小劑量氯吡格雷聯(lián)合丹皮酚抗血小板聚集研究

孫愛華，周碧蓉

氯吡格雷是血小板聚集抑制劑，被廣泛用于血栓和動脈粥樣硬化等心腦血管疾病的治療［1］。臨床資料［2］表明:氯吡格雷可以明顯降低血栓發(fā)生率，減少動脈粥樣硬化的發(fā)生，但其在腸道吸收受P－糖蛋白干擾［3］，治療給藥存在一定抵抗現(xiàn)象，療效不穩(wěn)定;同時常規(guī)用藥所致胃腸道出血和肝腎功能損傷等不良反應(yīng)發(fā)生頻率較高［4］，且嚴(yán)重程度往往呈現(xiàn)出一定劑量依耐性［5］，從而限制其臨床應(yīng)用。丹皮酚是牡丹干燥根皮的活性成分，可抑制血小板聚集［6］，也可抑制 P-糖蛋白［7］活性，提示氯吡格雷和丹皮酚聯(lián)合給藥可能具有協(xié)同效應(yīng)。故該研究初步考察小劑量氯吡格雷聯(lián)合丹皮酚給藥抗血小板聚集作用是否優(yōu)于單用氯吡格雷，旨在為二者臨床聯(lián)合給藥提供一定實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑 硫酸氯吡格雷片，25 mg/片，深圳信立泰藥業(yè)，批號:20090312;丹皮酚(宣城百草植物工貿(mào)有限公司，純度99%，批號:100321);氯吡格雷和丹皮酚臨用前均用0.5%羧甲基纖維素鈉溶解;二磷酸腺苷二鈉(adenosine diphosphate，ADP)，上海伯奧生物技術(shù)有限公司，批號:20100430。

1.2 實驗儀器 GL20A高速冷凍離心機:湖南儀器儀表總廠離心機廠;PHS-2C酸度計:上海理達(dá)儀器廠;AA-200DS電子分析天平:Denver儀器公司;LBY-NJ2血小板凝聚儀:北京普利生公司;－80℃超低溫冰箱:美國 Advantage公司;SYS-MEX XT-1800i全自動血液自動分析裝置:日本KOBE公司。

1.3 實驗動物與分組 SD大鼠，雄性，體重(240±20)g，清潔級;昆明種小鼠，雄性，體重(20±2)g;實驗動物均由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。實驗大鼠隨機分為5組，分別為正常組、丹皮酚組(50 mg/kg)、小劑量氯吡格雷組(3 mg/kg)、氯吡格雷常規(guī)劑量組(6 mg/kg)和氯吡格雷(3 mg/kg)+丹皮酚(50 mg/kg)聯(lián)合給藥組;實驗小鼠隨機分為5組，分別為正常組、丹皮酚組(70 mg/kg)、小劑量氯吡格雷組(4.5 mg/kg)、氯吡格雷常規(guī)劑量組(9 mg/kg)和氯吡格雷(4.5 mg/kg)+丹皮酚(70 mg/kg)聯(lián)合給藥組。各給藥組每天灌胃1次，連續(xù)給藥1周，正常組大鼠和小鼠給予等體積溶媒。

1.4 實驗方法［8］

1.4.1 大鼠血小板聚集抑制率 SD大鼠40只隨機分為5組，實驗前12 h禁食不禁水。各給藥組末次給藥2 h后，腹主動脈取血，枸櫞酸鈉溶液(3.8%)與血液按照1∶9混合，800 r/min離心10 min，獲得富含血小板血漿;3 000 r/min離心10 min制備貧血小板血漿。調(diào)整富血小板血漿中血小板濃度為(600～700)×109個/L，按照比濁法，應(yīng)用血小板聚集儀，貧血小板血漿調(diào)零后，在攪拌情況下，加入血小板誘導(dǎo)劑ADP，測定血小板最大聚集率，并計算各組的血小板聚集抑制率，血小板聚集抑制率=(正常組聚集率－給藥組聚集率)×100%/正常組聚集率。

1.4.2 大鼠動－靜脈旁路血栓 SD大鼠40只隨機分為5組。各組末次給藥2 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠(30 mg/kg)，仰臥位固定。分離右頸總動脈和左頸外靜脈，用肝素鈉生理鹽水溶液(50 U/ml)灌注聚乙烯插管，聚乙烯插管(內(nèi)置手術(shù)線，長6 cm)一段插入左頸外靜脈，另一端插入右頸總動脈，打開動脈夾，開放血流并記錄時間，血流從動脈流經(jīng)聚乙烯管回到靜脈，等15 min血栓形成后阻斷血流，迅速取出手術(shù)線，稱量血栓濕重(總重量減去手術(shù)線重量即為濕重)，血栓在室溫下干燥后測量干重。

1.4.3 小鼠血常規(guī)、出血和凝血時間 昆明種小鼠50只隨機分為5組，實驗前12 h禁食不禁水。各組末次給藥2 h后，將小鼠尾尖部剪斷5 mm并將尾巴放入含有10 ml生理鹽水的試管中(37℃水浴保溫)，保持尾尖端在液面下1.5 cm，記錄停止出血時間，小鼠腹主動脈抽血300 ml測定血常規(guī)，拔出針頭，使血液自動流出，用棉球輕輕拭去第一滴血，再分別滴血于清潔載玻片的兩端，血滴直徑為0.5～1.0 cm，開始用秒表計時，2 min后，每隔30 s用潔凈的注射劑針頭自血滴邊緣向里輕輕挑動1次，到針頭能挑起纖維白絲為止，記錄所需時間，即為凝血時間。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)以±s表示。組間差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett’s C檢驗。

2 結(jié)果

2.1 小劑量氯吡格雷聯(lián)合丹皮酚給藥對大鼠血小板聚集的影響 各組連續(xù)7 d給藥后能夠明顯降低大鼠最大血小板聚集率(P＜0.01);小劑量氯吡格雷抗血小板聚集活性明顯強于丹皮酚組(P＜0.05)，聯(lián)合給藥組抑制大鼠血小板聚集作用明顯強于氯吡格雷常規(guī)劑量組(6 mg/kg)和丹皮酚組(P＜0.05，P ＜0.01)。見圖1A。

2.2 小劑量氯吡格雷聯(lián)合丹皮酚給藥對大鼠動－靜脈旁路血栓形成影響 與正常組比較，各給藥組能明顯減少大鼠血栓濕重和干重(P＜0.01);小劑量氯吡格雷組對血栓形成的抑制能力明顯強于丹皮酚組(P＜0.05)，聯(lián)合給藥組抗血栓作用明顯強于氯吡格雷小劑量組(3 mg/kg)、氯吡格雷常規(guī)劑量組(6 mg/kg)和丹皮酚組(P ＜0.05，P ＜0.01)，見圖1B、表1。

圖1 小劑量氯吡格雷聯(lián)合丹皮酚給藥對大鼠血小板聚集影響 (n=8，±s)

2.3 小劑量氯吡格雷聯(lián)合丹皮酚給藥對小鼠出血、凝血時間和血常規(guī)影響 各給藥組均能明顯延長小鼠出血時間(P＜0.01)，但對凝血時間沒有明顯影響;小劑量氯吡格雷(4.5 mg/kg)組出血時間明顯長于丹皮酚組(P＜0.01)，聯(lián)合給藥組延長出血時間作用明顯強于氯吡格雷(9 mg/kg)組和丹皮酚組(P ＜0.05，P ＜0.01);此外，和其他各組相似，聯(lián)合給藥組對小鼠血常規(guī)無明顯影響，提示聯(lián)合給藥對小鼠血液系統(tǒng)影響較小，安全性較高。見表2。

表1 小劑量氯吡格雷聯(lián)合丹皮酚給藥對大鼠動－靜脈旁路血栓形成影響(n=8，±s)

表1 小劑量氯吡格雷聯(lián)合丹皮酚給藥對大鼠動－靜脈旁路血栓形成影響(n=8，±s)

與正常組比較:＊＊P＜0.01;與氯吡格雷(3 mg/kg)組比較:★★P＜0.01;與氯吡格雷(6 mg/kg)組比較:#P＜0.05;與丹皮酚組比較:△P＜0.05，△△P ＜0.01

?

表2 小劑量氯吡格雷聯(lián)合丹皮酚給藥對小鼠出血、凝血時間和血常規(guī)影響(n=10，±s)

表2 小劑量氯吡格雷聯(lián)合丹皮酚給藥對小鼠出血、凝血時間和血常規(guī)影響(n=10，±s)

與正常組比較:＊＊P＜0.01;與氯吡格雷(9 mg/kg)組比較:#P＜0.05;與丹皮酚組比較:△△P＜0.01

?

3 討論

氯吡格雷屬于前體藥物，在腸道吸收后，約有85%被肝臟羧酸酯酶［9］轉(zhuǎn)化成無活性代謝物，剩下15%借助肝藥酶CYP1A2、CYP2C19和 CYP2B6代謝成中間體2-氧化-氯吡格雷，該中間體被CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4和 CYP3A5等酶代謝成活性代謝物R-130964。R-130964可抑制血小板ADP受體與ADP結(jié)合，阻止ADP介導(dǎo)纖維蛋白原與糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受體結(jié)合，從而抑制血小板相互聚集。

目前氯吡格雷已被廣泛用于心腦血管疾病的治療，但常規(guī)劑量［2］存在較為突出的消化道不良反應(yīng)和明顯的抵抗現(xiàn)象［4］，主要表現(xiàn)在部分患者對藥物敏感性低甚至無反應(yīng)。Prabhakaran et al［2］發(fā)現(xiàn)氯吡格雷標(biāo)準(zhǔn)劑量下給藥，患者發(fā)生抵抗比例高達(dá)51.9%，該現(xiàn)象與患者體內(nèi)血小板聚集抑制率明顯低于正常反應(yīng)者有關(guān)［10］。研究［3］顯示氯吡格雷抵抗現(xiàn)象除與肝藥酶編碼基因和ADP受體基因多態(tài)性、體內(nèi)藥物相互作用以及胰島素抵抗等因素有關(guān)之外，還與其腸道吸收受P-糖蛋白干擾有關(guān)。Taubert et al［11］利用Caco-2細(xì)胞模型證實氯吡格雷是P-糖蛋白作用底物，隨后Lee et al［12］研究也發(fā)現(xiàn)P-糖蛋白抑制劑環(huán)孢素A與氯吡格雷聯(lián)合給藥明顯提高氯吡格雷在大鼠體內(nèi)生物利用度，這些研究提示腸道上皮細(xì)胞吸收的氯吡格雷部分被P-糖蛋白重新外排至腸腔，造成原型藥進入肝臟代謝以及活性代謝物含量水平相應(yīng)減少。

臨床研究［13］表明氯吡格雷負(fù)荷劑量從300 mg提高到600 mg可提高患者血漿中活性代謝物含量，部分改善抵抗現(xiàn)象，但當(dāng)劑量增至900 mg時，體內(nèi)活性代謝物含量以及抵抗現(xiàn)象與600 mg比較差異無顯著性，提示單純提高給藥劑量并不能很好改善抵抗現(xiàn)象。另外，目前臨床采用的氯吡格雷和阿司匹林聯(lián)合給藥雖然可以短期內(nèi)提高療效，但存在消化道不良反應(yīng)發(fā)生頻率升高危險。研究［14］顯示阿司匹林長期應(yīng)用可誘導(dǎo)多藥耐藥基因MDR1表達(dá)并抑制氯吡格雷在腸道吸收。丹皮酚來源于中藥牡丹根皮，安全性高，具有抗血小板活性。已有研究［6，15］表明丹皮酚抗血小板聚集的作用機制與氯吡格雷不同。一方面，丹皮酚抗血小板聚集活性與阻斷血小板膜上Ca2+通道，抑制Ca2+內(nèi)流并降低血小板內(nèi)Ca2+濃度水平有關(guān);另一方面，丹皮酚抑制花生四烯酸代謝，降低血栓素A2含量，是其抗血小板聚集活性重要機制之一。此外，丹皮酚還可抑制P-糖蛋白活性［7］。因此該研究初步考察小劑量氯吡格雷和丹皮酚的協(xié)同效應(yīng)。氯吡格雷治療栓塞性心血管疾病臨床推薦劑量為(75 mg/d)，折算成大鼠和小鼠的等效劑量近似為6 mg/kg和9 mg/kg。該研究顯示丹皮酚抗血小板聚集活性弱于小劑量氯吡格雷，但兩者聯(lián)合給藥的抗血小板聚集活性卻明顯強于氯吡格雷常規(guī)劑量組，提示聯(lián)合給藥組強大的抗血小板聚集活性可能主要與丹皮酚抑制腸道P-糖蛋白表達(dá)，改變氯吡格雷在大鼠體內(nèi)的吸收以及代謝過程有關(guān)，具體機制有待進一步研究闡明。

綜上所述，小劑量氯吡格雷和丹皮酚聯(lián)合給藥抗血小板聚集活性明顯強于氯吡格雷，兩者聯(lián)合給藥具有良好的臨床應(yīng)用前景。

［1］許 克，余昌俊，余康敏，等.下肢動脈硬化閉塞癥藥物治療過程中CD62P、CD63的改變及其意義［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，46(7):693 －5.

［2］Prabhakaran S，Wells K R，Lee V H，et al.Prevalence and risk factors for aspirin and clopidogrel resistance in cerebrovascular stenting［J］.AJNR Am J Neuroradiol，2008，29(2):281 －5.

［3］Luchessi A D，Silbiger V N，Cerda A，et al.Increased clopidogrel response is associated with ABCC3 expression:a pilot study［J］.Clin Chim Acta，2012，413(3 －4):417 －21.

［4］Leontiadis G I，Yuan Y，Howden C W.The interaction between proton pump inhibitors and clopidogrel and upper gastrointestinal bleeding［J］.Gastrointest Endosc Clin N Am，2011，21(4):637－56.

［5］Lortie E，Girard F，Boudreault D，et al.Clopidogrel induces an acute hemostatic deficit and increases intra abdominal bleeding in rabbits［J］.Thromb Res，2009，123(6):869 －73.

［6］Zhang J Y，Cao Y X，Weng W L，et al.Paeonol induces vasodilatation in rat mesenteric artery via inhibiting extracellular Ca2+influx and intracellular Ca2+release［J］.Chin J Integr Med，2013，19(7):510－6.

［7］孫慧君，王曉琦，于麗敏，等.丹皮酚對MDR逆轉(zhuǎn)作用的研究［J］.解剖科學(xué)進展，2000，6(1):59 －62.

［8］魏 偉，吳希美，李元建.藥理學(xué)實驗方法學(xué)［M］.4版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2010:1068－71.

［9］Hagihara K，Kazui M，Kurihara A，et al.A possible mechanism for the differences in efficiency and variability of active metabolite formation from thienopyridine antiplatelet agents，prasugrel and clopidogrel［J］.Drug Metab Dispos，2009，37(11):2145 －52.

［10］李 磊，褚 俊.不同劑量氯吡格雷對急性冠脈綜合征患者的氯吡格雷抵抗及超敏C反應(yīng)蛋白、P選擇素水平的影響［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012，47(5):558 －61.

［11］Taubert D，von Beckerath N，Grimberg G，et al.Impact of P-glycoprotein on clopidogrel absorption ［J］.Clin Pharmacol Ther，2006，80(5):486－501.

［12］Lee J H，Shin Y J，Oh J H，et al.Pharmacokinetic interactions of clopidogrel with quercetin，telmisartan，and cyclosporine A in rats and dogs［J］.Arch Pharm Res，2012，35(10):1831 －7.

［13］von Beckerath N，Taubert D，Pogatsa-Murray G，et al.Absorption，metabolization，and antiplatelet effects of 300-，600-，and 900-mg loading doses of clopidogrel:results of the ISAR-CHOICE(Intracoronary Stenting and Antithrombotic Regimen:Choose Between 3 High Oral Doses for Immediate Clopidogrel Effect)Trial［J］.Circulation，2005，112(19):2946 －50.

［14］Jung K H，Chu K，Lee S T，et al.Prolonged use of aspirin alters human and rat intestinal cells and thereby limits the absorption of clopidogrel［J］.Clin Pharmacol Ther，2011，90(4):612 －9.

［15］Lin H C，Ding H Y，Ko F N，et al.Aggregation inhibitory activity of minor acetophenones from Paeonia species［J］.Planta Med，1999，65(7):595－9.