丹皮酚對脂多糖／三磷酸腺苷誘導的小膠質細胞NLRP3炎癥小體激活的影響

王 偉，戴 敏，徐忠東

（1.合肥師范學院生命科學系，安徽合肥 230601；2.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，省部共建新安醫(yī)學教育部重點實驗室，安徽合肥 230038）

小膠質細胞（microglia，MG）是中樞神經系統(tǒng)中主要的免疫活性細胞，在中樞神經系統(tǒng)的免疫調節(jié)過程中發(fā)揮核心作用［1］。近來研究表明，小膠質細胞中NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor family，pyrin domain-containing 3，NLRP3）炎癥小體的異常激活在阿爾采末?。ˋlzheimer’s disease，AD）和多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis，MS）等神經退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用［2－3］。NLRP3炎癥小體能夠被包括微生物毒素和β淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）在內多種物質激活，其激活后通過與其接頭蛋白凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）相互作用，招募半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1前體（pro-cysteinyl aspartate specific protease-1，pro-caspase-1），形成蛋白復合物“炎癥小體”，進而對白細胞介素-1β前體（pro-interleukin-1 beta，pro-IL-1β）發(fā)揮功能［4］。在中樞神經系統(tǒng)內，生理濃度的IL-1β能保護神經元免遭興奮性氨基酸毒性的損傷，然而過多的、持續(xù)的IL-1β產生，則對神經細胞具有明顯的損傷作用［5］。因此，抑制小膠質細胞NLRP3炎癥小體激活對治療AD等神經退行性疾病具有重要意義。

丹皮酚（paeonol，Pae）是牡丹根皮及蘿摩科徐長卿（Cynanchum paniculatiumKrrag）的主要活性成分之一，具有祛瘀止血、抗菌消炎、鎮(zhèn)靜解痙、退熱止痛等廣泛的藥理作用。既往研究表明［6］，Pae可通過絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）和核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信號途徑抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的小膠質細胞（BV-2）和巨噬細胞（RAW 264.7）腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和 IL-1β的生成及釋放。我們前期研究發(fā)現(xiàn)［7］，Pae能抑制TNF-α誘導的血管內皮細胞炎性因子的表達，減輕細胞炎癥反應。上述研究提示Pae具有良好的抑制細胞炎癥反應作用，然而，其是否通過調節(jié)NLRP3炎癥小體而抑制小膠質細胞炎性因子的釋放目前仍不清楚。因此，本研究采用LPS與三磷酸腺苷（adenosine 5′-triphosphate，ATP）誘導的大鼠原代小膠質細胞炎癥小體激活模型，從NLRP3炎癥小體途徑觀察Pae對小膠質細胞炎癥反應的抑制作用及其具體機制。

1 材料與方法

1.1 動物和主要試劑 新生SD大鼠（出生24 h內），動物合格證號：SCXK（皖）2005-001，安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。Pae（純度99%）、LPS、ATP、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和細胞ROS熒光探針（DCFH-DA）購于Sigma公司，Pae用DMSO溶解；DMEM／F12培養(yǎng)基和胎牛血清購于Gibco公司；細胞裂解液和BCA蛋白定量試劑盒購于江蘇碧云天生物技術有限公司；CD11b抗體購于Abcam公司；NLRP3、ASC、caspase-1和 GAPDH抗體購于Santa Cruz公司；Alexa Fluor 488標記的熒光二抗購自Invitrogen公司；IL-1βELISA檢測試劑盒購自北京達科為生物技術有限公司；其余所用試劑均為化學分析純。

1.2 原代大鼠小膠質細胞培養(yǎng) 無菌條件下取出新生大鼠大腦，用眼科鑷去除大腦表面血管和腦膜，并將皮質剝離，用眼科剪將大腦皮質剪碎成1 mm3的組織塊，置入含0.25%胰蛋白酶的消化液在37℃條件下消化30 min，血清終止消化，充分吹打成單細胞懸液，1 000 r·min－1離心 10 min，棄上清，用含10%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)基制成細胞懸液，以1×108個·L－1接種于75 cm2細胞培養(yǎng)瓶，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每隔2～3天換液1次。14 d后將培養(yǎng)瓶旋緊密封，于37℃的恒溫搖床中以200 r·min－1的速度振搖12 h，收集培養(yǎng)液，1 000 r·min－1離心 10 min，棄上清，用含 10%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)基重懸細胞，接種培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內孵育備用。

1.3 小膠質細胞鑒定 將小膠質細胞接種到含無菌玻片的培養(yǎng)孔內，細胞貼壁后取出玻片，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定，5%山羊血清室溫封閉30 min，兔抗大鼠 CD11b（1∶50）4℃過夜，再加入山羊抗兔二抗（1∶200），室溫避光孵育1 h，0.01%DAPI復染細胞核，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.4 實驗分組及給藥方法 取生長狀態(tài)良好的小膠質細胞以2×108個·L－1濃度接種96孔板，進行ELISA實驗和細胞內ROS水平的測定；以2×1010個·L－1濃度接種6孔板，進行Western blot檢測。實驗分組，①對照組：加入含10%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)基；②模型組：加入含0.5 mg·L－1LPS的培養(yǎng)基作用24 h后，5 mmol·L－1ATP繼續(xù)作用45 min；③Pae組：不同濃度 Pae（2.5、5、10μmol·L－1）首先作用細胞 1 h，然后加入 LPS（0.5 mg·L－1）作用細胞 24 h，5 mmol·L－1ATP繼續(xù)作用 45 min。細胞模型處理條件和藥物濃度選擇依據(jù)文獻和預實驗結果［8－9］。

1．5 ELISA法測定小膠質細胞上清液中IL-1β含量 小膠質細胞按分組處理24 h后，收集細胞培養(yǎng)上清液。1 500 r·min－1離心，取上清，ELISA法測定IL-1β濃度。操作步驟按說明書進行。在450 nm波長讀取OD值，根據(jù)標準曲線計算樣品濃度。

1．6 Western blot檢測細胞NLRP3、ASC、caspase-1蛋白水平 小膠質細胞按分組處理24 h后，每孔細胞加入150μl細胞裂解液，冰上裂解10 min。在12 000 r·min－1、4℃條件下離心 20 min，獲得上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。蛋白經10%SDS-PAGE電泳分離后，用300 mA電流將蛋白轉移到PVDF膜上，在5%脫脂奶粉中封閉1 h，在不同的一抗（1∶1 000）中孵育過夜（4℃）。PVDF膜經0.5%TBS-T溶液洗膜3次，再與HRP標記的二抗（1∶5 000）進行反應。用0.5%TBS-T溶液洗膜3次，ECL化學發(fā)光法顯影，X光膠片壓片曝光，用Image J軟件分析電泳條帶灰度值。

1．7 細胞內ROS水平測定 細胞內ROS水平測定參照文獻方法檢測［10］。小膠質細胞按分組處理24 h后，棄去上清液，PBS清洗2遍，加入DCFH-DA（5μmol·L－1）37℃避光孵育30 min，用 PBS清洗2遍，TECAN多功能酶標儀（激發(fā)和吸收波長分別為：485 nm和530 nm）讀取熒光光強度，結果以熒光強度（AU）表示。

2 結果

2.1 小膠質細胞形態(tài)學觀察和鑒定 培養(yǎng)10 d后，混合膠質細胞基本融合，相差顯微鏡下可見少量小膠質細胞生長于星形膠質細胞層上方，其胞體較小、折光性強、突起短?。‵ig 1A）。培養(yǎng)14 d后，相差顯微鏡下可見大量膠質細胞（Fig 1B），此時采取震蕩法純化小膠質細胞。細胞鑒定采用小膠質細胞表面特異性標志CD11b單克隆抗體進行免疫染色，熒光顯微鏡下可見細胞膜上有明顯的綠色熒光，符合細胞膜分布特點，證實為小膠質細胞（Fig 1C）。

2．2 Pae對小膠質細胞IL-1β分泌的影響 如Fig 2所示，同對照組相比，模型組細胞上清液中IL-1β水平明顯升高；同模型組相比，Pae各濃度組呈劑量依賴性抑制小膠質細胞IL-1β分泌，表明Pae對LPS＋ATP誘導的小膠質細胞IL-1β分泌具有明顯的抑制作用。

Fig 1 Identification of primary ratm icroglia（A）Primary cultured ratmicroglia for 10 days（×200）；（B）Primary cultured ratmicroglia for14 days（×200）；（C）Immunocytochemistry of CD11b-DAPIdouble staining in primary ratmicroglia（×100）

Fig 2 Effect of paeonol on IL-1βlevels in cultured supernatant of LPS／ATP induced primary ratm icroglia**P＜0.01 vs control；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model

2．3 Pae對小膠質細胞NLRP3炎癥小體的影響如Fig 3所示，同對照組相比，模型組細胞NLRP3、ASC和caspase-1蛋白水平明顯升高；同模型組相比，Pae中、高濃度組能明顯抑制LPS＋ATP上調的小膠質細胞NLRP3、ASC和caspase-1蛋白水平，表明Pae可能通過抑制NLRP3炎癥小體激活，從而減輕LPS＋ATP誘導的小膠質細胞炎癥反應。

2．4 Pae對小膠質細胞ROS水平的影響 如Fig 4所示，同對照組相比，模型組細胞內ROS水平明顯升高；同模型組相比，Pae各濃度組能明顯抑制LPS＋ATP誘導的小膠質細胞ROS水平，表明Pae可能通過調節(jié)細胞內ROS水平，從而抑制LPS＋ATP誘導的NLRP3炎癥小體激活。

Fig 3 Effect of paeonol on NLRP3，ASC and caspase-1 expression levels in LPS／ATP induced primary ratm icroglia**P＜0.01 vs control；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model

Fig 4 Effect of paeonol on ROS levels in LPS／ATP induced primary ratm icroglia**P＜0.01 vs control；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model

3 討論

炎癥小體最初被發(fā)現(xiàn)是在固有免疫反應中，作為機體防御病原體重要機制之一，其家族成員NLRP3近來在神經退行性疾病研究中受到了極高的關注。在Cuprizone誘導的小鼠MS模型中發(fā)現(xiàn)，通過敲除小鼠NLRP3基因能夠明顯延遲神經炎癥反應［3］。在AD發(fā)病機制的研究中發(fā)現(xiàn)，Aβ能夠激活小膠質細胞NLRP3炎癥小體［11］，伴隨而來的IL-1β釋放增多能夠進一步加重這種神經退行性疾病［12］。此外，在對嘌呤受體P2X配體門控性離子通道7（P2X purinoceptor 7，P2X7R）特 異 性 拮 抗 劑GSK1370319A藥理作用的研究中發(fā)現(xiàn)，GSK1370319A通過抑制P2X7R介導的膠質細胞NLRP3炎癥小體的激活和隨后的IL-1β的釋放，起到中樞神經系統(tǒng)保護作用［8］。上述研究提示，NLRP3炎癥小體有可能成為治療神經退行性疾病新的藥物靶點。

目前，體外小膠質細胞NLRP3炎癥小體激活模型的建立主要是通過雙信號系統(tǒng)，首先由第一信號LPS活化小膠質細胞，然后由高濃度ATP作為第二信號通過P2X7R激活NLRP3炎癥小體［13］。與既往報道一致［8］，本實驗發(fā)現(xiàn)ATP能上調LPS活化的小膠質細胞中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白水平，增加細胞上清液中IL-1β水平，表明小膠質細胞NLRP3炎癥小體激活模型建立成功。此外，我們也發(fā)現(xiàn)LPS和ATP作用小膠質細胞24 h后，能明顯提升細胞內ROS水平。細胞內ROS水平的升高目前已經證明參與激活NLRP3炎癥小體，并且ROS的抑制劑或清除劑能抑制NLRP3炎癥小體的激活［14］。因此，我們推測細胞內 ROS水平的升高也參與了LPS和ATP雙信號激活的小膠質細胞NLRP3炎癥小體。

Pae在神經退行性疾病中的治療作用逐漸受到關注。在Aβ誘導的AD大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，Pae能明顯改善模型大鼠行為學指標［15］。在D-半乳糖誘導的衰老小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，Pae能減少模型小鼠氧化應激、緩解海馬及顳葉皮層神經元損傷、改善學習和記憶能力［16］。體外研究發(fā)現(xiàn)，Pae能通過抑制MAPK和NF-κB信號途徑減少LPS誘導的小膠質細胞炎性因子 IL-1β的釋放［6］。本實驗發(fā)現(xiàn)，Pae能抑制LPS和ATP雙信號上調的NLRP3、ASC和caspase-1蛋白水平，減少細胞上清液中IL-1β濃度，表明Pae能抑制LPS和ATP誘導的小膠質細胞NLRP3炎癥小體的激活。在本實驗中，我們還發(fā)現(xiàn)Pae能下調模型組ROS水平，提示Pae可能通過下調細胞內ROS水平抑制小膠質細胞NLRP3炎癥小體的激活。此外，在小膠質細胞中，Pae已被證明能抑制LPS誘導的NF-κB激活［6］。有研究表明，激活的NF-κB能上調NLRP3基因表達而參與激活NLRP3炎癥小體［17］。因此，我們推測Pae除下調小膠質細胞內ROS水平外，還可能通過NF-κB信號途徑抑制NLRP3炎癥小體激活。然而，有關Pae對NLRP3炎癥小體調控的具體機制還有待于進一步研究。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)Pae能抑制LPS和ATP雙信號激活的小膠質細胞NLRP3炎癥小體，減少細胞上清液IL-1β水平，Pae對NLRP3炎癥小體抑制作用可能與其下調小膠質細胞內ROS水平有關。本研究初步揭示了Pae抑制小膠質細胞炎癥反應的分子作用機制，為進一步研究Pae防治神經退行性疾病提供了新的實驗依據(jù)。

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