中華眼鏡蛇神經(jīng)毒素微球的制備及鎮(zhèn)痛作用研究

郝永龍，陳美榮，黃 銘

（山東中醫(yī)藥大學(xué)1.第二附屬醫(yī)院藥劑科、2.附屬醫(yī)院眼科，山東 濟(jì)南 250001）

眼鏡蛇神經(jīng)毒素（α-cobrotoxin，α-CNT）是從中華眼鏡蛇毒中（Naja，naja atra）分離出的一種蛋白。該蛋白是由60～70個氨基酸通過4個二硫鍵連接而成［1］。由于眼鏡蛇神經(jīng)毒素（neurotoxin，NT）特殊的理化性質(zhì)，使其不易透過血腦屏障（blood-brain barrier，BBB），需要經(jīng)過一個較長時間的給藥過程才能在中樞作用靶位蓄積到較高的藥物濃度。在臨床中使其應(yīng)用受到限制。鼻腔給藥應(yīng)用歷史悠久［2］，鼻黏膜表面積大，黏膜內(nèi)有豐富的血管，藥物利于吸收，無肝臟首過效應(yīng)，生物利用度高等優(yōu)點(diǎn)，鼻腔給藥除通過體循環(huán)透過BBB進(jìn)入腦組織外，還可通過嗅神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)通路及嗅黏膜上皮通路而直接吸收入腦，因而可以避開BBB，使常規(guī)用藥方法難以進(jìn)入大腦的藥物（如水溶性或大分子藥物）易于進(jìn)入大腦，更好地發(fā)揮療效［3］。微球（microsphere，MS）制劑也因其可明顯提高藥物的生物利用度，近年來在鼻腔給藥系統(tǒng)中得到廣泛的研究和應(yīng)用［4－7］。然而，制備微球最常用，包裹效果最好莫過于PLGA（乳酸／羥基乙酸共聚物）。本文主要應(yīng)用PLGA包裹眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素制備微球，通過鼻腔給藥，對其鎮(zhèn)痛效果進(jìn)行研究。

1 材料與儀器

1.1 材料 眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素（α-CNT）：由廣西醫(yī)科大學(xué)蛇毒研究所提供。相對分子質(zhì)量約7 000 u（SDS法），等電聚焦電泳測定 PI為 9.5。PLGA（LA／GA 50∶50，［η］＝0.8 dl·g－1）購自德國 Ingelheim公司。海藻酸鈉（AGS）：AR，25℃下2%溶液黏度為14 000 cps，購自Sigma化學(xué)試劑公司。其他化學(xué)試劑皆為分析純。

1.2 儀器 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：JY92-Ⅱ，上海新芝生物技術(shù)研究所。切式勻漿機(jī)（高速分散器）：XHF-1，上海新芝生物技術(shù)研究所。磁力加速攪拌器：78-1型，江蘇金壇江南儀器廠。臺式高速微型離心機(jī)：DGW-99型，寧波新芝科器研究所。冷凍干燥機(jī)：LGJ-10，寧波新芝科器研究所。生物型紫外分光光度計：Cary 100 UV-VIS-NIR Spectrophoto-meter，USA。粒徑分析儀：Coulter LS-230 Laser，Miami，A-merica。

2 方法

2.1 神經(jīng)毒素微球制備 采用W／O／O復(fù)乳法制備載眼鏡蛇神經(jīng)毒素的PLGA微球，首先稱取大約200 mg的PLGA，將其溶解于5 ml乙腈／二氯甲烷（3∶2）的混合溶劑中，得到內(nèi)油相。然后將1mg眼鏡蛇神經(jīng)毒素溶解于濃度為10 g·L－1海藻酸鈉0.5 ml溶液中，得到內(nèi)水相。將內(nèi)油相倒入內(nèi)水相中，經(jīng)探頭式超聲混合均勻（100W，5 s×3），得到乳液1。再將該乳液加到10 m l含5%span80的液體石蠟（外油相）中，經(jīng)勻漿機(jī)于2 800 r·min－1下勻漿20 s×2，得到乳液2，然后立刻將乳液2倒入中速攪拌的40 ml含1%span80的液體石蠟中。最終得到的乳液先在室溫（18℃左右）下攪拌1 h，然后緩慢升溫至35℃，恒溫攪拌3～4 h。將固化的微球離心收集，再用石油醚沖洗，以洗去微球表面的液體石蠟。殘留的溶劑和石油醚經(jīng)冷凍干燥機(jī)24 h抽干后，于4℃干燥保存。

2.2 藥物包埋率的測定 稱取50 mg微球，放入1.5 ml含 1%SDS的 NaOH（0.2 mol·L－1）中，充分?jǐn)嚢韬?，放?7℃恒溫振蕩箱中，至微球溶解后取出1 ml溶液，用Lowry法［8］測定眼鏡蛇神經(jīng)毒素吸光度，通過眼鏡蛇神經(jīng)毒素原料藥標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算微球中所包埋的藥物量。

2.3 微球表征研究 ①微球平均粒徑及粒徑分布測試：將一定量的微球分散于 0.2% （W／V）的Tween 80水溶液中，用粒徑分析儀測定粒徑。以均數(shù)粒徑表示其大小。②微球表面形態(tài)觀察：將干燥后的微球置于試樣平臺上，噴金后用掃描電鏡觀察其表面和斷面的形態(tài)并拍照。

2.4 眼鏡蛇神經(jīng)毒素微球鎮(zhèn)痛作用研究 參照文獻(xiàn)［9］，取大鼠18只，♀♂各半，隨機(jī)分為3組，分別為α-CNT-MS組、α-CNT組和NS組，分別以α-CNTMS滴鼻劑、α-CNT滴鼻劑及NS，滴鼻70μl，置大鼠于固定筒內(nèi)，尾部暴露于外，將大鼠尾下部垂直浸入預(yù)熱的55℃±0.5℃的恒溫水浴鍋中，浸入長度為4 cm左右，以大鼠甩尾的潛伏期作為痛反應(yīng)指標(biāo)。給藥前間隔5 min測2次，以其均值為基礎(chǔ)痛閾。記錄給藥后 15、30 min，1、3、6、12、24、48、72、96 h大鼠甩尾潛伏期。

2.5 對鼻黏膜結(jié)構(gòu)變化的研究 大鼠18只，分組給藥同上，每日1次，連續(xù)給藥7 d。d 8每組處死3只動物，取鼻中隔黏膜，觀察多日鼻腔給藥后局部黏膜結(jié)構(gòu)的損傷程度。d 22處死剩余的動物，取出鼻中隔黏膜組織，觀察停藥2周后，不用任何保護(hù)鼻黏膜的藥物，鼻黏膜自然恢復(fù)的程度。黏膜取材經(jīng)處理后進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察。

3 結(jié)果

3.1 微球制備與表征 由于眼鏡蛇神經(jīng)毒素極易溶解于水中，而不溶于乙腈、二氯甲烷等有機(jī)溶劑，若采用含水相復(fù)乳法（W／O／W），包埋率很低（＜20%），藥物很快釋放進(jìn)入水相。為了改善眼鏡蛇神經(jīng)毒素的包埋率，必須采用W／O／O非水溶劑復(fù)乳法制備。通過應(yīng)用上述方法我們得到了，眼鏡蛇神經(jīng)毒素微球的包埋率都超過了80%，平均粒徑大約在25μm（Tab 1）。通過SEM觀察神經(jīng)毒素微球大小均勻，表面光滑，形態(tài)完整，斷面致密。如Fig 1。

Tab 1 α-CNT PLGA m icrosphere particle sizeand embedding rate

Tab 1 α-CNT PLGA m icrosphere particle sizeand embedding rate

Embedding rate／% Average particle size／μm 86.4±5.56 25.14±2.64

Fig 1 SEM photographs ofα-cobrotoxin-loaded m icrospheres

3．2 α-CNT-MS對大鼠熱刺激痛閾值的影響 用大鼠熱刺激甩尾法分別測定α-CNT-MS組、α-CNT組和NS組鼻腔給藥前及給藥后不同時間的痛閾，見Tab 2。結(jié)果顯示：α-CNT-MS組和α-CNT組均于鼻腔給藥后1 h起效，3 h達(dá)峰值，α-CNT組作用持續(xù)至12 h，α-CNT-MS組作用持續(xù)至72 h，在以上各時間段，大鼠痛閾值增加。與α-CNT組痛閾值相比，差異均有顯著性（P＜0.05）。經(jīng)q檢驗，α-CNTMS鼻腔給藥鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)度明顯高于α-CNT，兩組3 h時的痛閾值比較P＜0.05；其鎮(zhèn)痛作用持續(xù)時間亦較α-CNT明顯延長，24 h、48 h、72 h的痛閾值比較，α-CNT-MS組與NS組和組間的差異均有顯著性（P＜0.05），而α-CNT組與NS組之間差異無顯著性（P＞0.05）。

3.3 多日鼻腔給藥后對大鼠鼻黏膜結(jié)構(gòu)的影響 3組大鼠分別用 NS、α-CNT、α-CNT-MS鼻腔給藥7 d后，肉眼觀察鼻黏膜均無紅腫、充血等炎癥反應(yīng)，光鏡下鼻黏膜組織病理學(xué)觀察：NS組和α-CNT組均未發(fā)現(xiàn)黏膜下及黏膜表面有任何形態(tài)學(xué)方面的改變；α-CNT-MS組大鼠見鼻黏膜上皮變短、纖毛倒伏，未見炎細(xì)胞浸潤及上皮細(xì)胞壞死脫落；停藥2周后光鏡觀察鼻黏膜無明顯異常，纖毛恢復(fù)如常，與NS對照組一致。

Tab 2 Influence of nasal drug delivery on thermally stimulated pain threshold of rats

Tab 2 Influence of nasal drug delivery on thermally stimulated pain threshold of rats

*P＜0.05，**P＜0.01 vs NS group

Group Threshold of pain／s 0 min 15 min 30 min 1 h 3 h 6 h NS 5.67±3.03 5.23±2.42 4.89±2.76 3.83±1.58 4.38±2.13 5.44±2.98 α-CNT 5.49±2.06 6.37±3.17 7.67±3.34 9.25±4.32* 13.46±5.65** 11.58±5.12*α-CNT-MS 6.40±2.59 5.78±3.04 8.25±3.58 11.46±5.22** 19.63±6.34** 16.37±5.72**Group Threshold of pain／s 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h NS 6.24±3.53 5.62±3.18 5.02±2.67 4.77±2.81 5.24±3.06 α-CNT 10.87±4.22* 6.43±2.65 5.39±3.23 5.17±3.14 4.96±2.81 α-CNT-MS 14.36±6.28** 12.74±5.59** 11.21±5.26* 9.48±4.32*6.28±3.53

4 討論

血腦屏障是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，有效保護(hù)腦組織避免外源性有害物質(zhì)侵害，但也阻礙許多治療藥物進(jìn)入腦內(nèi)，限制了中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物的臨床應(yīng)用。如何有效透過血腦屏障成為此類藥物發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。納米粒／微球作為一種新型藥物載體，能攜載藥物透過血腦屏障進(jìn)入腦組織，提高腦內(nèi)藥物濃度，實現(xiàn)腦內(nèi)靶向給藥［10］。PLGA因其良好的生物兼容性、生物可降解性及機(jī)械強(qiáng)度，作為制備納米／微球載體材料引起了人們極大的關(guān)注［11］。在微球制劑的研究中PLGA顯示出能夠控制微球大小、延緩藥物降解、延長藥物釋放時間、靶向釋放、降低藥物毒性和刺激性等優(yōu)良特征。本實驗中所用的眼鏡蛇神經(jīng)毒素是一小分子單鏈堿性蛋白，含60～70個氨基酸殘基，分子質(zhì)量7 000 u，等電點(diǎn)約9.5，性質(zhì)穩(wěn)定，對熱和化學(xué)試劑有抗性。為了改善眼鏡蛇神經(jīng)毒素的鎮(zhèn)痛效果，提高其生物利用度和減輕其毒副反應(yīng)，我們選用PLGA為載體材料，采用復(fù)乳法制備眼鏡蛇神經(jīng)毒素微球鼻腔給藥。由于眼鏡蛇神經(jīng)毒素極易溶解于水中，而不溶于有機(jī)溶劑，采用傳統(tǒng)的含水相復(fù)乳法（W／O／W），藥物很快釋放進(jìn)入水相，導(dǎo)致包埋率極低。為此，我們采用了非水溶劑復(fù)乳法（W／O／O），并對常規(guī)的O／O乳化過程進(jìn)行了改進(jìn)，經(jīng)過反復(fù)試驗，最終獲得了粒徑均勻的眼鏡蛇神經(jīng)毒素微球。鼻黏膜作為一種遞藥系統(tǒng)，因其給藥方便，沒有首過效應(yīng)，生物利用度高，受到了國際藥學(xué)界廣泛關(guān)注與研究。眼鏡蛇神經(jīng)毒素作為一種大分子蛋白，常規(guī)給藥途徑，難以通過血腦屏障而鎮(zhèn)痛效果甚微。本試驗就眼鏡蛇神經(jīng)毒素采用PLGA包裹，制備納／微球，使其黏附時間延長，釋放時間延長，通過嗅球及鼻黏膜血管和淋巴管等多條途徑，使其透血腦屏障藥物增多，達(dá)到良好的鎮(zhèn)痛效果。本試驗藥效學(xué)結(jié)果證實了這一點(diǎn)。

鼻內(nèi)長期應(yīng)用藥物可能引起鼻黏膜結(jié)構(gòu)、功能的損害，尤其是藥物性鼻炎的問題已引起廣泛的重視［12］，該問題也已成為影響鼻腔給藥制劑臨床應(yīng)用的關(guān)鍵問題之一。本試驗采用具有良好生物相溶性和生物黏附性的可降解高分子材料PLGA將眼鏡蛇神經(jīng)毒素制成微球制劑，擬利用其較強(qiáng)的黏膜吸附性和緩釋特性，使鼻黏膜局部眼鏡蛇神經(jīng)毒素的濃度維持在較低水平，從而降低黏膜毒性。本實驗觀察了大鼠滴鼻給藥1 d，對鼻黏膜結(jié)構(gòu)未產(chǎn)生明顯影響；給藥7 d后，病理組織切片見鼻黏膜上皮變短、纖毛倒伏，但未見炎細(xì)胞浸潤及上皮細(xì)胞壞死脫落，停藥2周后光鏡觀察鼻黏膜無明顯異常，纖毛恢復(fù)如常。藥物經(jīng)鼻黏膜吸收可能會在不同程度上對鼻黏膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損傷，這種損傷是否可逆。如果在給藥時注意雙側(cè)鼻腔交替使用，避免同一鼻腔長期連續(xù)用藥，給予其修復(fù)再生的時間，可延長鼻腔的用藥時間，縮短或減少鼻黏膜受損的時間和程度。

綜上所述，應(yīng)用該方法得到的新型制劑包埋率高，性質(zhì)穩(wěn)定，療效確切，副作用小，可以為大分子蛋白類藥物增強(qiáng)療效，降低毒性提供實驗依據(jù)，為其在臨床應(yīng)用開發(fā)新劑型提供參考。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Yang C C.Cobrotoxin：structure and function［J］.J Nat Toxins，1999，8（2）：221－33.

［2］ Ugwoke M I，Verbeke N，Kinget R.The biopharmaceuticalaspects of nasalmucoadhesive drug delivery［J］.Pharm Pharmacol，2001，53：3－21.

［3］ 相小強(qiáng)，陶 濤，陳慶華.透血腦屏障制劑的研究進(jìn)展［J］.中國新藥雜志，2002，11（7）：519－23.

［3］ Xiang X Q，Tao T，Chen QH.Rcentadvances of drug delivery systems across blood-brain barrier［J］.Chin J New Drugs，2002，11（7）：519－23.

［4］ 張 奕，蔣新國.鼻腔給藥新劑型［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，1999，19（8）：485－8.

［4］ Zhang Y，Jiang XG.Drug delivery system for the nasal cavity［J］.Chin JHospital Pharm，1999，19（8）：485－8.

［5］ 李 玲，馬海忠，廖明琪，等.鼻腔給藥系統(tǒng)類型及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.中國藥房，2013，24（17）：1615－6.

［5］ Li L，Ma H Z，Liao M Q，et al.The nasal drug delivery system as the progress and clinical application［J］.China Pharm，2013，24（17）：1615－6.

［6］ Lim ST，Martin G P，Berry D J，etal.Preparation and evaluation of thein vitrodrug release properties and mucoadhesion of novel microsphere of hyaluronic acid and chitosan［J］.Controlled Release，2000，66（2～3）：281－92.

［7］ Nakanura K，Maitani Y，Lowman A M，er al.Uptake and release of budesonide from mucoadhesive pH-sensitive copolymers and their application to nasal delivery［J］.Controlled Release，1999，61（3）：329－35.

［8］ Lowry O H，Rosenbrough N J，F(xiàn)arr A L，et al.Protein measurementwith folin phenol reagent［J］.Biol Chem，1951，193：265.

［9］ 徐叔云，卞如濂，陳 修.藥理實驗方法學(xué)［M］.第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：882－904.

［9］ Xu SY，Bian R L，Chen X.Methodology of pharmacological experiment［M］.3rd edition.BeiJing：People′s medical publishing house，2002：882－904.

［10］王斌艷，夏愛曉，陳蘋蘋，等.載藥納米粒透過血腦屏障機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.國際藥學(xué)研究雜，2010，37（1）：40－2.

［10］Wang B Y，Xia A X，Chen PP，etal.Blood-brain barrier transport of drug-loaded nanoparticle：research advances［J］.J Int Pharm Res，2010，37（1）：40－2.

［11］Leo E，Pecquets S，Rojas J，etal.Changing the pH of the external of the external aqueous phasemaymodulate protein entrapmentand delivery from poly（lactide-co-glycolide）microspheres prepared by a w／o／w solvent evaporation method［J］.Microencapsulation，1998，15：421－30.

［12］張 奕，蔣新國.鼻腔給藥系統(tǒng)的鼻黏膜毒性及解決途徑［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2001，32（7）：323－7.

［12］Zhang Y，Jiang X G.Detoxification of nasal toxicity of nasal drug delivery system［J］.Chin JPharm，2001，32（7）：323－7.