SHIP2通過上調(diào)Bim表達增強胃癌細胞BGC-823對紫杉醇的敏感性

葛燕梅，葉 艷，張林杰

（安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院免疫學教研室，安徽合肥 230032）

抗微管藥物紫杉醇作為一種化療藥物應用于胃癌的治療，其主要殺傷機制在于能夠誘導胃癌細胞凋亡。Bim（Bcl-2 interacting mediator of cell death）是 BH3-only（Bcl-2 homology 3（BH3）-only）蛋白家族中促凋亡成員之一，被報道在多種腫瘤細胞凋亡過程中發(fā)揮了重要作用［1］。目前研究認為抗微管化療藥物作用于腫瘤細胞可通過上調(diào)Bim活性，誘導細胞凋亡［2－3］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Bim僅僅在對紫杉醇敏感的細胞系中表達上調(diào)，而在相對不敏感的細胞系BGC-823中表達沒有明顯變化［4－5］。因此，針對化療藥物相對不敏感的細胞株，是否能通過外源性分子的作用上調(diào)Bim的表達以增強其對化療藥物的敏感性，值得進一步的研究探討。已有研究表明PI3K／Akt信號通路在腫瘤細胞對化療藥物抵抗中發(fā)揮重要作用，而SHIP2（SH2 domain containing inositol 5-phosphatase 2）分子是肌醇5－磷酸酶家族成員之一，可以通過水解PI（3，4，5）P3的第5位磷酸導致 PI（3，4）P2形成，從而阻斷Akt及其下游效應分子的有效活化，負向調(diào)節(jié)PI3K／Akt信號通路［6－7］。而作為 Akt下游靶分子之一的轉錄因子FoxO3可以在轉錄水平調(diào)節(jié)Bim的轉錄表達［8］。本研究在前期研究的基礎上，采用脂質(zhì)體轉染pCMV6-SHIP2，同時聯(lián)合抗微管化療藥物紫杉醇的作用，以期了解外源性SHIP2分子的過表達是否能增強BGC-823對紫杉醇的敏感性，并進一步探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 SGC-7901及BGC-823細胞購自中科院上海細胞庫。DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶購自Gibco公司；小牛血清購自杭州四季青公司。小鼠抗人SHIP2抗體，小鼠抗人Bim抗體購自Santa Cruz公司，兔抗人pAkt（Ser473）抗體，兔抗人Akt抗體購自Cell Signaling公司。小鼠抗人β-actin抗體及辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗小鼠IgG抗體，羊抗兔IgG抗體購自武漢博士德公司。LipofectamineTM2000脂質(zhì)體購自Invitrogen公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）購自 Sigma公司。逆轉錄試劑盒購自TaKaRa公司，Bim引物由上海生工生物有限公司合成。pCMV6-SHIP2載體購自Origene公司。GV112-Puromycin-Bim慢病毒顆粒由上海吉凱基因化學技術有限公司構建和包裝。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉染 BGC-823細胞在含10%的小牛血清、1%雙抗的高糖 DMEM培養(yǎng)基，5%CO2，37℃，飽和濕度溫箱培養(yǎng)，細胞呈貼壁生長。取對數(shù)生長期的BGC-823細胞分別接種于相應培養(yǎng)板（6孔板接種細胞數(shù)4×105／孔，24孔板接種細胞數(shù)1×105／孔）。待細胞生長到80%～90%融合時，棄去原液換成含10%小牛血清無抗生素的高糖DMEM培養(yǎng)基，應用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000分別包裹SHIP2真核表達載體（pCMV6-SHIP2）和空載體（pCMV6），瞬時轉染BGC-823細胞，同時設置未轉染任何質(zhì)粒的BGC-823細胞作為空白對照。

1.2.2 GV112-Puromycin Bim慢病毒顆粒感染細胞及穩(wěn)定細胞株的篩選 取對數(shù)生長期的BGC-823細胞接種于24孔板，接種密度為4×105／孔。待細胞生長到50%～60%融合時，棄上清，加入GV112-Puromycin-Bim慢病毒顆粒，同時加入終濃度為8 mg·L－1的凝聚胺（Polybrene）以促進感染。實驗分為3組：空白對照組、GV112-Puromycin陰性對照組和GV112-Puromycin-Bim實驗組。分別于8、24 h后更換為普通培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。5 d后，分別收集細胞蛋白和RNA，Western blot和qRT-PCR分別檢測Bim蛋白和mRNA的變化以明確感染效果。然后，將細胞傳代至含1 mg·L－1嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，進行陽性克隆篩選。感染細胞經(jīng)嘌呤霉素篩選，1周后空白對照組細胞全部死亡，陰性對照組和實驗組細胞部分死亡，繼續(xù)嘌呤霉素篩選培養(yǎng)，2周后陰性對照組和實驗組細胞出現(xiàn)增殖，3周后收集嘌呤霉素陽性的細胞克隆，擴大培養(yǎng)，分別為GV112-Puromycin陰性對照細胞（BGC-823·ControlshRNA）和GV112-Puromycin-Bim慢病毒顆粒感染的穩(wěn)定細胞（BGC-823·Bim-shRNA）。

1.2.3 蛋白免疫印跡實驗（Western blot） 收集細胞，加入50μl細胞總蛋白裂解液，冰上裂解30 min，然后4℃14 000×g離心30 min后取上清液，此為細胞總蛋白。用BCA法進行蛋白定量后，加入等體積的2×SDS凝膠上樣緩沖液，煮沸3 min使蛋白變性。取30μg的蛋白在不同濃度的SDS-PAGE凝膠中電泳，再轉移至硝酸纖維素膜上，用含質(zhì)量濃度為50 g·L－1脫脂奶粉的TBST封閉2 h，一抗4℃孵育過夜后，TBST洗3次，每次10 min，再加HRP標記的相應二抗（1∶5 000），室溫孵育1h，TBST洗3次，每次10 min。ECL顯色，天能全自動凝膠數(shù)碼成像系統(tǒng)照相并分析結果。用等量β-actin蛋白上樣作為對照。

1.2.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR） 用TRIzol法提取不同時間點的BGC-823細胞的總RNA，并進行質(zhì)量鑒定。按照逆轉錄試劑盒說明，冰上操作將不同時間點的RNA逆轉錄成cDNA。再以逆轉錄出的cDNA為模板建立反應體系（20μl）。Bim引物序列：5′-GCC CCT ACC TCC CTA CAG AC-3′（上游），5′-ATG GTG GTG GCC ATA CAA AT-3′（下游）。反應條件為Stage1：預變性：95℃ 10 s；Stage2：PCR反應：95℃ 5 s，60℃ 30 s，共 40個循環(huán)，所有PCR實驗均以同時擴增β-actin為內(nèi)參對照。反應結束后，用ABIStepOne Plus PCR System軟件分析，繪制PCR定量標準曲線，計算出目的基因的Ct值，由于Ct值代表基因的起始拷貝數(shù)，因此可根據(jù)Ct值比較基因的表達量。各目的基因表達水平的差異比較：相對含量（relative quantification，RQ）＝2－△△Ct?！鳌鰿t＝（Ct處理組目的基因－ Ct處理組內(nèi)參基因）－（Ct對照組目的基因－Ct對照組內(nèi)參基因）。mRNA水平以 RQ表示。

1.2.5 PI染色流式細胞術檢測細胞凋亡率 收集經(jīng)紫杉醇作用后的細胞上清，用預冷PBS洗滌2次，低速離心棄上清，每孔加入750μl PI（5 mg PI、0.1 g枸櫞酸鈉、100 ml ddH2O、100μl Triton X-100）37℃避光作用20 min后收集細胞，4℃避光過夜。次日上流式細胞儀（FASCalibur）檢測。每組實驗重復3次。結果用WinMDI 2.9軟件分析，亞二倍體峰（subG1）所占的比例即細胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)的錄入和分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件。實驗數(shù)據(jù)采用ˉx±s表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2．1 紫杉醇誘導胃腺癌細胞凋亡和Bim的表達選用 0.3μmol·L－1紫杉醇在不同時點（0、8、16、24、36、48 h）分別處理 SGC-7901和 BGC-823細胞，并對其細胞凋亡率進行檢測，發(fā)現(xiàn)0.3μmol·L－1紫杉醇誘導 SGC-7901 48 h凋亡率為（54.2±0.8）%，而 BGC-823 48 h凋亡率僅為（25.6±1.6）%（Fig 1A），說明BGC-823細胞對紫杉醇誘導的凋亡不敏感。同時用Western blot和實時熒光定量PCR反應分別檢測0.3μmol·L－1紫杉醇作用BGC-823一系列時點（0、8、16、24、36、48 h）的 Bim蛋白和mRNA的變化水平，發(fā)現(xiàn)隨紫杉醇作用時間延長，相對不敏感細胞株BGC-823中Bim蛋白和mRNA表達均無明顯變化（Fig 1B，C）。

Fig 1 Paclitaxel-induced apoptosis and the expression of Bim in gastric cancer cellsA：Paclitaxel（0.3μmol·L－1）induces apoptosis in BGC-823 and SGC-7901 cells at different time points；B：The expression level of Bim protein in BGC-823 cells treated with paclitaxel at different time points；C：The expression level of Bim mRNA in BGC-823 cells treated with paclitaxel at different time points.

2．2 過表達SHIP2可上調(diào)Bim蛋白的表達，增強BGC-823細胞對紫杉醇的敏感性 在相對不敏感細胞株BGC-823中轉染pCMV6-SHIP2質(zhì)粒，以未轉染細胞和轉染空載體（pCMV6）細胞作為對照組，24 h后收集蛋白，Western blot檢測 SHIP2、pAkt、Akt和Bim蛋白的變化，實時熒光定量PCR反應檢測Bim mRNA的變化水平。結果顯示過表達SHIP2，降低了Akt的磷酸化水平，并且上調(diào)了Bim的表達（Fig 2A）；同時，過表達SHIP2時，Bim mRNA的水平明顯升高（Fig 2B）。加入0.3μmol·L－1紫杉醇誘導48 h，流式細胞儀檢測細胞凋亡顯示轉染pCMV6-SHIP2的實驗組細胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（Fig 2C）。

Fig 2 The effect of SHIP2 over-expression on paclitaxel-induced apoptosis in BGC-823 cellsA：The expression level of SHIP2，pAkt，Akt and Bim proteins in BGC-823 cells after transfection of pCMV6-SHIP2 plasmid；B：The expression level of Bim mRNA in BGC-823 cells after transfection of pCMV6-SHIP2 plasmid；C：Paclitaxel induced apoptosis in BGC-823 cells after transfection of pCMV6-SHIP2 plasmid.**P＜0.01 vs pCMV6＋Paclitaxel.

2．3 GV112-Puromycin-Bim慢病毒顆粒有效干擾BGC-823細胞內(nèi)Bim的表達 采用GV112-Puromycin-Bim慢病毒顆粒感染BGC-823細胞，分別用Western blot和實時熒光定量PCR反應檢測Bim蛋白和mRNA的變化水平。結果顯示Bim蛋白（Fig 3A）和mRNA的水平均明顯降低（Fig 3B），說明GV112-Puromycin Bim慢病毒顆粒感染BGC-823細胞，能有效干擾BGC-823細胞內(nèi)Bim的表達。

Fig 3 The effect of infecting w ith GV112-purom ycin Bim lentivirus particles on the expression of Bim in BGC-823 cellsA：The expression level of Bim protein in BGC-823 cells after infecting with GV112-Puromycin Bim lentivirus particles；B：The expression level of Bim mRNA in BGC-823 cells after infectingwith GV112-Puromycin Bim lentivirus particles.

2．4 過表達SHIP2可明顯降低紫杉醇誘導BGC-823·Bim-shRNA細胞的凋亡率 在BGC-823·Bim-shRNA和BGC-823·Control-shRNA（實驗方法“1.2.2”中篩選的穩(wěn)定細胞株）中，分別轉染pCMV6-SHIP2 24 h后，加入 0.3μmol·L－1紫杉醇誘導48 h，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。結果顯示：紫杉醇誘導BGC-823·Control-shRNA細胞48 h后凋亡率為（50.8±0.9）%，而在 BGC-823·Bim-shRNA中凋亡率明顯下降，僅為（27.6±1.6）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（Fig 4），提示過表達 SHIP2分子增強BGC-823對紫杉醇的敏感性是通過上調(diào)Bim蛋白的表達來實現(xiàn)的。

3 討論

Fig 4 Paclitaxel induces apoptosis in BGC-823·control-shRNA and BGC-823·Bim-shRNA cells after transfection of pCMV6-SHIP2 plasm id**P＜0.01 vs BGC-823.control-shRNA：pCMV6-SHIP2＋Paclitaxel.

Bim是Bcl-2（B-cell leukemia-2）家族的促凋亡分子，廣泛表達于正常細胞，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及治療均有著密切的關系。紫杉醇作為臨床常用的腫瘤化療藥物之一，無論單用或聯(lián)合應用對于胃癌晚期的治療都顯示出較好的療效。通過特異地結合到小管的β位上，導致微管聚合成團塊和束狀并使其穩(wěn)定，抑制微管網(wǎng)的正常重組而達到抑制細胞增殖的作用［9］。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，在紫杉醇誘導的胃腺癌相對敏感細胞系SGC-7901凋亡中Bim蛋白表達水平呈增高趨勢，但是在對紫杉醇相對不敏感細胞系BGC-823中Bim的表達并沒有變化；Bim表達的上調(diào)與否是決定胃腺癌細胞對紫杉醇誘導其凋亡敏感性的分子機制之一，Bim的表達水平與紫杉醇誘導相對敏感細胞系SGC-7901細胞凋亡成正相關［4－5］。本研究在既往研究的基礎上，進一步探討能否通過上調(diào)Bim蛋白的表達以增強相對不敏感細胞BGC-823對紫杉醇的敏感性。

PI3K／Akt信號通路已被證實是多種腫瘤細胞生存和增殖中重要的信號通路之一。在腫瘤細胞逃避抗癌藥物的殺傷過程中，PI3K／Akt信號通路可能起了極其重要的作用，因此PI3K／Akt信號通路有望成為惡性腫瘤治療的新靶點。有研究表明抑制PI3K／Akt信號通路能提高胃癌細胞對化療藥物的敏感性［10］。活化的Akt可以通過磷酸化轉錄因子FoxO3，進而發(fā)揮抗凋亡作用，而Bim在轉錄水平可以被FoxO3因子調(diào)控，活化的FoxO3結合于Bim基因的啟動子區(qū)域從而促進Bim的轉錄表達［11］。研究已經(jīng)證實SHIP2能水解PI（3，4，5）P3第5位磷酸形成 PI（3，4）P2，從而阻斷 Akt及其下游效應分子的有效活化［12］。已證實轉錄因子FoxO3是Akt的下游靶分子之一，Akt活性的降低可通過 Akt／FoxO3／Bim通路上調(diào) Bim的表達［8］。

本研究通過轉染 SHIP2 cDNA，發(fā)現(xiàn)過表達SHIP2可下調(diào)Akt的活性，并上調(diào)Bim的表達。在BGC-823中轉染pCMV6-SHIP2質(zhì)粒后加入紫杉醇誘導48 h，細胞凋亡率明顯上升。而在BGC-823·Bim-shRNA中，轉染pCMV6-SHIP2質(zhì)粒后加入紫杉醇誘導48 h，發(fā)現(xiàn)細胞凋亡率明顯降低，抑制了過表達SHIP2的BGC-823細胞對紫杉醇的增敏作用。說明過表達SHIP2能增強BGC-823對紫杉醇的敏感性，而這種作用是通過上調(diào)Bim蛋白的表達來實現(xiàn)的。

本研究在一定程度上證實了可通過相關外源性分子負向調(diào)控PI3K／Akt信號通路以上調(diào)Bim蛋白的表達，從而增強相對不敏感胃癌細胞株對紫杉醇的敏感性，這為如何提高胃癌細胞對化療藥物的敏感性提供了新的思路。

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