銀杏內(nèi)酯B對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞連接蛋白的影響及其分子機(jī)制研究

劉雪青，陳北冬，鮑 利，吳 偉，孫文佳，齊若梅

（衛(wèi)生部北京醫(yī)院／老年醫(yī)學(xué)研究所，衛(wèi)生部老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種慢性血管炎癥性疾?。?］，其病理過(guò)程涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血小板活化、白細(xì)胞浸潤(rùn)等。內(nèi)皮細(xì)胞受損在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中是一個(gè)主要的病理特征。生理狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞之間的緊密連接蛋白阻止循環(huán)中的有害成分向血管內(nèi)膜下滲透。在動(dòng)脈粥樣硬化血管炎癥的病理狀態(tài)下，循環(huán)中的細(xì)胞因子和趨化因子增多，損傷內(nèi)皮細(xì)胞連接蛋白功能，導(dǎo)致血管滲透性增高，炎癥細(xì)胞向血管內(nèi)膜下浸潤(rùn)，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的血管炎癥反應(yīng)。

內(nèi)皮細(xì)胞連接蛋白功能主要包括緊密連接（tight junction，TJ）、縫隙連接（gap junction，GAP）和黏著連接（adherens junction，AJ）。JAM-A（junctional adhesion molecule A）是參與構(gòu)成緊密連接復(fù)合體的重要蛋白，可通過(guò)密閉小帶ZO（zonula occuden）與細(xì)胞骨架相連，具有調(diào)節(jié)血管滲透性、參與白細(xì)胞遷移等功能。臨床研究［2］表明動(dòng)脈粥樣硬化患者血漿中JAM-A的水平明顯增高，TNFα促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞JAM-A的表達(dá)，從而增強(qiáng)血小板與內(nèi)皮細(xì)胞黏附。Cx43（connexin 43）是組成縫隙連接的基本單位，在相鄰細(xì)胞之間形成通道結(jié)構(gòu)，允許可溶性小分子在相鄰細(xì)胞間通過(guò)，維持血管內(nèi)皮的穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)［3］，早期動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)膜增厚區(qū)Cx43明顯增多。本研究重點(diǎn)探討ox-LDL損傷內(nèi)皮細(xì)胞JAM-A和Cx43的變化以及藥物干預(yù)的影響。

銀杏內(nèi)酯B（ginkgolide B，GB）是血小板活化因子受體拮抗劑，我們先前的研究表明［4］，銀杏內(nèi)酯B對(duì)ox-LDL刺激的內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。然而，銀杏內(nèi)酯B是否能夠改善內(nèi)皮細(xì)胞連接蛋白的功能尚不清楚。本研究重點(diǎn)評(píng)價(jià)了銀杏內(nèi)酯B對(duì)ox-LDL刺激的內(nèi)皮細(xì)胞JAM-A、Cx43表達(dá)的影響以及分子機(jī)制，并通過(guò)白細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)分析銀杏內(nèi)酯B對(duì)血管滲透性的影響，從而揭示銀杏內(nèi)酯B減輕血管炎癥反應(yīng)的新的藥理學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 銀杏內(nèi)酯B購(gòu)自江蘇大觀園商貿(mào)公 司，純 度 為 95% （批 號(hào)：BAT2007115）。LY294002、膠原酶、明膠購(gòu)自Sigma公司；胰蛋白酶、特級(jí)胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司，Medium 199培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco（Invitrogen公司）。Transwell小室購(gòu)自Corning公司。β-actin抗體購(gòu)自 Santa Cruz公司；JAM-A抗體購(gòu)自Epitomics公司；Cx43購(gòu)自Cell Signaling公司。辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG以及FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1．2 ox-LDL的制備 取新鮮人血清，用梯度超速離心法分離低密度脂蛋白。用5μmol·L－1硫酸銅氧化低密度脂蛋白，37℃、16 h后，加1 mmol·L－1EDTA終止氧化。用PBS（pH 7.3）4℃透析24 h，用0.22μm的Millex濾器過(guò)濾，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 取新鮮臍帶，用0.1%的Ⅰ型膠原酶灌注消化15 min，收集臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，1 000 r·min－1，離心 6 min，用M199培養(yǎng)基（20%胎牛血清、1×105U·L－1青霉素、1×105U·L－1鏈霉素和1%谷氨酰胺）懸浮細(xì)胞，接種于培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。細(xì)胞傳至第3代用于實(shí)驗(yàn)。

1．4 W estern blot方法檢測(cè)蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)前饑餓細(xì)胞12 h，分別用銀杏內(nèi)酯 B（0.2、0.4、0.6 g·L－1）及 LY294002（1、3、10μmol·L－1）孵育 1 h，加入 ox-LDL（0.1 g·L－1）刺激細(xì)胞 4 h。去除培養(yǎng)基，用PBS洗兩遍，去除上清，用細(xì)胞裂解液RIPA裂解細(xì)胞，收集蛋白。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取15μg蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE后，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用5%牛血清白蛋白室溫下封閉1 h。分別加入特異性抗體（JAM-A、Cx43、β-actin），4℃孵育過(guò)夜。用 TBS-T（100 mmol·L－1Tris，150 mmol·L－1NaCl，0.1%Tween）洗膜3次，每次5 min，加入二抗，室溫孵育1 h。TBS-T洗膜3次，每次5 min。加ECL發(fā)光液，用凝膠成像儀成像。

1．5 免疫熒光檢測(cè)JAM-A、Cx43在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá) 無(wú)菌蓋玻片置于6孔板中，接種細(xì)胞。待細(xì)胞融合，用含0.5%胎牛血清的M199培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞12 h，銀杏內(nèi)酯B孵育細(xì)胞1h，ox-LDL刺激細(xì)胞4 h。去除培養(yǎng)基，用PBS洗3次，用4%多聚甲醛室溫下固定細(xì)胞10 min。然后，PBS洗3次，每次5 min。用5%牛血清白蛋白封閉1 h，一抗（1∶100）孵育，4℃過(guò)夜。PBS洗3次，每次5 min，加FITC標(biāo)記的二抗（1∶100），室溫下避光孵育1 h。PBS洗3次，加 DAPI（1∶1 000）染核5 min，洗3次。用50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度，用尼康CCD成像系統(tǒng)成像。實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。

1.6 白細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 用collagen包被Transwell小室濾膜外表面，超凈臺(tái)內(nèi)紫外照射3 h，充分干燥。分別在Transwell小室內(nèi)加入100μl、小室外加入600μl細(xì)胞培養(yǎng)基，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中平衡1 h。去除小室內(nèi)的培養(yǎng)基，接種100μl細(xì)胞懸液（1×109·L－1），培養(yǎng)72 h，實(shí)驗(yàn)前饑餓細(xì)胞 12 h。用銀杏內(nèi)酯B孵育細(xì)胞1 h，然后用ox-LDL刺激細(xì)胞4 h，加入 U937單核細(xì)胞株（1×109·L－1），共培養(yǎng) 24 h。在PBS中浸泡小室后用4%多聚甲醛固定10 min，用0.5%結(jié)晶紫染色標(biāo)識(shí)單核細(xì)胞30min，PBS洗3次，用PBS浸濕的棉簽輕輕擦拭，去除小室內(nèi)側(cè)的內(nèi)皮細(xì)胞。取下濾膜，置于載玻片上。顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)單核細(xì)胞，用CCD成像。實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 蛋白表達(dá)的灰度分析數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，采用單因素方差分析studentt檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1 銀杏內(nèi)酯 B對(duì) ox-LDL刺激的內(nèi)皮細(xì)胞JAM-A表達(dá)的影響 JAM-A存在于內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接處，JAM-A的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)白細(xì)胞向血管內(nèi)膜下遷移。結(jié)果顯示，ox-LDL刺激內(nèi)皮細(xì)胞4 h后，JAM-A表達(dá)增加了22%，與對(duì)照組比較有明顯差異（P＜0.05）。銀杏內(nèi)酯 B（0.4、0.6 g·L－1）明顯抑制了ox-LDL刺激的內(nèi)皮細(xì)胞JAM-A的表達(dá)（P＜0.05）（Fig 1）。我們用免疫熒光法進(jìn)一步觀察了JAM-A在內(nèi)皮細(xì)胞中的分布。結(jié)果顯示，ox-LDL刺激細(xì)胞后，JAM-A在胞質(zhì)及胞膜上表達(dá)均明顯增多，0.6 g·L－1銀杏內(nèi)酯B處理的細(xì)胞JAM-A表達(dá)基本恢復(fù)到正常水平（Fig 2）。

Fig 1 Effect of ginkgolide B on JAM-A expression in ox-LDL-treated HUVECsA：JAM-A expression was detected by Western blot；B：Densitometry analysis of JAM-A expression.Data are representatives of four independent experiments.＃P＜0.05 compared with cells without ox-LDL treatment；*P＜0.05 compared with cells treated with ox-LDL alone

Fig 2 Effect of ginkgolide B on JAM-A expression in ox-LDL-treated HUVECsA：Immunoflurescence staining of JAM-A in HUVECs（green）；B：Staining of HUVECsnuclearwith DAPI（blue）；C：Merged images combining the green immunoflurescence of JAM-A with the blue-nuclear staining（×400）.

2．2 銀杏內(nèi)酯B對(duì)ox-LDL刺激的內(nèi)皮細(xì)胞Cx43表達(dá)的影響 Cx43是細(xì)胞膜上介導(dǎo)炎癥細(xì)胞／蛋白通過(guò)的縫隙連接蛋白。結(jié)果顯示，ox-LDL刺激內(nèi)皮細(xì)胞，Cx43表達(dá)增加了24%（P＜0.05）。銀杏內(nèi)酯B以劑量依賴(lài)的方式抑制了Cx43表達(dá)，0.4 g·L－1和0.6 g·L－1濃度的銀杏內(nèi)酯B減少了Cx43的表達(dá)（P＜0.05）（Fig 3）。同樣，我們用免疫熒光方法進(jìn)一步證實(shí)，ox-LDL刺激后Cx43在細(xì)胞膜上表達(dá)明顯增多，而0.6 g·L－1銀杏內(nèi)酯B處理后，Cx43在膜上的表達(dá)減少到基礎(chǔ)水平（Fig 4）。

2．3 LY294002對(duì)ox-LDL刺激內(nèi)皮細(xì)胞JAM-A、Cx43表達(dá)的影響 最近，我們報(bào)道了銀杏內(nèi)酯B能夠抑制Akt磷酸化，減少內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。LY294002是PI3K特異性抑制劑，首先我們確認(rèn)了其能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的Akt磷酸化（Fig 5，A、B），進(jìn)一步探討了Akt活化是否影響JAM-A、Cx43的表達(dá)。結(jié)果顯示，LY294002（10μmol·L－1）明顯抑制了ox-LDL刺激的JAM-A、Cx43表達(dá)（P＜0.05）（Fig 5，C、D、E、F）。這一結(jié)果提示，銀杏內(nèi)酯 B抑制ox-LDL刺激的內(nèi)皮細(xì)胞JAM-A、Cx43的表達(dá)可能與抑制Akt信號(hào)通路相關(guān)。

Fig 3 Effect of ginkgolide B on Cx43 expression in ox-LDL-treated HUVECsA：Cx43 expression was detected by Western blot；B：Densitometry analysis of Cx43 expression.Data are representatives of four independent experiments.＃P＜0.05 compared with cells without ox-LDL treatment；*P＜0.05 compared with cells treated with ox-LDL alone.

Fig 4 Effect of ginkgolide B on Cx43 expression in ox-LDL-treated HUVECsA：Immunoflurescence staining of Cx43 in HUVECs（green）；B：Staining of HUVECs nuclear with DAPI（blue）；C：Merged images combining the green immunoflurescence of Cx43 with the blue-nuclear staining（×400）.

Fig 5 Effect of LY294002 on JAM-A and Cx43 expressions in ox-LDL-treated HUVECsA，C，E：Akt phosphorylation，JAM-A and Cx43 expressionswere detected by Western blot.B，D，F(xiàn)：Densitometry analysis of Akt phosphorylation，JAM-A and Cx43 expressions.Data are representativesof four independentexperiments.＃P＜0.05 compared with cellswithoutox-LDL treatment；*P＜0.05 compared with cells treated with ox-LDL alone.

2．4 銀杏內(nèi)酯B對(duì)白細(xì)胞遷移的影響 內(nèi)皮細(xì)胞連接蛋白功能損傷能夠使炎癥蛋白以及炎癥細(xì)胞向血管內(nèi)膜下遷移，血管滲透性增加。因此，我們觀察了銀杏內(nèi)酯B對(duì)減少炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)／遷移的作用。我們用Transwell實(shí)驗(yàn)，觀察了銀杏內(nèi)酯B對(duì)ox-LDL刺激內(nèi)皮細(xì)胞損傷時(shí)單核細(xì)胞的遷移情況。結(jié)果顯示，與未經(jīng)任何處理的內(nèi)皮細(xì)胞比較，ox-LDL刺激內(nèi)皮細(xì)胞后，單核細(xì)胞向Transwell小室外遷移的數(shù)量增多。銀杏內(nèi)酯B（0.6 g·L－1）處理的細(xì)胞，單核細(xì)胞遷移數(shù)量明顯減少（Fig 6）。表明銀杏內(nèi)酯B能夠通過(guò)抑制連接蛋白JAM-A、Cx43的表達(dá)，減少白細(xì)胞遷移，改善血管滲透性。

Fig 6 Effect of ginkgolide B on monocyte transm igration across HUVECsA：Effect of ginkgolide B on monocyte transmigration across HUVECs（×200）；B：Quantitative analysis of U937 transmigration.Data are representatives of four independent experiments.＃P＜0.05 compared with cells without ox-LDL treatment；*P＜0.05 compared with cells treated with ox-LDL alone

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是復(fù)雜的慢性血管炎癥性疾病，內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中的早期表現(xiàn)。正常狀態(tài)下，血管內(nèi)皮細(xì)胞之間通過(guò)緊密連接、黏著連接、縫隙連接等構(gòu)成血管壁屏障，阻止循環(huán)中的有害因子向血管內(nèi)膜下滲透。病理狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞連接功能受損，血管通透性增強(qiáng)，導(dǎo)致炎癥分子以及炎癥細(xì)胞穿透血管屏障向血管內(nèi)膜下聚集，促進(jìn)血管炎癥反應(yīng)。

JAM-A是緊密連接相關(guān)蛋白，屬于小分子IgG超家族，在內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板等多種細(xì)胞表面均有表達(dá)。JAM-A通過(guò)與不同配體結(jié)合發(fā)揮多種功能。內(nèi)皮細(xì)胞表面的JAM-A通過(guò)與相鄰細(xì)胞的JAM-A相互作用構(gòu)成緊密連接屏障［5］。病理狀態(tài)下，血小板表面的JAM-A與內(nèi)皮細(xì)胞表面的JAM-A相互作用，介導(dǎo)血小板與內(nèi)皮細(xì)胞黏附。利用siRNA技術(shù)沉默人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的JAM-A基因，血小板黏附于炎癥內(nèi)皮細(xì)胞的能力明顯減弱［6］。此外，JAM-A還參與白細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞旁途徑滲透到血管內(nèi)膜下的過(guò)程［7-8］，這一過(guò)程可能是由內(nèi)皮細(xì)胞表面的JAM-A與白細(xì)胞表面的配體LFA-1結(jié)合實(shí)現(xiàn)的［9］。內(nèi)皮細(xì)胞是血管壁的第一道屏障，病理狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞損傷時(shí)，JAM-A介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞與血小板黏附、白細(xì)胞遷移反應(yīng)。Cx43是構(gòu)成縫隙連接的基本單位，縫隙連接通訊結(jié)構(gòu)功能異常在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成中具有重要作用［10］。研究表明，Cx43的過(guò)表達(dá)可能參與了白細(xì)胞向血管內(nèi)膜下浸潤(rùn)的過(guò)程［11-12］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示，利用藥物或基因療法降低內(nèi)皮細(xì)胞Cx43的表達(dá)能明顯抑制動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展［13］。Wei等［14］報(bào)告了銀杏葉提取物EGb761能抑制內(nèi)皮細(xì)胞Cx43的表達(dá)。

銀杏內(nèi)酯B是中藥銀杏葉的提取物成分之一，為血小板活化因子受體拮抗劑，具有抑制血小板功能、抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用［15］。本研究的結(jié)果提示，ox-LDL刺激內(nèi)皮細(xì)胞JAM-A、Cx43的表達(dá)明顯增多，而銀杏內(nèi)酯B能夠下調(diào)JAM-A、Cx43的表達(dá)。PI3K／Akt信號(hào)通路與多種炎癥反應(yīng)有關(guān)，參與調(diào)控單核細(xì)胞向血管內(nèi)膜下遷移浸潤(rùn)［16］。我們先前的研究表明，銀杏內(nèi)酯B能通過(guò)抑制PI3K／Akt信號(hào)通路的激活，抑制血小板活化，減少血小板及內(nèi)皮細(xì)胞炎癥蛋白 PF4、CD40L、ICAM-1等表達(dá)［17］。本研究進(jìn)一步證實(shí)，抑制Akt磷酸化同樣能夠抑制ox-LDL刺激內(nèi)皮細(xì)胞連接蛋白的表達(dá)。表明Akt是銀杏內(nèi)酯B藥理作用的一個(gè)重要靶點(diǎn)。此外，我們通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)，銀杏內(nèi)酯B減少單核細(xì)胞向損傷的內(nèi)皮細(xì)胞下遷移。這些結(jié)果表明銀杏內(nèi)酯B能夠通過(guò)改善內(nèi)皮細(xì)胞連接蛋白功能，改善血管滲透性。

綜上所述，銀杏內(nèi)酯B能降低ox-LDL刺激內(nèi)皮細(xì)胞JAM-A、Cx43表達(dá)，改善內(nèi)皮細(xì)胞連接蛋白功能，從而改善血管滲透性。這一藥理學(xué)效應(yīng)可能與抑制PI3K／Akt信號(hào)通路有關(guān)。本研究為銀杏內(nèi)酯B抗動(dòng)脈粥樣硬化的研究提供了新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有重要的科學(xué)意義。

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