激活蛋白酶活化受體2抑制肺癌細胞凋亡

黃邵洪，安 軍，李 昀，張軍航，榮 健

（1.中山大學附屬第三醫(yī)院胸心外科，廣東 廣州 510630；2.中山大學附屬第一醫(yī)院麻醉科，廣東廣州 510089）

肺癌是全球人口主要死因之一，其病因及發(fā)病機制尚不清楚。近20年來，肺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)迅速上升的趨勢。肺癌的治療效果不佳，因此尋找有效的治療新靶點或策略是當前肺癌研究的急迫課題［1－2］。

誘導(dǎo)癌細胞凋亡是眾多化療藥物抗癌的主要作用機制［3－4］。凋亡是一種程序性細胞死亡過程，出現(xiàn)在多細胞器官的代謝過程中。生物化學變化造成細胞形態(tài)學上呈現(xiàn)特征性變化并最終死亡［5］。這些變化包括胞質(zhì)囊泡形成，細胞皺縮，核碎裂，核染色質(zhì)聚集，染色體DNA碎片化等。大量分子參與了凋亡過程的信號傳導(dǎo)過程。這些分子中，Bax和Bcl-xL在凋亡過程中起了非常重要的作用［6－7］。Bax／Bcl-xL比率是凋亡過程的一個指標。Bax／BclxL比率如何調(diào)節(jié)目前仍不清楚。

大量研究提示表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）與肺癌發(fā)生密切相關(guān)［8－9］。抑制EGFR表達則是許多抗癌藥物的作用基礎(chǔ)。抑制EGFR表達能增強細胞凋亡［10］。人體內(nèi)EGFR的天然增強因素并不清楚。有觀點認為肥大細胞生成的類胰蛋白酶（tryptase）會抑制凋亡［11］。肺癌細胞株A549，能夠表達蛋白酶激活受體 2（protease-activated receptor 2，PAR2）［12］。由此，我們猜想類胰蛋白酶是通過激活PAR2來調(diào)節(jié)EGFR表達，進而抑制癌細胞凋亡的。為驗證該設(shè)想，我們用A549細胞株作為研究對象，將其暴露于類胰蛋白酶下培養(yǎng)，觀察EGFR表達及細胞凋亡情況。

1 材料與方法

1.1 試劑 EGFR（A-10），PAR2（C-17），Bax

（6A7）和Bcl-xL（H-5）抗體及EGFRshRNA沉默試劑盒均購自Santa Cruz Biotech中國上海分公司。膜聯(lián)蛋白（Annexin V）試劑盒購自Millipore中國上海分公司。定量PCR和Western blot所用試劑購自Invitrogen中國上海分公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 肺癌細胞株A549獲得自廣東省肺癌研究所，培養(yǎng)環(huán)境為：DMEM普通培養(yǎng)基，添加10%小牛血清，0.1鏈霉素和100 U·L－1青霉素。2～3 d更換1次培養(yǎng)基。待克隆細胞生長至80%融合時，分離擴大培養(yǎng)。臺盼藍不相容試驗檢測細胞活性，超過98%活性時方用于下一步實驗。

1．3 定量RT-PCR 總RNA用TRIzol裂解液試劑盒抽提，cDNA用相應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成。定量PCR采用 MiniOpticon，Bio-Rad上海分公司實時PCR系統(tǒng)進行，加入SYBR Green熒光染料標記。目標基因表達通過β-actin mRNA水平標準化。引物序列包括：EGFR正向 5′-CAGCGCTACCTTGTCATTCA-3′，反向 5′-TGCACTCAGAGAGCTCAGGA-3′（NCBI：HQ912715.1）；Bax正 向 5′-TTTGCTTCAGGGTTTCATCC-3′，反向 5′-CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA-3′（NCBI：AJ417988）；Bcl-xL正向 5′-GGCTGGGATACTTTTGTGGA-3′， 反 向 5′-GGGAGGGTAGAGTGGATGGT-3′（NCBI：Z23115）。引物設(shè)計用Prime3軟件進行，用Blast分析驗證引物特異性。

1．4 W estern blot 由A549細胞株抽提的總蛋白用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜。5%脫脂牛奶封閉30 min，將膜與一抗（50～100μg·L－1）在室溫下共孵育1 h，接著再與辣根過氧化物酶標記的二抗孵育。每次抗體孵育后用Tris緩沖液及聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）洗脫膜。免疫印跡由化學發(fā)光法產(chǎn)生，結(jié)果用X線相機記錄。

1.5 凋亡細胞的檢測 存活的A549細胞用碘化丙啶（propidium iodide，PI）和膜聯(lián)蛋白（Annexin V）染色，方法按試劑盒說明操作。接著用流式細胞儀檢測，PI＋細胞首先被檢出，Annexin V＋細胞頻數(shù)在剩余細胞中確定。

1.6 基因沉默 EGFR基因用購買的shRNA沉默試劑盒進行基因敲除。對照shRNA（Control shRNA）不針對任何基因，作為沉默實驗對照?；蚯贸男Ч谵D(zhuǎn)導(dǎo)1周后達到峰值。

1.7 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)用的形式表達，兩組間差異用t檢驗。

2 結(jié)果

2．1 類胰蛋白酶抑制肺癌細胞EGFR表達 EGFR有助癌細胞生長［13］。我們觀察了PAR2激活對A549細胞EGFR表達的影響。結(jié)果顯示與類胰蛋白酶共培養(yǎng)48 h后，A549細胞EGFR表達明顯增加。為驗證該結(jié)果，我們直接將PAR2活性多肽與A549細胞培養(yǎng)，同樣觀察到EGFR表達增加（Fig 1）。

2.2 類胰蛋白酶抑制肺癌細胞凋亡 我們進一步評估了暴露于類胰蛋白酶下A549細胞的凋亡情況。結(jié)果顯示，經(jīng)過48 h單純培養(yǎng)基擴增后的A549細胞出現(xiàn)了28.6%±5.6%凋亡，而加入類胰蛋白酶后凋亡比例明顯降低，而且這種降低呈現(xiàn)劑量濃度依賴性。為闡明這種凋亡抑制效果是否由EGFR表達增加所致，我們將部分A549細胞EGFR基因用特異性shRNA進行基因敲除，再將其暴露于同樣環(huán)境下，結(jié)果顯示類胰蛋白酶對A549細胞凋亡的抑制作用消失（Fig 2）。

Fig 1 Activation of PAR2 increases expression of EGFR in A549 cellsA：the bars indicate the relative mRNA levels of EGFR toβ-actin，**P＜0.01 compared with the group of0μg；B：the immunoblots indicate the protein levels of EGFR in each group.AP：An active peptide of PAR2.CP：A control peptide of PAR2.

2．3 類胰蛋白酶改變肺癌細胞Bax／Bcl-xL比率我們進一步研究類胰蛋白酶抑制A549細胞凋亡的內(nèi)在機制。因為Bax／Bcl-xL比率在凋亡過程中起關(guān)鍵作用，我們猜測類胰蛋白酶是通過改變Bax／Bcl-xL比率起到調(diào)節(jié)A549細胞凋亡進程的。為驗證該假設(shè)，我們測定了暴露于類胰蛋白酶下A549細胞提取物中的 Bax／Bcl-xL表達量。通過定量PCR及Western blot檢測，暴露于類胰蛋白酶后A549細胞中Bax表達明顯減少，而Bcl-xL明顯增加。在EGFR基因敲除的A549細胞中未觀察到該現(xiàn)象，見Fig 3。

3 討論

通常認為，抑制細胞凋亡是癌癥發(fā)生的重要機制之一，但其具體機制尚不清楚。本研究顯示，類胰蛋白酶通過激活PAR2受體增加A549細胞EGFR表達，進而使其凋亡減少，而此過程是通過調(diào)節(jié)Bax／Bcl-xL比率介導(dǎo)的。

類胰蛋白酶是肥大細胞的主要調(diào)節(jié)介質(zhì)之一。肥大細胞被激活后釋放出類胰蛋白酶在內(nèi)的大量化學調(diào)節(jié)介質(zhì)，從而引起后續(xù)的生化反應(yīng)。類胰蛋白酶能夠解聚PAR2受體并使其激活，介導(dǎo)后續(xù)的細胞內(nèi)生化活動。類胰蛋白酶能夠調(diào)節(jié)細胞凋亡，Sawamukai等［14］報道類胰蛋白酶抑制細胞凋亡。我們的研究同樣顯示類胰蛋白酶抑制A549肺癌細胞株的凋亡，促進其生長。

Fig 2 Tryptase suppresses A549 cell apoptosisA，B：the bars indicate the frequency of PI＋cells and Annexin V＋cells.A：cells were treated with shRNA of EGFR；B：cells were treated with control shRNA.C：the immunoblots indicate the EGRF gene silence results.**P＜0.01 vs0μg group

EGFR與肺癌發(fā)生關(guān)系密切，抑制EGFR表達能減緩肺癌及其他腫瘤的生長［15］。本研究對EGFR在腫瘤生長調(diào)節(jié)的作用提供了新論據(jù)。暴露于類胰蛋白酶中可明顯增加肺癌細胞株A549EGFR表達。肥大細胞是體內(nèi)類胰蛋白酶主要來源，許多因素能刺激肥大細胞釋放化學調(diào)節(jié)介質(zhì)，諸如過敏原［16］、微生物產(chǎn)物［17］或心理壓力［18］等。肥大細胞釋放出的類胰蛋白酶能與不同類型細胞接觸并上調(diào)靶細胞EGFR表達。由于類胰蛋白酶能夠解聚PAR2受體并使其激活，而帶有PAR2受體的細胞可能成為其靶細胞。我們的結(jié)果支持該假設(shè)，實驗觀察到暴露于類胰蛋白酶下的A549細胞EGFR表達明顯增加。

Fig 3 Tryptasemodulates the ratio of Bax／Bcl-xL in A549 cellsA：the bars indicate the relative mRNA levels of Bax and Bcl-xL to β-actin；B：the bars indicate the ratio of Bax／Bcl-xL；C：the immunoblots show the protein levels of Bax and Bcl-xL.shRNA（cshRNA）：A549 cells were treated with shRNA of EGFR（or control shRNA）.The tryptase doses were denoted on x-axis.**P＜0.01 vs0μg group

癌細胞的特征之一是凋亡程序的破壞，癌細胞的凋亡減少而增殖迅速［19］。作為生理調(diào)節(jié)重要一環(huán)，凋亡在體內(nèi)是受到嚴格調(diào)控的。我們的研究顯示類胰蛋白酶增加EGFR表達，后者抑制肺癌細胞A549減少凋亡，而敲除EGFR基因使A549凋亡增加。我們的結(jié)果還顯示類胰蛋白酶使A549細胞中Bax表達明顯減少而Bcl-xL明顯增加，而在敲除EGFR基因的A549細胞沒有該效應(yīng)。這提示類胰蛋白酶對凋亡的調(diào)控是可能是通過調(diào)節(jié)Bax／Bcl-xL比率介導(dǎo)的。

總而言之，本研究提示類胰蛋白酶能增加肺癌細胞株A549EGFR表達，減少其凋亡，明顯減少Bax表達而增加Bcl-xL表達。類胰蛋白酶及PAR2受體可能成為肺癌治療新靶點。

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