野黃芩素及其葡萄糖醛酸結(jié)合物在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究

劉 躍，黃 勇，董永喜，王永林，鄭 林

（貴陽醫(yī)學(xué)院1.藥學(xué)院貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、2.民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州貴陽 550004）

野黃芩苷為中藥燈盞花制劑的主要有效成分，作為治療心腦血管疾病的有效藥物廣泛應(yīng)用于臨床。野黃芩素（seutellarein）又稱燈盞乙素苷元，為野黃芩苷的主要代謝產(chǎn)物［1－2］。Chen等［3］研究了野黃芩苷口服給藥的人體藥動學(xué)，推斷野黃芩苷被腸道菌群及酶水解為苷元而吸收。居文政等［4］實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在吸收入血前，胃腸道內(nèi)野黃芩苷與其苷元并存，且苷元易于吸收。上述研究結(jié)果與黃芩苷等黃酮苷類成分口服后在腸道菌群作用下發(fā)生完全或部分水解，其藥理作用被認(rèn)為是通過代謝產(chǎn)物苷元吸收所產(chǎn)生的研究報(bào)道相符合［5－7］。車慶明等［2］對野黃芩素即燈盞乙素苷元的藥動學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，野黃芩素被吸收后，在體內(nèi)易發(fā)生葡萄糖醛酸化形成葡萄糖醛酸結(jié)合物。因此，野黃芩素及其葡糖糖醛酸化產(chǎn)物均可能為野黃芩苷的體內(nèi)有效形式。

中藥不少成分在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為有效的代謝物而發(fā)揮藥理作用，而了解這些代謝成分在體內(nèi)的動態(tài)過程也相當(dāng)重要［2］。目前對于野黃芩素的藥動學(xué)研究較少，且對于野黃芩素體內(nèi)主要存在形式葡萄糖醛酸結(jié)合物的藥動學(xué)研究未見報(bào)道。本文采用酶水解方式，以UPLC-MS／MS法檢測并研究了大鼠靜脈給予野黃芩素后，野黃芩素及其代謝產(chǎn)物葡萄糖醛酸結(jié)合物的藥動學(xué)過程，為全面評價(jià)野黃芩素的體內(nèi)過程和野黃芩苷及其苷元系列藥物的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥品試劑 葛根素（puerarin，批號0752-9605）購自中國食品藥品檢定研究院，野黃芩素（Scutellarein）實(shí)驗(yàn)室自制（純度＞95%），甲醇（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）、乙腈（德國Merck公司）為色譜純，β-Glucuronidase from Helix pomatia（Type H-2，aquecous solution，≥85 000 kU·L－1，CAS：9001－45－01，Sigma），其余溶劑均為分析純，水為超純水。

1.2 儀器設(shè)備 Acquity系統(tǒng)超高液相色譜－三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司，包括二元梯度泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、三重四級桿質(zhì)譜分析器和Masslynx4.1質(zhì)譜工作站），ZH-2渦旋混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠），Allegra 64R低溫高速離心機(jī)（美國 Beckma公司），MTN-2800D氮吹濃縮裝置（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)動物 健康Wistar大鼠♀♂兼用，體質(zhì)量為（330±20）g，由貴陽醫(yī)學(xué)院動物中心提供，動物許可證號SCXK（黔）2002－0001。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

2.1.1 野黃芩素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱取野黃芩素9.4 mg，用甲醇定容至10 ml，獲得野黃芩素（0.94 g·L－1）的儲備液。量取野黃芩素對照品儲備液適量，用甲醇按梯度稀釋成所需濃度，得系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。置冰箱（－20℃）保存，備用。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取葛根素10.33 mg，用甲醇定容至 25 ml，獲得葛根素（0.4132 g·L－1）的儲備液。取內(nèi)標(biāo)儲備液適量至5 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成20 mg·L－1的內(nèi)標(biāo)溶液，置冰箱（－20℃）保存，備用。

2.2 色譜條件 色譜柱：Waters BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）柱，保護(hù)柱：Waters Van Guard BEH C18（2.1 mm×5 mm，1.7μm），流動相：0.1%甲酸乙腈（A）－0.1%甲酸水（B），梯度洗脫（0～2.5 min，10%A；2.5～3 min，30%→90%A；3～4min，90%→ 10%A），流速：0.35 ml· min－1，柱溫：45℃，進(jìn)樣體積為1μl。

2.3 質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離源，正離子模式（ESI＋），毛細(xì)管電離電壓3 kV，離子源溫度120℃；噴霧氣與反吹氣：N2，去溶劑氣流速：650 L·h－1，去溶劑氣溫度：350℃，反吹氣流速為50 L·h－1；碰撞氣：Ar，碰撞氣流速：0.16 ml·min－1，掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM），質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及處理軟件為MassLynx V4.1工作站。野黃芩素及內(nèi)標(biāo)用于定量分析的監(jiān)測離子反應(yīng)分別為m／z 286.9→122.9；m／z 417.0→267.0。

2.4 樣品處理

2.4.1 原型藥物濃度的血漿樣品的處理 取大鼠血漿100μl，置塑料離心管中，依次加入0.4%Vc溶液50μl，旋渦30 s，依次加入內(nèi)標(biāo)葛根素溶液20 μl（20 mg·L－1），50μl 1%甲酸，400μl甲醇，渦混30 s，超聲5 min，15 000 r·min－1離心5 min，上清液吹干后400μl甲醇復(fù)溶，離心，取上清液進(jìn)樣分析。

2.4.2 水解后藥物濃度的血漿樣品的處理 取大鼠血漿100μl，置塑料離心管中，依次加入0.4%Vc溶液50μl，10μlβ-葡萄糖醛酸酶（8 500 kU·L－1，溶劑為蒸餾水）旋渦30 s，37℃溫孵30 min，冰浴冷卻，依次加入內(nèi)標(biāo)葛根素溶液20μl（20 mg·L－1），50μl 1%甲酸，400μl甲醇，渦混30 s，超聲 5 min，15 000 r·min－1離心5min，上清液吹干后400μl甲醇復(fù)溶，離心，取上清液進(jìn)樣分析。

2.5 方法考察

2.5.1 專屬性考察 取大鼠空白血漿100μl，除不加標(biāo)液外，其余按“2.4樣品處理”項(xiàng)下方法操作，獲得空白樣品色譜圖A；將一定濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)加溶液入空白血漿，依同法操作，獲得相應(yīng)色譜圖B；取大鼠給藥后血漿，依法操作得相應(yīng)色譜圖C。野黃芩素及內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為2.42、1.07，由Fig 1可以看出，成分間分離良好，未見血漿中雜質(zhì)干擾。

Fig 1 Chromatogram of（A）blank solution，（B）blank solution spiked w ith standands and（C）real sam ple

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備和LLOD 取準(zhǔn)溶液50μl至離心管中，48℃下N2吹干，依次加入0.4%Vc溶液50μl，大鼠空白血漿100μl，配制成相當(dāng)于大鼠血漿藥物濃度為 28.20、9.400、3.133、1.044、0.3480、0.1160 mg·L－1的血漿樣品，其余按“2.4樣品處理”項(xiàng)下操作，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以待測物的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比（A／Ai）為縱坐標(biāo)Y，各物質(zhì)濃度（C）為橫坐標(biāo)X進(jìn)行直線回歸，權(quán)重系數(shù)為1／X，求得直線方程，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。野黃芩素最低檢測限（LLOD）定義為 S／N≥3。結(jié)果表明大鼠血漿中野黃芩素在其線性范圍內(nèi)（0.1160～28.20）線性關(guān)系良好（r≥0.999）。典型大鼠標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝0.286169X－0.03704。最低定量限（LLOQ）為0.1160 mg·L－1，其回收率為 104.7±6.2（n＝6）。最低檢測限為0.035 mg·L－1。

Fig 2 Concentration-time curves for scutellarein and its conjugate formation after intravenous adm inistration of 12 mg· kg－1 of scutellarein to rat（n＝5）

2.5.3 準(zhǔn)確度和精密度 按“2.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)下分別配制野黃芩素大鼠血漿低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)量控制樣品（QC），每一個(gè)濃度進(jìn)行5樣本分析，3種濃度連續(xù)測定5 d，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)進(jìn)行。根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品的濃度，與配制濃度對照，將QC樣品的結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，求得本方法的精密度與準(zhǔn)確度。對3個(gè)濃度下大鼠血漿的日內(nèi)和日間精密度進(jìn)行了考察，結(jié)果表明野黃芩素日內(nèi)和日間精密度RSD（%）小于4%，準(zhǔn)確度范圍為93.7%～105.3%，提示該方法準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好。

2.5.4 基質(zhì)效應(yīng)考察 取空白血漿100μl，除不加對照溶液與內(nèi)標(biāo)外，其余按“2.4樣品處理”項(xiàng)下操作，向獲得的上清液中加入低、中、高濃度的對照溶液50μl和內(nèi)標(biāo)20μl，渦流混合，48℃氮?dú)獯蹈?。殘留物?00μl甲醇溶解，每個(gè)濃度進(jìn)樣5次，獲得相應(yīng)峰面積；另取上述低、中、高濃度的對照溶液50μL與內(nèi)標(biāo)20μl（溶劑均為甲醇），加甲醇稀釋至400μl。每個(gè)濃度進(jìn)樣5次，獲得相應(yīng)峰面積，提取后的峰面積與之相比，比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果野黃芩素和內(nèi)標(biāo)結(jié)果比值均在90%和110%之間，表明均不存在明顯基質(zhì)效應(yīng)。

2.5.5 提取回收率測定 取大鼠空白血漿100μl，按“2.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)下配制大鼠血漿低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)量控制樣品（QC），每一個(gè)濃度進(jìn)行5樣本分析，以400μl甲醇溶解，記錄其峰面積。另取空白血漿，按“2.4.1樣品處理”項(xiàng)下操作。離心后獲得上清液，加入與上述相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（每一個(gè)濃度進(jìn)行5樣本分析），于48℃氮?dú)獯蹈桑?00μl甲醇溶解，獲得相應(yīng)峰面積值。經(jīng)測定野黃芩素線性范圍內(nèi)低、中、高3個(gè)濃度的血漿樣品提取回收率分別為：（84.4±7.6）%、（81.5±2.8）%、（90.5±3.0）%。內(nèi)標(biāo)的提取回收率為97.3%。

2.5.6 穩(wěn)定性考察 按“2.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)下配制大鼠血漿低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)量控制樣品（QC），在0 h、12 h分別進(jìn)樣，以考察處理后血漿樣品中野黃芩素在自動進(jìn)樣器條件下的穩(wěn)定性，以每一濃度5樣本分析。此外，實(shí)驗(yàn)還考查了低、中、高3個(gè)QC濃度血漿樣品在室溫（約20℃）下放置6 h，4℃下冷藏12 h和凍融3次的穩(wěn)定性。經(jīng)測定，各成分所得到的峰面積與零時(shí)間點(diǎn)的偏差均在10%以內(nèi)，提示實(shí)驗(yàn)條件下血漿樣品穩(wěn)定性良好。

2.6 實(shí)驗(yàn)方案與樣品檢測 健康Wistar大鼠6只，♂鼠，體質(zhì)量為（330±20）g。給藥劑量為12 mg·kg－1，給藥前12 h禁食，自由飲水。尾靜脈注射野黃芩素溶液，于給藥前與給藥后 5、10、15、20、30、40、60、80、100 min經(jīng)眼底靜脈叢取血約 0.4 ml置涂有肝素和Vc（1%）的塑料離心管中，5 000 r·min－1離心3 min，分離血漿于－20℃冰箱中保存，直至分析。

樣品測定方法按“2.4樣品處理”項(xiàng)進(jìn)行，每批次生物樣品測定隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線。在每批測定時(shí)隨行測定低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品（QC），每個(gè)濃度的QC樣品進(jìn)行雙樣本分析。根據(jù)每一分析批的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品和未知樣品的濃度。

3 結(jié)果

大鼠靜脈注射野黃芩素12 mg·kg－1后，通過溫和酶解方式，將野黃芩素的代謝產(chǎn)物葡萄糖醛酸結(jié)合物轉(zhuǎn)化為野黃芩素，然后以扣除原型本底方式間接求取野黃芩素葡萄糖醛酸結(jié)合物血漿濃度，野黃芩素及其葡萄糖醛酸結(jié)合物的平均血藥濃度－時(shí)間曲線見圖 2。采用DAS2.0軟件計(jì)算藥動學(xué)參數(shù)，見Tab 1。C-t曲線結(jié)果表明大鼠靜脈給予野黃芩素后，原型進(jìn)入體內(nèi)后能快速轉(zhuǎn)化為其葡萄糖醛酸結(jié)合物，除5 min外，各時(shí)間點(diǎn)大鼠血漿中葡萄糖醛酸結(jié)合型藥物濃度明顯高于原型。野黃芩素及其葡萄糖醛酸結(jié)合物均符合二室開放模型；由分布相半衰期、消除相半衰期結(jié)果可知，原型及其結(jié)合物在體內(nèi)的分布行為較為接近；但消除半衰期差異較大（P＜0.05），結(jié)合物消除較慢可能與其分子極性和分子量大于母體苷元而導(dǎo)致跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)受阻有關(guān)。其余藥動學(xué)參數(shù)無差異（P＞0.05），表明兩者在體內(nèi)有相似的分布及清除行為；AUC參數(shù)提示野黃芩素在體內(nèi)很大部分轉(zhuǎn)化為其葡萄糖醛酸結(jié)合物，以結(jié)合形式作為其主要存在形式。

Tab 1 Main pharmacokinetic parameters after intravenous adm inistration of 12 mg·kg－1 of scutellarein to ra

Tab 1 Main pharmacokinetic parameters after intravenous adm inistration of 12 mg·kg－1 of scutellarein to ra

*P＜0.05 vs scutellarein

Pharmacokinetic parameters Scutellarein Glucuronided scutellarin T 4.10±0.64 4.34±2.40 T 12α／min 12β／min 26.16±10.28 40.31±5.13*V1／L· kg－1 0.77±0.07 1.07±0.73 CL／L· min－1· kg－1 0.065±0.006 0.064±0.023 AUC（0－100 min）／mg· min· L－1 131.22±13.67 155.44±57.86 AUC（0－∞）／mg· min· L－1184.82±18.40 209.45±74.53

4 討論

現(xiàn)階段中藥藥代動力學(xué)研究多以藥物母體形式為研究對象，往往忽視藥物在進(jìn)入體內(nèi)后其代謝產(chǎn)物的藥動學(xué)變化規(guī)律，這種忽略有可能會對藥物的動力學(xué)甚至是藥理、毒理評價(jià)帶來偏倚。黃酮類化合物擁有廣泛的生物學(xué)和藥理學(xué)活性，這類化合物在血漿中主要以葡萄糖醛酸的結(jié)合形式存在［8］。因此，在研究黃酮類藥物原型成分藥動學(xué)過程的同時(shí)，應(yīng)考慮對其代謝產(chǎn)物藥動學(xué)過程的分析。但由于藥物代謝產(chǎn)物在生物樣本中濃度較低且大多缺乏供定量檢測用的標(biāo)準(zhǔn)對照品，極大限制了藥物代謝產(chǎn)物的體內(nèi)過程研究。

前期研究表明，野黃芩素及其主要代謝產(chǎn)物葡萄糖醛酸結(jié)合物在體內(nèi)并存，因此本研究采取專屬溫和的酶解方式，將結(jié)合物轉(zhuǎn)化為野黃芩素，然后以扣除原型本底方式間接求取野黃芩素葡萄糖醛酸結(jié)合物血漿濃度。運(yùn)用此方法獲知野黃芩素及其葡萄糖醛酸結(jié)合物的體內(nèi)經(jīng)時(shí)變化過程，初步闡明了野黃芩素及其主要代謝產(chǎn)物的動態(tài)變化規(guī)律。本研究以酶解間接測定野黃芩素代謝物，在一定程度上解決了代謝物定量缺乏標(biāo)準(zhǔn)對照品的難題，拓展了藥代動力學(xué)研究的手段。

本實(shí)驗(yàn)還考察了酶解條件，研究結(jié)果表明，當(dāng)酶濃度為85 unit、酶解30 min時(shí)，樣品中野黃芩素葡萄糖醛酸結(jié)合物完全水解為野黃芩素。且在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，野黃芩素在血漿中有少量降解現(xiàn)象，通過參考有關(guān)文獻(xiàn)［9］，在血漿樣品制備時(shí)，加入了一定量的Vc溶液以確保樣品制備過程中的穩(wěn)定。

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