甘草酸對AGEs培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞及ECM表達(dá)的影響

侯紹章，鄭芳芳，李 媛，高 嶺

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系，2.寧夏心腦血管疾病重點(diǎn)實驗室，3.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，4.寧夏醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，寧夏銀川 750004）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是常見的糖尿病慢性微血管并發(fā)癥，是終末期腎衰的主要原因之一。糖尿病患者長期的高血糖與體內(nèi)一些半衰期較長的蛋白質(zhì)通過非酶糖化反應(yīng)生成糖化終產(chǎn)物（advanced glycation endproducts，AGEs），這是DN的一個重要發(fā)病機(jī)制。腎小球系膜細(xì)胞膜存在AGEs受體，AGEs與系膜細(xì)胞特異性受體結(jié)合后，能影響一系列細(xì)胞因子的釋放，并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致腎小球肥大、ECM積聚和腎小球硬化。生理條件下，ECM產(chǎn)生和降解的動態(tài)平衡處于機(jī)體的精確調(diào)控下。近年來的研究表明，由于糖代謝紊亂及其所導(dǎo)致的血流動力學(xué)、細(xì)胞因子、生長因子等多種因素綜合作用會使ECM生成增加而降解減少，這成為DN發(fā)生、發(fā)展的重要原因。FN是一類重要的高分子糖蛋白，在正常腎組織主要分布于腎小球系膜區(qū)，彼此以纖維狀結(jié)構(gòu)相連，對維持腎小球正常結(jié)構(gòu)起著重要的作用［1］。C-Ⅳ以膠原蛋白的非纖維形式存在，主要由上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、系膜細(xì)胞產(chǎn)生，它穿透整個腎小球形成膠原纖維網(wǎng)，并通過結(jié)合細(xì)胞黏附分子起到機(jī)械屏障作用，在ECM增殖中占主要成份［2］。

近年來，許多研究力求從草藥中尋找抗糖尿病藥，如紫檀櫚［3］、海參蟲草［4］和匙羹藤［5］等。甘草酸（glycyrrhizic acid，GA）是從甘草中提取的含量最高的皂苷類成分，研究表明，GA表現(xiàn)出諸如抗?jié)儭㈧钐?、抗病毒、抗炎、抗糖尿病、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)和增強(qiáng)免疫等多種藥理作用［6－8］。本實驗擬研究GA對AGEs培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及ECM的成分FN和C-Ⅳ的影響，為今后探討GA治療DN的作用及可能機(jī)制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥品及試劑 GA（日本東京化成工業(yè)公司，TCI），大鼠腎小球系膜細(xì)胞株HBZY-1（北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院），AGEs（Millipore公司，121800-10MG），大鼠纖維連接蛋白ELISA試劑盒（博士德生物），大鼠Ⅳ型膠原酶聯(lián)免疫試劑盒（CUSABIO），MTT試劑盒和細(xì)胞周期檢測試劑盒（南京凱基），細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）（Hyclone公司）。培養(yǎng)瓶、凍存管、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板和吸管（Corning公司）。

1.1.2 實驗儀器 CO2培養(yǎng)箱（NO.NUAIR-NU-5510E，美國），超凈工作臺（BCM-1300A，蘇凈安泰），CF16-RX高速低溫離心機(jī)（日立公司），酶標(biāo)儀（Bio-Tek），流式細(xì)胞儀（BD FACSCalibur），電子顯微鏡（BX61），蛋白成像系統(tǒng)（Bio-RAD）。

1.2 實驗方法

1.2.1 HBZY-1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 傳代培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞，在含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到80%融合時，用0.25%胰酶消化（37℃消化1 min）傳代，置于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃孵育24 h。根據(jù)不同實驗所需細(xì)胞數(shù)，取不同細(xì)胞用胰酶消化制成細(xì)胞懸液。根據(jù)實驗需要，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上或培養(yǎng)瓶里，繼續(xù)培養(yǎng)48 h使細(xì)胞生長達(dá)融合。細(xì)胞分組為：BSA對照組（200 mg·L－1的 BSA）、AGEs組（200 mg·L－1）、AGEs＋甘草酸組。

1.2.2 MTT細(xì)胞增殖檢測 取對數(shù)生長期的HBZY-1細(xì)胞，用胰酶消化后配成5×107·L－1懸液，接種到96孔培養(yǎng)板中，分為BSA對照組（200 mg·L－1）、AGEs組（200 mg·L－1）、AGEs＋甘草酸組，甘草酸濃度依次設(shè)為（12.5、25、50、100、200、400 μmol·L－1），每組設(shè) 5個復(fù)孔，各組設(shè) 3個生物學(xué)重復(fù)。每孔加入懸液100μl，24 h貼壁換液后，按實驗分組分別處理48 h，每孔加入50μl 1×MTT（5 g·L－1）孵育 4 h，鏡下觀察，MTT摻入細(xì)胞內(nèi)，吸出上清，加入150μl DMSO使細(xì)胞內(nèi)甲臜溶解，用平板搖床搖勻振蕩10 min，待細(xì)胞完全溶解后，放入自動酶標(biāo)儀490 nm波長讀數(shù)，并記錄OD值，確定甘草酸的劑量。

1.2.3 細(xì)胞周期檢測 將接種密度為1×109·L－1的HBZY-1細(xì)胞分組后分別處理48 h，收集細(xì)胞，用PBS洗兩次，加70%的乙醇固定細(xì)胞，4℃過夜，次日離心（4℃，1 000 r·min－1，10 min）洗去乙醇，加入RNase 37℃孵育30 min，PI染色，室溫避光固定30 min。流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行周期測定。

1.2.4 ELISA法檢測細(xì)胞上清液FN和Ⅳ型膠原在細(xì)胞培養(yǎng)48 h末，收集每組細(xì)胞上清液，采用酶聯(lián)免疫法測定FN和Ⅳ型膠原，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 計量資料以s表示，應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行組間比較。

2 結(jié)果

2．1 甘草酸對AGEs誘導(dǎo)HBZY-1細(xì)胞增殖的影響 分別以不同濃度的甘草酸（12.5、25、50、100、200、400μmol·L－1）作用于 AGEs誘導(dǎo)的 HBZY-1細(xì)胞48 h，MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖。結(jié)果顯示：在GA為100μmol·L－1時對正常細(xì)胞無明顯影響，但對AGEs組細(xì)胞有抑制作用。作為我們后續(xù)實驗的濃度。與BSA對照組相比，AGEs組細(xì)胞增殖明顯增加（P＜0.05），與AGEs組相比，AGEs＋甘草酸組細(xì)胞增殖受到抑制且有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見 Fig 1。

2．2 甘草酸對AGEs誘導(dǎo)HBZY-1細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞儀分析顯示，與BSA對照組相比，AGEs組細(xì)胞S期延長，G1期縮短，且細(xì)胞增殖指數(shù)PI明顯升高（P＜0.05），表明AGEs可刺激HBZY-1的增殖。在藥物干預(yù)后，甘草酸有增加G1期細(xì)胞，降低S期細(xì)胞的作用，且PI降低，表明甘草酸可抑制HBZY-1在AGEs刺激下的過度增殖，起到保護(hù)HBZY-1的作用。見Fig 2和Tab 1。

Fig 1 Effect of GA on cell proliferation as determ ined by MTT assay*P＜0．05 vs BSA group；＃P＜0．05 vs AGEs group

Tab 1 Effect of GA on the cell cycling phase of HBZY-1 in AGEs medium detected w ith flow cytometric analysis

Tab 1 Effect of GA on the cell cycling phase of HBZY-1 in AGEs medium detected w ith flow cytometric analysis

*P＜0.05 vs BSA group；＃P＜0.05 vs AGEs group

Group G1S PI／%BSA 62.69±4.19 31.48±1.04 35.01±4.21 AGEs 53.81±1.51*38.84±1.94*44.93±0.25*AGEs＋GA 58.79±2.37＃ 34.89±1.13＃ 42.16±1.04＃

Tab 2 Effect of GA on HBZY-1 cell secretion FN and typeⅣcollagen induced by AGEs

2．3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中FN和Ⅳ型膠原含量的變化 實驗結(jié)果表明，正常情況下，體外培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞具有分泌ECM的功能，但在高糖情況下，系膜細(xì)胞分泌FN和Ⅳ型膠原明顯升高（P＜0.05）。說明高糖對HBZY-1細(xì)胞分泌FN和Ⅳ型膠原有促進(jìn)作用。甘草酸組FN和Ⅳ型膠原含量有所減少（P＜0.05）。見Tab 2。

3 討論

腎小球系膜細(xì)胞在正常情況下由于有抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖因子的存在，所以生長和分裂速率很慢［9］。但在病理條件下，生長與抑制失衡，增殖活躍，產(chǎn)生過多的系膜基質(zhì)，導(dǎo)致系膜硬化，并最終形成腎小球硬化［10］。因此，抑制腎小球系膜細(xì)胞的過度增殖一直是防治腎臟纖維化的重要策略之一。

已有證據(jù)表明外源性的AGEs可造成實驗動物的DN［11］，用AGEs培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞可導(dǎo)致其增殖及產(chǎn)生ECM增加［12］，這說明AGEs可獨(dú)立于高血糖作用于腎小球系膜細(xì)胞誘發(fā)DN。

ECM積聚是腎小球疾病發(fā)展至腎小球硬化的主要病理改變基礎(chǔ)［13］。腎小球的3種固有細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞）均能產(chǎn)生ECM，其中尤以系膜細(xì)胞產(chǎn)生能力最強(qiáng)。ECM的大量積聚是腎小球硬化的重要因素，系膜細(xì)胞是腎小球內(nèi)產(chǎn)生ECM的重要來源。正常生理情況下，ECM的合成與降解保持在一種動態(tài)平衡之中，但系膜細(xì)胞增殖后會打破平衡，導(dǎo)致ECM大量積聚。本實驗結(jié)果表明，甘草酸能抑制AGEs誘導(dǎo)的HBZY-1細(xì)胞的異常增殖，改變細(xì)胞周期，降低增殖指數(shù)，降低細(xì)胞FN和C-Ⅳ的分泌。這說明甘草酸能對抗AGEs對HBZY-1細(xì)胞的損傷作用，其可能是通過抑制AGEs誘導(dǎo)細(xì)胞的異常增殖來保護(hù)細(xì)胞免受AGEs的損害。另外，甘草酸能降低ECM中FN和C-Ⅳ的分泌。

Fig 2 Effect of GA on HBZY-1 cell cycle changes induced by AGEsA：BSA group；B：AGEs group；C：AGEs＋GA group

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