辛伐他汀對oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細胞活性氧及IL-1β分泌的影響

靳夢醒，閆 海，程艷偉，桂 麗，胡春松，張林杰，黃保軍

（安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，安徽合肥 230032）

動脈內(nèi)皮損傷以及脂質(zhì)的沉積是目前公認的動脈粥樣硬化（atherosclerois，AS）的始動因素。在物理（血流剪切力、牽拉、痙攣、缺氧）及化學(xué)（氧化型低密度脂蛋白、自由基、炎性反應(yīng)因子及感染）等因素刺激下，內(nèi)皮細胞釋放大量的細胞因子及黏附分子，這些活性分子可以促使單核細胞黏附于內(nèi)皮細胞上，并趨化遷移至內(nèi)膜下形成巨噬細胞，吞噬氧化修飾的低密度脂蛋白（oxLDL），轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽毎?，參與動脈粥樣硬化的形成［1］。在此過程中，巨噬細胞通過分泌各種細胞因子、補體及蛋白酶等參與局部炎癥反應(yīng)，通過產(chǎn)生活性氧（ROS）和活性氮（RNS）介導(dǎo)LDL的氧化，并吞噬oxLDL導(dǎo)致巨噬細胞源泡沫細胞的形成［2－3］。oxLDL能明顯提高巨噬細胞內(nèi)ROS的水平，激活 caspase-1。caspase-1又稱IL-1β轉(zhuǎn)化酶，初合成的 caspase-1不具有活性，隨后caspase-1前體在細胞質(zhì)內(nèi)自動加工成異源二聚體，并在其后形成具有活性的四聚體 caspase-1。caspase-1的重要功能之一是介導(dǎo)IL-1β前體裂解成具有活性的IL-1β，IL-1β能募集、激活其他免疫細胞，誘導(dǎo)炎癥因子（如IL-6）、趨化因子、黏附分子等的合成，它們級聯(lián)放大了炎癥反應(yīng)［4］，促進了AS的發(fā)展。

他汀類藥物是羥甲基戊二酰輔酶 A（HMGCoA）還原酶抑制劑，此類藥物通過抑制內(nèi)源性的HMG-CoA還原酶，阻斷細胞內(nèi)羥甲戊酸代謝途徑，使細胞內(nèi)膽固醇合成減少，從而反饋性刺激細胞膜表面LDL受體數(shù)量和活性增加，促進膽固醇清除及血清中膽固醇水平降低。他汀類藥物還表現(xiàn)出多效性，包括改善內(nèi)皮功能、促進斑塊的穩(wěn)定、減少氧化應(yīng)激和炎癥、抑制血栓的形成［5－6］。近期有研究表明，辛伐他汀可以有效抑制心肌細胞及腎小管上皮細胞內(nèi)ROS的水平［7－8］，但辛伐他汀對oxLDL誘導(dǎo)巨噬細胞內(nèi)ROS的水平以及炎癥因子分泌的影響目前尚不清楚。本實驗主要研究在oxLDL誘導(dǎo)巨噬細胞脂質(zhì)聚集過程中，辛伐他汀對巨噬細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生、caspase-1的活化及IL-1β分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 oxLDL購自廣州奕源生物科技有限公司；細胞培養(yǎng)液（RPMI 1640）購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；油紅O染料購自南京建成科技有限公司；兔抗caspase-1、IL-1β抗體購自巴傲得生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋公司；BCA蛋白定量試劑盒購自原平皓生物技術(shù)有限公司；辛伐他汀購自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；DCFH-DA購自美國Sigma公司；ECL購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 小鼠腹水巨噬細胞株J774A.1（購自武漢大學(xué)細胞保藏中心）于37℃含5%CO2溫箱中飽和濕度孵育。

1.2.2 脂質(zhì)聚集巨噬細胞模型的建立及檢測 將J774A.1細胞接種到6孔板中，待細胞生長融合50% ～60%，模型組加入 50、100、200 mg·L－1ox-LDL，對照組加入培養(yǎng)液。各組培養(yǎng)24 h后，用PBS沖洗細胞，甲醛固定5 min后，加入油紅O染液，37℃染色30 min，顯微鏡下觀察細胞脂滴聚集情況，判斷泡沫化細胞的模型建立情況，選擇合適的作用劑量。

1.2.3 流式細胞儀檢測ROS 將J774A.1細胞接種到6孔板中，對照組加入培養(yǎng)液，藥物組加入ox-LDL和辛伐他汀作用后，加終濃度為10μmol·L－1的DCFH-DA，37℃孵育30min，PBS緩沖液洗兩遍，胰酶消化，收集于流式管中，然后用含3% 小牛血清的PBS 0.5 ml重懸細胞，上流式細胞儀檢測。

1.2.4 Western blot法 將J774A.1細胞接種到6孔板中，對照組加入培養(yǎng)液，藥物組加入oxLDL和辛伐他汀作用后收集細胞，在冰上裂解細胞，于4℃、14 000 r·min－1離心30 min，吸取上清細胞總蛋白。BCA蛋白定量法測總蛋白的濃度。在15%的SDS-PAGE膠中每孔加入蛋白總量30μg，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用含5%的脫脂奶粉／TBST室溫封閉2 h，兔抗小鼠caspase-1和IL-1β4℃ 孵育過夜，次日TBST洗滌3次，每次10 min；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min；于全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)中進行曝光，保存圖像。實驗重復(fù)3次，并用系統(tǒng)軟件進行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。實驗數(shù)據(jù)采用表示，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2．1 oxLDL誘導(dǎo)巨噬細胞脂質(zhì)聚集模型的建立如Fig 1所示，A組為正常細胞油紅O染色的對照組，B-D組為 50、100、200 mg·L－1oxLDL作用 24 h，觀察細胞內(nèi)的脂質(zhì)聚集情況。油紅O染色結(jié)果表明，oxLDL作用于巨噬細胞后導(dǎo)致較多脂質(zhì)在細胞內(nèi)聚集，并于100 mg·L－1作用劑量達到攝取脂質(zhì)的飽和狀態(tài)。選擇100 mg·L－1作為后續(xù)實驗的作用濃度。

Fig 1 Lipid aggregation in macrophages induced by oxLDL （×400）A：Negative control；B－D：50，100，200 mg·L－1 oxLDL for24 h induce lipid aggregation

2．2 辛伐他汀對oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細胞內(nèi)ROS含量的影響 流式細胞儀檢測結(jié)果如Fig 2所示，與對照組1相比，在實驗3組加入100 mg·L－1oxLDL作用24 h后，巨噬細胞內(nèi)ROS的生成明顯增加，達到（167±0.47）%；在實驗4－5組，分別加入100 mg·L－1oxLDL及 0.5、1.0μmol·L－1辛伐他汀作用24 h后，巨噬細胞內(nèi)ROS的生成減少，其中辛伐他汀1.0μmol·L－1作用后，ROS水平降至（139±0.97）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。

2．3 辛伐他汀對oxLDL誘導(dǎo)巨噬細胞caspase-1活化的影響 caspase-1未活化時主要以procaspase-1形式存在，分子質(zhì)量為45ku，活化后裂解產(chǎn)生P20和P10兩個片段。通過Western blot檢測P10（分子質(zhì)量為10 ku）可表明caspase-1的活化水平。結(jié)果如Fig 3所示，與對照組1相比，在實驗3組加入100 mg·L－1oxLDL作用24 h后，P10的表達增加，在實驗4－5組分別加入100 mg·L－1ox-LDL與0.5、1.0μmol·L－1辛伐他汀作用 24 h后，P10的表達有明顯減弱的趨勢，通過軟件進行灰度值掃描分析，與實驗3組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

Fig 2 Production of ROS in macrophages of different groups（n＝5）1：Negative control；2：Simvastatin 1.0μmol·L－1 24 h；3：ox-LDL 24 h；4－5：oxLDL＋simvastatin 0.5，1.0μmol·L－1 24 h.＃P＜0.05 vs oxLDL

Fig 3 Expression of pro-caspase-1 and cleaved caspase-1 in macrophages of different groups（n＝5）1：Negative control；2：Simvastatin 1.0μmol·L－1 24 h；3：ox-LDL 24 h；4－5：oxLDL＋simvastatin 0.5，1.0μmol·L－1 24 h.＃P＜0.05 vs oxLDL

2．4 辛伐他汀對oxLDL誘導(dǎo)巨噬細胞IL-1β分泌的影響 caspase-1的活化可以促進IL-1β的前體裂解成成熟的IL-1β，并促進其分泌至胞外引起炎癥反應(yīng)。結(jié)果如Fig 4所示，與對照組1相比，在實驗2組加入100 mg·L－1oxLDL作用24 h后，成熟IL-1β表達增加；在實驗4－5組，分別加入100 mg·L－1oxLDL與0.5、1.0μmol·L－1辛伐他汀作用 24 h后，成熟IL-1β的表達有減弱的趨勢，較實驗2組相比，灰度值減少明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

Fig 4 Expression ofmature IL-1βin macrophages of different groups（n＝5）1：Negative control；2：oxLDL 24 h；3：Simvastatin 1.0μmol·L－1 24 h；4－5：oxLDL＋simvastatin 0.5，1.0μmol·L－1 24 h.＃P＜0.05 vs oxLDL

3 討論

動脈粥樣硬化是一種受多基因和多因素影響的脂類平衡紊亂和免疫炎癥反應(yīng)性疾病。脂類沉積在血管內(nèi)膜，引起單核巨噬細胞浸潤，導(dǎo)致血管內(nèi)膜增生及斑塊形成，血管管腔狹窄及硬化，從而引起器官功能障礙。

oxLDL是動脈粥樣硬化形成的核心要素。它是一種氧化應(yīng)激損傷性的蛋白，不經(jīng)LDL受體途徑代謝，主要由清道夫受體和oxLDL受體（lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1，LOX1）識別、結(jié)合、內(nèi)吞進入細胞，引起細胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積和泡沫樣改變［9］。動脈粥樣硬化過程中最早的變化是單核細胞趨化到血管內(nèi)皮下間隙，并分化成巨噬細胞。巨噬細胞可以通過自身的氧化性使侵入到內(nèi)膜的脂蛋白氧化，喪失與LDL受體的結(jié)合功能。氧化的LDL可與巨噬細胞表面的清道夫受體（CD36）或其他的家族成員發(fā)生結(jié)合。而這些受體不受細胞內(nèi)膽固醇水平的限制，從而導(dǎo)致脂質(zhì)在巨噬細胞內(nèi)大量蓄積，并逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楦缓懝檀嫉呐菽毎?0］。我們的研究表明，當(dāng)oxLDL作用巨噬細胞J774A.1 24 h后，即可見在細胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴聚集并保持高水平，表明巨噬細胞對oxLDL存在大量攝取及在細胞內(nèi)蓄積的現(xiàn)象。

ROS包括氧自由基，如超氧陰離子、羥自由基及一些含氧的非自由基衍生物，具有高度氧化活性，是氧化應(yīng)激的主要參與者。細胞內(nèi)產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)是細胞內(nèi)調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要化學(xué)過程之一，并且產(chǎn)生的ROS是心血管疾病中重要的危險因子之一，參與了包括細胞炎癥在內(nèi)的病理過程。近期研究表明，oxLDL可以誘導(dǎo)巨噬細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，引起NLRP3炎癥小體及caspase-1的活化，進而促進 IL-1β的分泌及泡沫細胞的形成［11－13］。在本研究中，我們應(yīng)用氧化敏感的熒光探針DCFH-DA標(biāo)記，通過流式細胞儀進行細胞內(nèi)ROS的檢測，結(jié)果顯示巨噬細胞J774A.1經(jīng)oxLDL作用后，細胞內(nèi)ROS明顯增加，同時，Western blot結(jié)果也顯示了ox-LDL誘導(dǎo)的cleaved caspase-1和成熟IL-1β增加的趨勢。他汀類藥物除了能降低低密度脂蛋白膽固醇外，還可以改善內(nèi)皮功能，促進斑塊的穩(wěn)定，減輕炎癥反應(yīng)及抑制血栓的形成［5］。為此，我們在應(yīng)用oxLDL誘導(dǎo)巨噬細胞脂質(zhì)聚集時，進一步觀察了辛伐他汀對 oxLDL誘導(dǎo)巨噬細胞 ROS的產(chǎn)生、caspase-1活化及成熟IL-1β分泌的影響。結(jié)果表明，在加入辛伐他汀后，oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生明顯減少，同時Western blot結(jié)果顯示，cleaved caspase-1和成熟IL-1β的表達也有下降的趨勢，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

綜上所述，他汀類藥物是目前臨床試驗證實可降低心腦血管疾病病死率的降脂藥。它可通過抑制炎癥細胞向斑塊內(nèi)趨化和聚集、抑制巨噬細胞炎癥細胞因子及金屬蛋白酶的產(chǎn)生等來抑制炎癥反應(yīng)。而我們的研究結(jié)果表明，辛伐他汀可抑制oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生、caspase-1的活化及減少炎癥因子IL-1β的分泌，這對于延緩動脈硬化斑塊的發(fā)生及發(fā)展有著重要的意義，但其作用機制及在動物模型中的作用尚需要進一步深入研究。

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