大黃酚對鉛中毒小鼠免疫功能的影響

張 季，嚴(yán)春臨，侯 勇，王 樹，張丹參，薛貴平，董曉華

（1.河北北方學(xué)院藥學(xué)系，河北 張家口 075000，2.河北科技大學(xué)，河北 石家莊 050018）

鉛（lead，Pb）是一種常見的工業(yè)毒物和環(huán)境污染物，鉛中毒不僅可引起體內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化損傷，造成學(xué)習(xí)記憶障礙，而且鉛對動物的免疫系統(tǒng)有嚴(yán)重的損傷，削弱機(jī)體的抵抗力，增加機(jī)體對細(xì)菌、病毒感染的易感性和腫瘤的發(fā)生率［1－2］。研究表明，在體內(nèi)鉛能夠降低巨噬細(xì)胞的吞噬功能，使臟器指數(shù)下降，抑制 B淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、增生［3］。鉛可使白細(xì)胞數(shù)減少、白細(xì)胞的吞噬能力下降，引起外周B淋巴細(xì)胞減少，抑制細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-2（IL-2）、IL-4、IL-10以及干擾素 γ（IFN-γ）等細(xì)胞因子的產(chǎn)生［4－6］。大黃酚（chrysophanol，Chry）是從中藥大黃（rhubarb）中提取的蒽醌類化合物之一，具有改善學(xué)習(xí)記憶障礙、抗衰老等作用［7－9］。大黃酚能夠改善鉛中毒小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，清除鉛中毒小鼠體內(nèi)自由基，減少過氧化脂質(zhì)的生成，降低鉛中毒小鼠腦、肝、腎、脾等組織內(nèi)的鉛水平［10－11］。本課題主要研究大黃酚對鉛中毒小鼠的臟器指數(shù)、白細(xì)胞數(shù)、脾淋巴細(xì)胞增殖能力、NK細(xì)胞活性、吞噬細(xì)胞吞噬功能及血清中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ等指標(biāo)的影響，全面考察大黃酚對鉛中毒小鼠的免疫功能的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康、昆明種♂小鼠（SPF級），體質(zhì)量（20±2）g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。全部動物在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后用于實(shí)驗(yàn)，分籠飼養(yǎng)，自由飲食和飲水，室溫（20±2）℃。

1.2 藥品與試劑 大黃酚購自中國藥品生物制品檢定所，實(shí)驗(yàn)前用N，N二甲基甲酰胺溶解，吐溫－80助溶，再加入生理鹽水混勻，N，N-二甲基甲酰胺∶吐溫－80∶生理鹽水＝1∶1∶8；實(shí)驗(yàn)前用生理鹽水稀釋至所需濃度［7］；醋酸鉛購自天津化學(xué)試劑六廠；刀豆蛋白（coneanvalinA，ConA），脂多糖（lipopolysaceharides，LPS）、四甲基偶氮唑藍(lán)（5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT）均為 Sigma公司產(chǎn)品，RPMI 1640購自北京海克隆生物化學(xué)制品有限公司；IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，二甲基亞砜（DMSO）、中性紅購自天津市化學(xué)試劑一廠。

1.3 儀器 Safire2多功能酶標(biāo)儀：奧地利；ME235P型電子分析天平：北京賽多利斯儀器有限責(zé)任公司；Sigma-3K30高速冷凍離心：德國；JB-HS-1300超凈工作臺：蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；BC-J160S二氧化碳培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.4 分組與給藥 50只小鼠隨機(jī)為5組，每組10只，分別為溶媒組（control group）；鉛中毒組（模型組，model group）；大黃酚治療組（高、中、低劑量分別為 10.0、1.0、0.1 mg·kg－1）。模型制備：模型組和大黃酚治療組（Chry groups）每天腹腔注射（peritoneal injection，ip）7 mg·kg－1醋酸鉛溶液（10 ml·kg－1），連續(xù)腹腔注射8 d醋酸鉛溶液造成鉛中毒模型；溶媒組每天腹腔注射等量的生理鹽水，造成鉛中毒模型。造成鉛中毒模型后d 4開始給藥：大黃酚治療組腹腔注射相應(yīng)劑量的大黃酚（10 ml·kg－1）；溶媒組與模型組腹腔注射10 ml·kg－1溶劑（N，N-二甲基甲酰胺 ∶吐溫80∶生理鹽水＝1∶1∶8），每天 1次，連續(xù)給藥 14 d［10］。

1.5 取材與處理 d 14給藥1 h后，精密稱定小鼠體重，并記錄，眼球摘除取血法收集血液，分離血清凍存?zhèn)溆?，然后快速斷頸處死小鼠，將其浸入體積分?jǐn)?shù)為0.75的乙醇中2 min，用15 ml含肝素的冷PBS液灌洗腹腔，無菌條件吸取腹腔液5 ml用于腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的測定；于超凈工作臺取出胸腺、脾臟，并剝離周圍組織，用濾紙吸取周圍液體，分別精密稱定小鼠胸腺和脾臟的濕重，并將脾臟制成脾細(xì)胞懸液用于小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力和NK細(xì)胞活性測定［12］。

1.6 免疫指標(biāo)的測定

1.6.1 小鼠臟器指數(shù)及白細(xì)胞數(shù)的測定 利用小鼠胸腺和脾臟的濕重以及小鼠體重計(jì)算小鼠臟器指數(shù)，胸腺指數(shù)（TI）＝胸腺重量（mg）／小鼠體重（g），脾臟指數(shù)（SI）＝脾重量（mg）／小鼠體重（g）；用毛細(xì)管取20μl全血加入盛有0.38 ml白細(xì)胞稀釋液的試管中，混勻，溶血后輕輕震蕩2 min于顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.6.2 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力測定 用5 ml PBS液清洗脾臟去除血液，用濾紙吸去PBS，將脾臟轉(zhuǎn)移至200目篩網(wǎng)上，輕輕的用注射器芯頭將其研碎，并用PBS輕輕沖洗鋼網(wǎng)，制成脾細(xì)胞溶液，用于淋巴細(xì)胞增殖能力。取適量脾細(xì)胞溶液于1 000 r·min－1離心5 min，棄去上清液，添加紅細(xì)胞裂解液1 ml，30℃水浴 5 min后 2 000 r·min－1離心 5 min，用RPMI 1640培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋成2×109·L－1的細(xì)胞懸液。參考文獻(xiàn)［13］方法采用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測量各孔的吸光度值（A值）。并計(jì)算B淋巴細(xì)胞的增值能力及T淋巴細(xì)胞的增值能力。

1.6.3 小鼠NK細(xì)胞活性測定 以制備好的淋巴細(xì)胞懸液為效應(yīng)細(xì)胞，以K562細(xì)胞為靶細(xì)胞，靶細(xì)胞為復(fù)蘇傳代后收集的對數(shù)期K562細(xì)胞（細(xì)胞濃度為 4×108·L－1）。參照文獻(xiàn)［12－13］方法在 96孔培養(yǎng)板中設(shè)試驗(yàn)孔、靶細(xì)胞對照孔、效應(yīng)細(xì)胞對照孔，采用酶標(biāo)儀570 nm波長處測量各孔的吸光度值（A值），計(jì)算NK細(xì)胞活性。NK細(xì)胞活性／%＝靶細(xì)胞對照孔A－試驗(yàn)孔A－效應(yīng)細(xì)胞對照孔A）／靶細(xì)胞對照孔A×100%。

1.6.4 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能測定 采用中性紅比色法測定腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能，酶標(biāo)儀于540 nm測定其吸光度A540nm，并以A540nm為評價(jià)指標(biāo)［6］。

1.6.5 小鼠血清中 IFN-γ、IL-2、IL-4和 IL-10含量測定 參考文獻(xiàn)［13］方法，按照試劑盒說明以酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定血清中 IFN-γ、IL-2、IL-4和 IL-10含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)以表示，采用SPSS 14.0版本統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，組間比較采用F檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大黃酚對鉛中毒小鼠體重的影響 結(jié)果見Tab 1，結(jié)果表明各組小鼠體重在鉛中毒前并無明顯差異，染鉛14 d后，模型組小鼠體重明顯低于溶媒組，大黃酚治療組（1.0、10.0 mg·kg－1）小鼠體重明顯高于模型組小鼠體重。比較各組小鼠染鉛前后體重變化發(fā)現(xiàn)模型組與其他各組差異均有顯著性。

Tab 1 Influence of Chry on the weight of the lead poisoning m ice（ˉx±s，n＝10）

2.2 大黃酚對鉛中毒小鼠臟器指數(shù)和白細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響 與溶媒組小鼠比較鉛中毒模型組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和白細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯降低，大黃酚治療組（1.0、10.0 mg·kg－1）能明顯提高鉛中毒小鼠臟器指數(shù)和白細(xì)胞計(jì)數(shù)（P＜0.01）。大黃酚治療組（0.1 mg·kg－1）能明顯提高鉛中毒小鼠脾臟指數(shù)（P＜0.05），但對鉛中毒小鼠胸腺指數(shù)及白細(xì)胞計(jì)數(shù)并無明顯改善作用，結(jié)果見Tab 2。

2.3 大黃酚對鉛中毒小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響 與溶媒組小鼠相比，鉛中毒模型組B脾淋巴細(xì)胞增殖能力和T脾淋巴細(xì)胞增殖能力均明顯降低（P＜0.01），大黃酚治療組（1.0、10.0 mg·kg－1）可明顯提高鉛中毒小鼠B脾淋巴細(xì)胞增殖能力和T脾淋巴細(xì)胞增殖能力（P＜0.01），大黃酚治療組（0.1 mg·kg－1）可明顯提高鉛中毒小鼠B脾淋巴細(xì)胞增殖能力（P＜0.01）和T脾淋巴細(xì)胞增殖能力（P＜0.05），結(jié)果見 Tab 2。

2．4 大黃酚對鉛中毒小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力和NK細(xì)胞活性的影響 與溶媒組小鼠相比，鉛中毒模型組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力和NK細(xì)胞殺傷力均明顯降低（P＜0.01），大黃酚治療組（1.0、10.0 mg·kg－1）可明顯提高鉛中毒巨噬細(xì)胞吞噬能力和NK細(xì)胞殺傷力（P＜0.01），大黃酚治療組（0.1 mg·kg－1）可明顯提高鉛中毒小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力（P＜0.01）和 NK細(xì)胞殺傷力（P＜0.05），結(jié)果見Tab 2。

2．5 大黃酚對鉛中毒小鼠血清中 IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10含量的影響 與溶媒組相比鉛中毒模型組小鼠血清中 IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10含量均明顯降低（P＜0.01）；與模型組相比，大黃酚治療組（1.0、10.0 mg·kg－1）小鼠血清中 IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10均明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，大黃酚治療組（0.1 mg·kg－1）小鼠血清中 IFN-γ、IL-2、IL-4含量未見明顯變化（P＞0.05），僅IL-10含量明顯升高（P＜0.05），結(jié)果見 Tab 3。

3 討論

白細(xì)胞數(shù)目、臟器指數(shù)、NK細(xì)胞活性、吞噬細(xì)胞吞噬能力以及B、T脾淋巴細(xì)胞增殖能力都是反映機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)［14］。連續(xù)8 d腹腔注射7 mg·kg－1醋酸鉛溶液能夠明顯降低小鼠的免疫功能，主要表現(xiàn)為白細(xì)胞數(shù)目減少，臟器指數(shù)降低，出現(xiàn)明顯的胸腺和脾臟萎縮。研究發(fā)現(xiàn)鉛中毒小鼠B、T脾淋巴細(xì)胞增殖能力、NK細(xì)胞活性與吞噬細(xì)胞吞噬能力均明顯降低。鉛對T淋巴細(xì)胞增生和分化的影響，研究結(jié)果不盡相同，有研究表明鉛抑制了T淋巴細(xì)胞的增生和分化［15］；另有研究認(rèn)為鉛促進(jìn)了T淋巴細(xì)胞的增生和分化［16］，本課題研究發(fā)現(xiàn)鉛抑制了小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖能力，筆者認(rèn)為鉛對淋巴T細(xì)胞的增殖與分化的影響與鉛在動物體內(nèi)的濃度有密切的關(guān)系，對鉛濃度與淋巴細(xì)胞增殖能力的相關(guān)性研究十分必要。

Tab 2 Influence of Chry on the immune function of the lead poisoning m ice

Tab 2 Influence of Chry on the immune function of the lead poisoning m ice

**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model group

Group Dose／mg·kg－1 NK cell activity／%Control － 3.98±0.48 2.99±0.27 12.61±1.23 0.9 Spleen index／mg·g－1 Thymus index／mg·g－1 Count ofWBC／109·L－1 The phagocytosis ofmacrophage 2±0.07 43.77±9.12 Model － 2.89±0.51** 2.17±0.33** 10.44±1.17** 0.47±0.03** 25.26±6.45**Chry 0.1 3.34±0.43＃ 2.45±0.29 11.47±1.42 0.53±0.05＃＃ 29.51±6.79 Chry 1.0 3.65±0.47＃＃ 2.68±0.31＃ 11.78±1.37＃＃ 0.68±0.04＃＃ 35.45±7.14＃＃Chry 10.0 3.79±0.55＃＃ 2.82±0.27＃＃ 12.11±1.23＃＃ 0.77±0.05＃＃ 36.11±7.22＃＃

Tab 3 Effect of Chry on the concentration of IFN-γ，IL-2，IL-4 and IL-10 in the lead poisoningm ice serum

Tab 3 Effect of Chry on the concentration of IFN-γ，IL-2，IL-4 and IL-10 in the lead poisoningm ice serum

**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model group

Group Dose／mg·kg－1 IFN-γ／ng·L－1 IL-2／ng·L－1 IL-4／ng·L－1 IL-10／ng·L－1 Control － 100.37±8.14 108.25±5.17 56.13±3.965.37±5.71 Model － 78.25±7.56** 91.33±6.02** 40.18±4.58** 43.52±5.26**Chry 0.1 83.68±6.35 96.51±6.25 44.12±4.51 49.13±4.98＃Chry 1.0 92.44±7.61＃＃ 99.36±6.17＃＃ 48.51±4.81＃＃ 56.12±5.64＃＃Chry 10.0 94.51±7.88＃＃ 103.11±6.38＃＃ 51.36±4.86＃＃ 60.38±5.58 6＃＃

細(xì)胞因子是具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的重要蛋白質(zhì)。根據(jù)自身所分泌的細(xì)胞因子，CD4＋亞群（Th細(xì)胞）分為Th1和Th2兩個(gè)亞群，二者在體內(nèi)保持平衡［17］。Th1和Th2細(xì)胞是兩種重要的淋巴細(xì)胞亞群，Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-β等細(xì)胞因子，Th1細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，Th2細(xì)胞主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和 IL-13。Th2細(xì)胞主要調(diào)節(jié)體液免疫反應(yīng)［18］。通過檢測鉛中毒小鼠血清中IFN-γ、IL-2和 IL-4、IL-10分別反映Th1和 Th2細(xì)胞亞群的功能變化，研究發(fā)現(xiàn)鉛中毒小鼠血清中IFN-γ、IL-2和 IL-4、IL-10細(xì)胞因子均受到明顯的抑制，不同劑量的大黃酚可不同程度的提高血清中IFN-γ、IL-2和 IL-4、IL-10細(xì)胞因子的含量，提示大黃酚通過提高鉛中毒小鼠體內(nèi)各種細(xì)胞因子的含量改善鉛對小鼠造成的免疫損傷，大黃酚對Th1和Th2兩個(gè)細(xì)胞亞群的調(diào)節(jié)是一致的，并未打破二者的平衡。

從給藥劑量來看，大黃酚中、高劑量組能夠全面的改善鉛中毒造成的免疫功能抑制，與模型組相比大黃酚低劑量組對大部分免疫指標(biāo)并無影響，而且在前期研究中也發(fā)現(xiàn)低劑量大黃酚對鉛中毒小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力以及血鉛和組織內(nèi)鉛含量也并無明顯改善作用［10－11］，因此，在今后的研究中可以省去0.1 mg·kg－1劑量組，探索其他劑量來尋找大黃酚治療鉛中毒的最小劑量。

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