氯肟衍生物對(duì)記憶障礙模型動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶障礙改善作用及其機(jī)制研究

于瀟冰，王 琴，楊克凡，范麗霞，張?jiān)谲?，王玉?qiáng)，陶 亮

（1.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東廣州 510080；2.暨南大學(xué)藥學(xué)院新藥研究所，廣東 廣州 510632）

阿爾采末?。ˋlzheimer′s disease，AD）是一種以老年斑（SPs）、神經(jīng)元纖維纏結(jié)（NFTs）以及腦淀粉樣血管病變（CAA）為特征性病理改變的神經(jīng)退行性疾病，其典型臨床表現(xiàn)為漸進(jìn)性且不可逆轉(zhuǎn)的記憶丟失、認(rèn)知障礙等精神癥狀［1］。SPs與CAA均由聚集態(tài)Aβ蛋白在胞外沉積所形成，而NFTs則由神經(jīng)元胞內(nèi)過度磷酸化的微管結(jié)合蛋白tau聚合形成［2－3］。AD發(fā)生時(shí)，β淀粉樣蛋白在細(xì)胞外異常沉積并引發(fā)一系列的細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括神經(jīng)元興奮性毒性、鈣穩(wěn)態(tài)的破壞、自由基產(chǎn)生、神經(jīng)炎癥、tau蛋白高度磷酸化等，直接或間接地作用在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，從而最終導(dǎo)致神經(jīng)元功能異?；驍?shù)量減少，引發(fā)一系列精神癥狀［4－5］。這一“β淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說”是目前公認(rèn)的AD病理機(jī)制之一。在Aβ蛋白引起的級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，tau蛋白的代謝異常是引起神經(jīng)元功能退化乃至凋亡的一個(gè)重要原因［6］。因此，抑制Aβ級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)已成為AD藥物開發(fā)中的重點(diǎn)。AD的病理表現(xiàn)（包括SPs、NFTs、CAA）提示，該神經(jīng)退行性病變可能與蛋白質(zhì)的異常折疊和聚集有關(guān)，而作為參與細(xì)胞中蛋白質(zhì)折疊的主要因子，熱休克蛋白家族（HSPs）在AD發(fā)生、發(fā)展中的作用逐漸受到人們的重視，不少研究者提出將熱休克蛋白作為AD治療的潛在靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，某些氯肟衍生物能選擇性增強(qiáng)病理狀態(tài)的熱休克蛋白活性，而對(duì)正常熱休克蛋白無影響。TCO-2是由暨南大學(xué)藥學(xué)院將中藥川穹嗪（TMP）連接到小分子氯肟衍生物arimoclomol上得到的一種新型氯肟衍生物（化學(xué)結(jié)構(gòu)見Fig 1）。我們的前期試驗(yàn)表明，TCO-2在應(yīng)激細(xì)胞模型中，能清除泛素化蛋白（ubiqitination）的聚集，逆轉(zhuǎn)神經(jīng)細(xì)胞損傷，活性優(yōu)于arimoclomol，表明該化合物有可能成為治療AD的新型藥物。本研究在東莨菪堿致記憶獲得性障礙小鼠模型和側(cè)腦室注射Aβ1－42所致記憶障礙大鼠模型中，研究了TCO-2和arimoclomol對(duì)癡呆動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

Fig 1 Chem ical structures of chloro-oxime derivatives

1.1 試劑與儀器 Aβ1－42購自 Sigma公司；氫溴酸東莨菪堿購自Sigma公司；arimoclomol及TCO-2由暨南大學(xué)藥學(xué)院提供；多奈哌齊由國(guó)內(nèi)某知名藥企提供；β淀粉樣蛋白1－42（Aβ1－42）ELISA試劑盒購自深圳菲優(yōu)生物有限公司；乙酰膽堿酯酶試劑盒購自南京建成生物工程研究所；phpspho-tau（Ser202）抗體購自武漢博士德公司；phpspho-tau（Ser396）抗體購自美國(guó)Abcam公司；HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗、ECL-plus化學(xué)發(fā)光劑、DC蛋白定量試劑盒購自美國(guó)Bio-Rad公司。Morris水迷宮測(cè)試系統(tǒng)購自淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司；大鼠腦立體定位儀（NARISHIGE SN-3型）購自日本成茂公司；酶標(biāo)儀購自美國(guó)Biotek公司；微量進(jìn)樣器（規(guī)格5μl）購自上海高鴿工貿(mào)有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購自美國(guó)GE公司。

1.2 動(dòng)物與分組 健康♂成年昆明小鼠40只，體質(zhì)量（20±2）g；健康♂成年 SD大鼠40只，體質(zhì)量（200±20）g，均由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SPF級(jí)，許可證號(hào)SCXK（粵）2011－0015。兩種動(dòng)物均隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性藥對(duì)照組（多奈哌齊）、arimoclomol組和TCO-2組，每組8只。多奈哌齊組采取灌胃給藥方式，其余各組采用腹腔注射給藥。多奈哌齊、arimoclomol、TCO-2均用生理鹽水溶解。給藥劑量分別為：多奈哌齊3 mg·kg－1、arimoclomol 10 mg·kg－1、TCO-2 10 mg·kg－1，正常組與模型組腹腔注射給予相應(yīng)劑量的藥物溶劑（生理鹽水），給藥容量為 1 ml·（100 g）－1體重，每日 1次，共給藥8 d。

1.3 造模藥物的配制 氫溴酸東莨菪堿由無菌生理鹽水配制，儲(chǔ)存液濃度為0.2 g·L－1，現(xiàn)用現(xiàn)配。Aβ1－42由無菌生理鹽水配制，儲(chǔ)存濃度為2 mg·L－1，37℃恒溫箱孵育4 d，－20℃冰箱保存，切忌反復(fù)凍融。

1.4 癡呆動(dòng)物模型的建立 東莨菪堿癡呆模型的建立：于給藥d 5開始進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練，實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行5 d，東莨菪堿模型組、待測(cè)藥組和多奈哌齊對(duì)照組分別在訓(xùn)練前20 min腹腔注射東莨菪堿（2 mg·kg－1）造成記憶障礙模型，對(duì)照組小鼠注射相應(yīng)劑量生理鹽水。側(cè)腦室注射Aβ1－42癡呆模型的建立：大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉（4 ml·kg－1），將麻醉的大鼠固定于大鼠腦立體定位儀上，定位參照George Paxinos和CharlesWatson合著的第5版大鼠腦立體定位圖譜，定位方法：前囟向后1.08 mm、中線旁開2.50 mm、硬腦膜下3.70 mm，采用微量進(jìn)樣器每只大鼠注射5μl配制好的 Aβ1－42，注射應(yīng)緩慢，注射完留針10 min以保證其充分彌散，后緩慢撤針，縫合消毒。

1．5 M orris水迷宮實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)［7］，并作適當(dāng)修改。時(shí)間共進(jìn)行5 d，前4 d為定位航行實(shí)驗(yàn)，連續(xù)4 d觀察和記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尋找并爬上平臺(tái)所需的時(shí)間，檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)獲得能力。d 5進(jìn)行空間搜索實(shí)驗(yàn)，撤去平臺(tái)，記錄動(dòng)物第1次經(jīng)過原平臺(tái)位置的時(shí)間（潛伏期）、穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)，檢測(cè)動(dòng)物空間記憶能力。以潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，檢測(cè)藥物對(duì)癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶的改善作用。

1.6 乙酰膽堿酯酶活性的測(cè)定 Morris水迷宮測(cè)試結(jié)束后，腹腔注射10%水合氯醛4 ml·kg－1將動(dòng)物麻醉，并以冰冷生理鹽水快速進(jìn)行心臟灌流，直至肝臟及虹膜顏色變白。迅速將動(dòng)物斷頭、取出大腦、分離海馬。按所取出海馬的重量加9倍重量的生理鹽水，制備腦組織勻漿，1 000×g離心20 min，取上清液置于－20℃冰箱保存。根據(jù)南京建成生物工程研究所提供的乙酰膽堿酯酶活性測(cè)試盒的說明書，測(cè)定乙酰膽堿酯酶活性，用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。

1．7 側(cè)腦室注射癡呆模型大鼠海馬組織Aβ1－42蛋白含量測(cè)定 按上述方法取出海馬，并按所取出海馬的重量加9倍重量的蛋白裂解液制備腦組織勻漿，1 000×g離心20 min，取上清液置于－20℃冰箱保存。根據(jù)深圳菲優(yōu)生物有限公司提供的Aβ1－42ELISA試劑盒的說明書測(cè)定海馬組織Aβ1－42的蛋白含量。

1．8 側(cè)腦室注射癡呆模型大鼠海馬組織磷酸化tau蛋白的免疫印跡 將“1.7”中海馬組織勻漿經(jīng)1 000×g離心20 min，取上清液以DC蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。將含20μg蛋白的樣品90℃水浴5 min變性，經(jīng)SDS-PAGE電泳（8%分離膠）分離后，電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。脫脂奶粉封閉，分別加入 phpspho-tau（Ser202）一抗（1∶400），phpsphotau（Ser396）一抗（1∶2 000），4℃孵育過夜。TBST洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶1 000），室溫孵育30 min，洗膜后用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物（ECL）顯影，曝光。使用Bio Imaging system（Gene Genius）對(duì)膠片進(jìn)行灰度掃描分析。以β-actin為內(nèi)參對(duì)照，蛋白表達(dá)強(qiáng)度以 phpspho-tau（Ser202）、phpspho-tau（Ser396）蛋白表達(dá)灰度值與β-actin灰度值比值表示。

1.9 數(shù)據(jù)的分析與統(tǒng)計(jì) 采用Sigma Plot10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，所有數(shù)值均采用表示，水迷宮試驗(yàn)中的逃避潛伏期和游泳距離均采用重復(fù)測(cè)量的方差分析；組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果見Tab 1、2。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物找到平臺(tái)時(shí)間（潛伏期）均隨著訓(xùn)練進(jìn)行而逐漸縮短。與對(duì)照組相比，模型組從d 3開始潛伏期明顯延長(zhǎng)（P＜0.05）。而給予陽性藥物Donepezil以及實(shí)驗(yàn)藥物 Arimoclomol、TCO-2后，由東莨菪堿以及Aβ1－42造成的空間學(xué)習(xí)記憶障礙均得到改善，各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的潛伏期明顯縮短，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

Tab 1 Escape latency of Kunm ing m ice treated by scopolam ine

Tab 1 Escape latency of Kunm ing m ice treated by scopolam ine

*P＜0.05 vs modelgroup

Group Day1 Day2 Day3 Day4 Control 75.18±17.63 61.37±16.20 32.64±10.57*25.80±9.22*Model 73.96±22.19 63.72±16.21 55.98±12.72 54.33±13.08 Donepezil 67.91±26.54 55.96±19.31 33.65±9.85* 28.82±8.88*Arimoclomol 80.51±12.27 59.48±15.05 34.11±13.82*27.20±10.88*TCO-2 75.24±17.38 61.89±15.20 36.41±15.78*28.59±12.25*

Tab 2 Escape latency of SD rats treated by Aβ1－4

*P＜0．05 vs modelgroup

Group Day1 Day2 Day3 Day4 Control 83.96±8.80 65.93±17.47 46.00±21.21*35.26±20.01*Model 83.63±12.30 80.55±11.16 79.42±13.38 71.93±20.58 Donepezil 79.23±11.87 64.83±20.91 54.40±23.15*46.41±21.25*Arimoclomol 81.42±8.14 61.76±22.83 48.59±21.25*37.99±16.78*TCO-2 79.11±11.11 63.71±23.37 44.36±20.86*33.47±16.95*

2.2 空間搜索實(shí)驗(yàn) 空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果見Tab 3、4。各組動(dòng)物之間的游泳速度差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），排除了動(dòng)物體力差異對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響。與對(duì)照組相比，模型組動(dòng)物到達(dá)平臺(tái)位置時(shí)間（潛伏期）明顯延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而各給藥組動(dòng)物潛伏期縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增加，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在東莨菪堿模型小鼠試驗(yàn)中，各給藥組與對(duì)照組相比，穿越平臺(tái)次數(shù)仍然較少，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 乙酰膽堿酯酶活性測(cè)定 Tab 5、6顯示，注射東莨菪堿及Aβ1－42模型動(dòng)物海馬組織勻漿中AChE活性與對(duì)照組相比明顯升高（P＜0.05）；而給予Donepezil、Arimoclomol和 TCO-2后，模型動(dòng)物海馬組織AChE活性明顯降低，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

Tab 3 Results of spatial probe test on Kunm ingm ice treated by scopolam ine

Tab 3 Results of spatial probe test on Kunm ingm ice treated by scopolam ine

*P＜0．05 vs model group；＃P＜0．05 vs control group

Group Swimming speed Latency Crossing of the former platform Control 10.53±1.17 8.54±5.81* 6.75±1.26*Model 10.35±1.04 66.42±22.48 0.75±0.96＃Donepezil 11.87±0.60 19.76±8.62* 2.10±0.42*＃Arimoclomol 12.69±2.87 13.95±5.36* 2.25±0.26*＃TCO2 10.76±1.19 16.10±9.92* 2.25±0.50*＃

Tab 4 Results of spatial probe test on SD rats treated by Aβ1－42

Tab 4 Results of spatial probe test on SD rats treated by Aβ1－42

*P＜0．05 vs model group

Group Swimming speed Latency Crossing of the former platform Control 31.91±12.59 22.87±20.05*3.00±1.51*Model 27.75±14.02 69.38±22.14 1.00±1.20 Donepezil 27.34±6.68 40.92±28.80*2.63±2.00*Arimoclomol 35.07±11.79 26.55±16.54*2.7±1.60*TCO-2 34.80±10.08 22.06±16.21*4.38±2.39*

Tab 5 Acetyl cholinesterase activity of Kunm ing m ice treated by scopolam ine

Tab 5 Acetyl cholinesterase activity of Kunm ing m ice treated by scopolam ine

*P＜0．05 vs model group

Group Acetyl cholinesterase activity／kU·g－1Pro Control 0.63±0.15*Model 1.41±0.31 Donepezil 0.72±0.14*Arimoclomol 0.88±0.19*TCO-2 0.77±0.09*

Tab 6 Acetyl cholinesterase activity of SD rats treated by Aβ1－42

Tab 6 Acetyl cholinesterase activity of SD rats treated by Aβ1－42

*P＜0．05 vs model group

Group Acetyl cholinesterase activity／kU·g－1Pro Control 0.51±0.15*Model 1.02±0.19 Donepezil 0.62±0.15*Arimoclomol 0.69±0.16*TCO-2 0.65±0.14*

2．4 側(cè)腦室注射 Aβ1－42模型動(dòng)物海馬組織 Aβ1－42蛋白含量測(cè)定 Tab 7結(jié)果顯示，經(jīng)側(cè)腦室注射凝聚態(tài) Aβ1－42后，海馬組織勻漿中 Aβ1－42含量明顯增加，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；給予試驗(yàn)藥物arimoclomol以及TCO-2之后，海馬組織中Aβ1－42含量降低，與模型組和Donepezil組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；給予 Donepezil后，海馬組織Aβ1－42含量與模型組相比，差異無顯著性（P＞0.05），而與對(duì)照組相比，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

Tab 7 Concentration of Aβ1－42 in hippocampus ofSD rats treated by Aβ1－42

Tab 7 Concentration of Aβ1－42 in hippocampus ofSD rats treated by Aβ1－42

*P＜0．05 vs model group；＃P＜0．05 vs donepezil group

Group Concentration of Aβ1－42 in hippocampus／ng·L－1 Control 26.41±5.87*＃Model 81.35±24.91 Donepezil 62.05±22.01 Arimoclomol 32.23±8.51*＃TCO-2 32.72±4.56*＃

2．5 側(cè)腦室注射Aβ1－42模型動(dòng)物海馬組織中磷酸化tau蛋白含量測(cè)定 Fig 2、3免疫印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)側(cè)腦室注射凝聚態(tài) Aβ1－42后，ptau（包括Ser202、Ser396）表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；給予 arimoclomol后，p-tau（包括Ser202、Ser396）表達(dá)下降，與模型組相比差異有顯著性（P＜0.05），但p-tau（Ser202）表達(dá)與Donepezil組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；給予TCO-2后，p-tau（Ser202）表達(dá)明顯降低（P＜0.05），而 ptau（Ser396）的表達(dá)并無明顯變化（P＞0.05）；注射Donepezil對(duì)p-tau的表達(dá)沒有影響。

Fig 2 Expression of p-tau（Ser396）in hippocam pus of SD rats treated by Aβ1－42（n＝3）*P＜0．05 vs model group；＃P＜0．05 vs donepezil group

3 討論

Fig 3 Expression of p-tau（Ser202）in hippocam pus of SD rats treated by Aβ1－42（n＝3）*P＜0．05 vs model group；＃P＜0．05 vs donepezil group

神經(jīng)退行性疾病，如AD、帕金森綜合癥、脊髓側(cè)索硬化綜合癥，又被稱為“蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊疾病”，其典型病理改變?yōu)樯窠?jīng)系統(tǒng)中大量沉積的錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)。大量研究表明，HSPs對(duì)神經(jīng)退行性疾病模型具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，例如，過表達(dá)HSP70可以對(duì)抗Aβ介導(dǎo)的神經(jīng)元毒性，近年來有研究表明［8－10］，HSP70的這一神經(jīng)保護(hù)機(jī)制可能與其對(duì)Aβ低聚物形成的抑制和Aβ蛋白胞吞降解途徑的激活有關(guān)。也有證據(jù)顯示，CHIP-HSC70復(fù)合體通過介導(dǎo)泛素與磷酸化tau蛋白的結(jié)合，從而達(dá)到清除可溶性磷酸化tau蛋白的作用［11］。因此，調(diào)節(jié)熱休克蛋白表達(dá)的化合物有望成為治療AD的新藥。近年研究發(fā)現(xiàn)［12］，某些氯肟（chloro-oxime）衍生物能選擇性擴(kuò)大病理狀態(tài)HSP70活性，并對(duì)正常狀態(tài)無明顯影響，具有較好的臨床療效和安全性，有望成為臨床治療AD的藥物。有研究表明［13］，氯肟衍生物bimoclomol可恢復(fù)受損組織對(duì)乙酰膽堿的敏感性，這一現(xiàn)象與組織中大量HSP70的累積有關(guān)。而Gupta等［14］的研究表明，溫度與化學(xué)物質(zhì)誘發(fā)的HSP70表達(dá)明顯升高都伴隨著腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶（AChE）活性的明顯抑制。我們的研究發(fā)現(xiàn)，氯肟衍生物可以明顯抑制海馬組織中AChE活性，這與以上研究結(jié)果相符。AD患者腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的數(shù)量減少，東莨菪堿為M膽堿受體阻斷劑，是乙酰膽堿的競(jìng)爭(zhēng)性非選擇性拮抗劑，能模擬乙酰膽堿分泌不足造成可逆的記憶障礙，常作為抗老年性癡呆藥物研究的初篩模型［15－16］。Aβ蛋白具有神經(jīng)毒性作用，可導(dǎo)致腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)功能降低，促進(jìn)tau蛋白異常磷酸化等。研究表明，側(cè)腦室內(nèi)單次或持續(xù)性注射Aβ蛋白能夠引起學(xué)習(xí)記憶損害及認(rèn)知功能障礙，并且能夠多方面模擬AD病理特征，是一種較理想的抗癡呆藥物研究模型［17］。

本實(shí)驗(yàn)采用了上述兩種模型，觀察了氯肟衍生物對(duì)癡呆動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的影響。行為學(xué)結(jié)果顯示，氯肟衍生物（包括小分子氯肟衍生物arimoclomol以及新型合成氯肟衍生物TCO-2）可改善癡呆模型動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶障礙，明顯縮短尋找平臺(tái)潛伏期，增加穿越平臺(tái)次數(shù)，顯示出對(duì)AD模型有一定的防治作用。AD膽堿能假說認(rèn)為，中樞膽堿能系統(tǒng)與學(xué)習(xí)記憶有密切關(guān)系，乙酰膽堿（ACh）由膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）合成，AChE分解，中樞ACh含量下降以及AChE活性升高是AD的主要病理生化改變。而β淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說認(rèn)為，β淀粉樣肽（Aβ）才是AD發(fā)病的多種早期病理改變的促發(fā)因素。為了探討氯肟衍生物改善癡呆動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)兩種癡呆模型建立的原理，分別對(duì)東莨菪堿模型小鼠海馬組織進(jìn)行AChE測(cè)定，以及對(duì)側(cè)腦室注射Aβ1-42模型大鼠的海馬組織進(jìn)行AChE測(cè)定、Aβ1－42含量測(cè)定和磷酸化tau蛋白含量測(cè)定。結(jié)果顯示，氯肟衍生物可以抑制腦內(nèi)AChE活性，并且降低腦內(nèi)Aβ1－42含量，還可以不同程度地降低腦內(nèi)磷酸化tau蛋白表達(dá)。我們的試驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種模型動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶的改善情況與AChE活性結(jié)果呈負(fù)相關(guān)；并且在側(cè)腦室注射Aβ1－42所致的癡呆模型中，癡呆動(dòng)物記憶改善的情況也與Aβ1－42含量以及磷酸化tau蛋白的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果與AD的兩種病理假說相符，而本試驗(yàn)的結(jié)果也提示氯肟衍生物可能具有多方面的藥理作用，其增強(qiáng)癡呆動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制可能與抑制AChE合成，減少ACh分解，從而提高腦內(nèi)ACh水平有關(guān)；并且該化合物也可能通過抑制模型大鼠腦組織Aβ1－42含量，降低tau蛋白磷酸化，穩(wěn)定微管蛋白，從而改善大腦功能，促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶能力。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，自主合成的新型氯肟衍生物TCO-2與arimoclomol對(duì)不同位點(diǎn)磷酸化的tau蛋白表達(dá)的影響存在差異。Western blot結(jié)果顯示，TCO-2可以明顯降低 p-tau（Ser202）的表達(dá)，而對(duì) p-tau（Ser396）表達(dá)無影響；arimoclomol對(duì) p-tau（Ser202）以及 p-tau（Ser396）的表達(dá)均有抑制作用。據(jù) Wang等［18］研究發(fā)現(xiàn)，在體外實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶5（cdk-5）可明顯提高 tau蛋白 Ser199、Ser202、Thr205、Thr212、Thr231、Ser404位點(diǎn)的磷酸化，但不影響Ser396位點(diǎn)磷酸化。故本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示，新型氯肟衍生物TCO-2可能與特異性地抑制cdk-5激酶信號(hào)通路，從而下調(diào)磷酸化tau蛋白的表達(dá)有關(guān)。盡管在本研究中，動(dòng)物行為學(xué)結(jié)果、AChE活性以及Aβ1－42含量在 arimoclomol與 TCO-2兩種化合物干預(yù)下差異并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是不同磷酸化tau蛋白表達(dá)的差異提示，這兩種化合物可能通過誘導(dǎo)不同分子伴侶蛋白（包括sHSP、HSP70、HSP90等），從而抑制了不同影響tau蛋白磷酸化的激酶，但其更深層次的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Selkoe D J.Themolecular pathology of Alzheimer′s disease［J］.Neuron，1991，6（4）：487－98.

［2］ Glenner G G，Wong CW.Alzheimer′s disease：initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein［J］.Biochem BiophysResCommun，1984，120（3）：885－90.

［3］ Lee V M，Balin B J，Otvos L J，et al.A68：a major subunit of paired helical filaments and derivatized forms of normal Tau［J］.Science，1991，251（4994）：675－8.

［4］ Hardy J，Selkoe D J.The amyloid hypothesis of Alzheimer′s disease：progress and problems on the road to therapeutics［J］.Science，2002，297（5580）：353－6.

［5］ Francis P T，Palmer A M，Sims N R，et al.Neurochemical studies of early-onset Alzheimer′s disease.Possible influence on treatment［J］.N Engl JMed，1985，313（1）：7－11.

［6］ Roberson E D，Scearce-Levie K，Palop J J，et al.Reducing endogenous tau ameliorates amyloid beta-induced deficits in an Alzheimer′s disease mouse model［J］.Science，2007，316（5825）：750－4.

［7］ 李愛萍，趙 慧，李 韶，等.不同鼠種在Morris水迷宮學(xué)習(xí)記憶行為中的種屬差異［J］.中國(guó)行為醫(yī)學(xué)科學(xué)，2005，14（1）：29－31.

［7］ Li A P，Zhao H，LiS，etal.Species differencesofmuridae in the learning and memory behavior in morris water maze［J］.Chin J Behavioral Med Sci，2005，14（1）：29－31.

［8］ Hoshino T，Murao N，Namba T，etal.Suppression of Alzheimer′s disease-related phenotypes by expression of heat shock protein 70 in mice［J］.JNeurosci，2011，31（14）：5225－34.

［9］ Smith R C，Rosen K M，Pola R，et al.Stress proteins in Alzheimer′s disease［J］.Int JHyperthermia，2005，21（5）：421－31.

［10］Magrane J，Smith R C，Walsh K，et al.Heat shock protein 70 participates in the neuroprotective response to intracellularly expressed beta-amyloid in neurons［J］.J Neurosci，2004，24（7）：1700－6.

［11］Shimura H，Schwartz D，Gygi S P，et al.CHIP-Hsc70 complex ubiquitinates phosphorylated tau and enhances cell survival［J］.J Biol Chem，2004，279（6）：4869－76.

［12］Zhou Y，Vu K，Chen Y，et al.Chloro-oxime derivatives as novel smallmolecule chaperone amplifiers［J］.Bio Org Med Chem Lett，2009，19（11）：3128－35.

［13］Nanasi PP，Jednakovits A.Multilateralin vivoandin vitroprotective effects of the novel heat shock protein coinducer，bimoclomol：results of preclinical studies［J］.Cardiovasc Drug Rev，2001，19（2）：133－51.

［14］Gupta SC，Siddique H R，Saxena D K，etal.Hazardous effectof organophosphate compound，dichlorvos in transgenic Drosophila melanogaster（hsp70-lacZ）：induction of hsp70，anti-oxidant enzymes and inhibition of acetylcholinesterase［J］.Biochim Biophys Acta，2005，1725（1）：81－92.

［15］李 斌，郭德玉，李 林.三種老年癡呆動(dòng)物模型行為學(xué)比較［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，1999，7（1）：40－5.

［15］Li B，Guo D Y，Li L.Behavioral comparison among three animal modelsmimicking Alzheimer′s disease［J］.Acta Laborat Anim Sci Sin，1999，7（1）：40－5.

［16］樸景華，蒲小平，馬 建，等.類葉升麻苷對(duì)東莨菪堿所致記憶獲得性障礙的改善作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2001，17（6）：625－7.

［16］Piao JH，Pu X P，Ma J，et al.Effects of acetoside on improving the ability of learning and memory in mice［J］.Chin Pharmacol Bull，2001，17（6）：625－7.

［17］Yamada K，Nabeshima T.Animalmodels of Alzheimer′s disease and evaluation of anti-dementia drugs［J］.Pharmacol Ther，2000，88（2）：93－113.

［18］Wang JZ，Grundke-Iqbal I，Iqbal K.Kinases and phosphatases and tau sites involved in Alzheimer neurofibrillary degeneration［J］.Eur JNeurosci，2007，25（1）：59－68.