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測。

1.5 肺組織中HO-1和ICAM-1的檢測

用免疫組化SP法檢測肺組織HO-1表達水平的變化，采用SABC法檢測支氣管肺組織ICAM-1表達水平的變化，操作步驟按試劑盒說明書進行。陰性對照標本以PBS緩沖液作為一抗。以肺組織中出現(xiàn)棕黃色或棕黃色顆粒作為陽性結(jié)果，用BI-2000 醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)檢測HO-1、ICAM-1光密度值。

1.6 MIP-2的檢測

采用ELISA法測定肺組織勻漿MIP-2的含量。

1.7 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS16.0進行統(tǒng)計分析，結(jié)果均以（x±s）表示，均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗法，相關(guān)性檢驗用直線相關(guān)分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BALF白細胞計數(shù)及分類

2.2大鼠支氣管及肺組織病理學檢查

光鏡下觀察：對照組支氣管上皮細胞排列整齊，管壁及周圍無明顯炎癥變化；肺氣腫模型組各級支氣管纖毛柱狀上皮細胞部分變性、壞死，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁變薄、破壞，肺泡腔擴大，肺泡間隔變薄或斷裂；干預(yù)組上述改變均有不同程度的減輕。見封三圖1。

2.3 肺組織HO-1的免疫組織化表達

正常對照組大鼠肺組織可見胞質(zhì)內(nèi)少許HO-1弱陽性表達的細胞。肺氣腫模型組HO-1的表達較對照組明顯增加（P<0.05）；與模型組比較，干預(yù)組肺組織中HO-1表達顯著增加（P<0.05）。見表2。

2.4 支氣管肺組織ICAM-1的免疫組織化學染色結(jié)果

肺氣腫模型組肺組織表達高水平ICAM-1蛋白，肺組織呈棕黃色，表達于肺微血管內(nèi)皮、肺泡細胞以及支氣管上皮細胞，肺氣腫模型組可見ICAM-1蛋白表達較正常對照組增加，染色變深。Hemin干預(yù)組中大鼠ICAM-1蛋白表達較肺氣腫模型組顯著降低（P<0.05），但仍比正常對照組高（P<0.05）。見表2。

2.5 肺組織勻漿中MIP-2含量

與對照組比較模型組MIP-2含量明顯增加（P<0.05）；干預(yù)組MIP-2含量較模型組減少，但仍高于對照組（P<0.05）。見表2。

2.6 肺氣腫模型組數(shù)據(jù)間相關(guān)性分析

BALF中的白細胞計數(shù)和中性粒細胞計數(shù)均與ICAM-1表達呈明顯正相關(guān)（r=0.85、0.84， P均<0.01）；同時BALF中的白細胞計數(shù)和中性粒細胞計數(shù)與MIP-2含量呈顯著正相關(guān)（r=0.89、0.89， P均<0.01）。

3 討論

COPD 的發(fā)病是一種復(fù)雜的病理過程，迄今為止其發(fā)病機制尚未完全清楚，雖然許多研究表明COPD的發(fā)生、發(fā)展是由多種機制參與，但目前多數(shù)研究者認為慢性氣道炎癥是最主要的發(fā)病機制。

HO-1在大多數(shù)組織中呈低水平表達，當受到高氧、熱休克、內(nèi)毒素、過氧化氫、細胞因子等刺激時可產(chǎn)生高水平表達。研究顯示，在應(yīng)激狀態(tài)下，HO-1通過調(diào)控促炎細胞因子和抗炎細胞因子釋放，起到保護臟器功能的作用[8，9]。本實驗通過Hemin誘導HO-1的表達，觀察其病理學改變及肺組織ICAM-1表達與肺組織勻漿中MIP-2含量，以探討HO-1對肺氣腫的保護作用及其作用機制。本實驗結(jié)果顯示，與模型組比較，干預(yù)組HO-1表達明顯升高，肺泡及肺間質(zhì)病變明顯減輕，同時BALF中白細胞、中性細胞數(shù)目明顯減少， 說明血紅素加氧酶對煙霧暴露誘導的肺氣腫具有明顯的保護作用。

ICAM-1是細胞黏附分子的免疫球蛋白超家族，為76～114kD的單鏈糖蛋白，其配體為巨噬細胞黏附分子-1、淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1，兩者均屬于β2整合素，ICAM-1與β2整合素的黏附是白細胞跨越血管內(nèi)皮轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵[10]，也是白細胞在氣道聚集的必要條件[11]。

實驗發(fā)現(xiàn)，肺氣腫模型組支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞及支氣管肺組織微小血管內(nèi)皮細胞ICAM-1表達水平明顯高于正常對照組（P<0.05），BALF中的白細胞、中性粒細胞數(shù)量與肺組織中ICAM-1的表達呈顯著正相關(guān)（r=0.85、0.84，P<0.01），這與黃玲媚等[12]研究一致，表明ICAM-1與肺氣腫氣道內(nèi)炎癥細胞的聚集、浸潤有關(guān)。本實驗Hemin干預(yù)組肺組織中ICAM-1表達水平低于模型組，張全等[13]在急性肺損傷研究中發(fā)現(xiàn)HO-1可通過阻斷NF-κB激活的信號通路減少ICAM-1的表達，說明HO-1能通過下調(diào)肺內(nèi)ICAM-1的表達增加，對肺臟起保護作用。

研究發(fā)現(xiàn)，一些特異性的趨化因子在白細胞聚集與活化的炎癥反應(yīng)過程中起重要作用。MIP-2是分子量6kD的堿性蛋白質(zhì)，由“α”和“β”兩種蛋白質(zhì)亞單位組成，其cDNA編碼有100個氨基酸，成熟的蛋白質(zhì)有73個氨基酸殘基。MIP-2由巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞等分泌，屬于趨化性細胞因子中C-X-C亞家族成員。MIP-2可通過自身的肝素結(jié)合位點促進白細胞與內(nèi)皮細胞外基質(zhì)中硫酸乙酰的葡聚糖相互作用，加強白細胞與內(nèi)皮細胞的黏附[14]。MIP-2通過對炎癥細胞的化學趨化和活化作用而參與炎癥的全過程，特異靶細胞為中性粒細胞，對其他炎癥細胞作用微弱。

實驗發(fā)現(xiàn)，模型組肺組織勻漿中MIP-2顯著高于對照組（P<0.05），且肺組織勻漿中MIP-2含量與BALF中的白細胞數(shù)及中性粒細胞數(shù)呈顯著正相關(guān)（r=0.89、0.89，P<0.01），這與羅曼等[15]在COPD大鼠模型中的研究結(jié)果相一致。提示MIP-2通過對中性粒細胞的特異性趨化作用促進中性粒細胞在肺氣腫大鼠氣管、肺組織中的聚集、活化；說明MIP-2通過作用于中性粒細胞誘導了氣道炎癥和肺組織損傷，參與了肺氣腫發(fā)病。干預(yù)組肺組織勻漿中MIP-2含量均較模型組減低，這與Minamino等[16]在低氧性肺損傷研究中高表達HO-1的肺組織MIP-2水平顯著下降結(jié)果相一致，表明血紅素加氧酶-1可通過其抗炎能力減少肺內(nèi)MIP-2生成，從而減輕肺部炎性損傷，起一定的保護作用。

綜上所述，本實驗證實HO-1的抗炎作用，其機制可能為通過某種途徑減少ICAM-1和MIP-2的產(chǎn)生，進而干預(yù)炎癥細胞的聚集、浸潤、活化，這或許是其減輕肺組織損傷、起到對肺臟的保護作用機制之一；但其具體作用機制尚不清楚，需更進一步研究。

[參考文獻]

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（收稿日期：2014-01-07）

研究發(fā)現(xiàn)，一些特異性的趨化因子在白細胞聚集與活化的炎癥反應(yīng)過程中起重要作用。MIP-2是分子量6kD的堿性蛋白質(zhì)，由“α”和“β”兩種蛋白質(zhì)亞單位組成，其cDNA編碼有100個氨基酸，成熟的蛋白質(zhì)有73個氨基酸殘基。MIP-2由巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞等分泌，屬于趨化性細胞因子中C-X-C亞家族成員。MIP-2可通過自身的肝素結(jié)合位點促進白細胞與內(nèi)皮細胞外基質(zhì)中硫酸乙酰的葡聚糖相互作用，加強白細胞與內(nèi)皮細胞的黏附[14]。MIP-2通過對炎癥細胞的化學趨化和活化作用而參與炎癥的全過程，特異靶細胞為中性粒細胞，對其他炎癥細胞作用微弱。

實驗發(fā)現(xiàn)，模型組肺組織勻漿中MIP-2顯著高于對照組（P<0.05），且肺組織勻漿中MIP-2含量與BALF中的白細胞數(shù)及中性粒細胞數(shù)呈顯著正相關(guān)（r=0.89、0.89，P<0.01），這與羅曼等[15]在COPD大鼠模型中的研究結(jié)果相一致。提示MIP-2通過對中性粒細胞的特異性趨化作用促進中性粒細胞在肺氣腫大鼠氣管、肺組織中的聚集、活化；說明MIP-2通過作用于中性粒細胞誘導了氣道炎癥和肺組織損傷，參與了肺氣腫發(fā)病。干預(yù)組肺組織勻漿中MIP-2含量均較模型組減低，這與Minamino等[16]在低氧性肺損傷研究中高表達HO-1的肺組織MIP-2水平顯著下降結(jié)果相一致，表明血紅素加氧酶-1可通過其抗炎能力減少肺內(nèi)MIP-2生成，從而減輕肺部炎性損傷，起一定的保護作用。

綜上所述，本實驗證實HO-1的抗炎作用，其機制可能為通過某種途徑減少ICAM-1和MIP-2的產(chǎn)生，進而干預(yù)炎癥細胞的聚集、浸潤、活化，這或許是其減輕肺組織損傷、起到對肺臟的保護作用機制之一；但其具體作用機制尚不清楚，需更進一步研究。

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[16] Minamino T， Christou H， Hsieh CM， et al. Targeted expression of heme oxygenase-1 prevents the pulmonary inflammatory and vascular responses to hypoxia[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2001，98（15）：8798-8803.

（收稿日期：2014-01-07）

研究發(fā)現(xiàn)，一些特異性的趨化因子在白細胞聚集與活化的炎癥反應(yīng)過程中起重要作用。MIP-2是分子量6kD的堿性蛋白質(zhì)，由“α”和“β”兩種蛋白質(zhì)亞單位組成，其cDNA編碼有100個氨基酸，成熟的蛋白質(zhì)有73個氨基酸殘基。MIP-2由巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞等分泌，屬于趨化性細胞因子中C-X-C亞家族成員。MIP-2可通過自身的肝素結(jié)合位點促進白細胞與內(nèi)皮細胞外基質(zhì)中硫酸乙酰的葡聚糖相互作用，加強白細胞與內(nèi)皮細胞的黏附[14]。MIP-2通過對炎癥細胞的化學趨化和活化作用而參與炎癥的全過程，特異靶細胞為中性粒細胞，對其他炎癥細胞作用微弱。

實驗發(fā)現(xiàn)，模型組肺組織勻漿中MIP-2顯著高于對照組（P<0.05），且肺組織勻漿中MIP-2含量與BALF中的白細胞數(shù)及中性粒細胞數(shù)呈顯著正相關(guān)（r=0.89、0.89，P<0.01），這與羅曼等[15]在COPD大鼠模型中的研究結(jié)果相一致。提示MIP-2通過對中性粒細胞的特異性趨化作用促進中性粒細胞在肺氣腫大鼠氣管、肺組織中的聚集、活化；說明MIP-2通過作用于中性粒細胞誘導了氣道炎癥和肺組織損傷，參與了肺氣腫發(fā)病。干預(yù)組肺組織勻漿中MIP-2含量均較模型組減低，這與Minamino等[16]在低氧性肺損傷研究中高表達HO-1的肺組織MIP-2水平顯著下降結(jié)果相一致，表明血紅素加氧酶-1可通過其抗炎能力減少肺內(nèi)MIP-2生成，從而減輕肺部炎性損傷，起一定的保護作用。

綜上所述，本實驗證實HO-1的抗炎作用，其機制可能為通過某種途徑減少ICAM-1和MIP-2的產(chǎn)生，進而干預(yù)炎癥細胞的聚集、浸潤、活化，這或許是其減輕肺組織損傷、起到對肺臟的保護作用機制之一；但其具體作用機制尚不清楚，需更進一步研究。

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（收稿日期：2014-01-07）