轉(zhuǎn)導(dǎo)血紅素氧合酶-1蛋白減輕腦缺血／再灌注沙土鼠海馬神經(jīng)元的損傷

萬曉紅，王 雁，趙國良，陳華梅，邵建林

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，云南 昆明 650101；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，云南昆明 650032）

人類Ⅰ型免疫缺陷病毒（HIV-1）的轉(zhuǎn)錄反式激活因子（trans-activator of transcription，TAT）能夠主動穿過細(xì)胞膜進入細(xì)胞內(nèi)部。這種具有攜帶外源蛋白穿透細(xì)胞膜能力的特異多肽序列稱為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域（protein transduction domain，PTD）或細(xì)胞穿膜肽（cell penetrating peptide，CPP）［1］。TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域能夠?qū)⑴c之共價連接的生物大分子（如核酸、多肽、蛋白質(zhì)等）非特異地轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)部。TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域的發(fā)現(xiàn)為蛋白質(zhì)治療帶來了新的曙光［2］。

血紅素氧合酶-1（HO-1）是腦內(nèi)重要的內(nèi)源性保護物質(zhì)之一，在細(xì)胞中發(fā)揮抗氧化、抗凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖等功能。被激活的HO-1參與其他基因表達(dá)的調(diào)控［3－4］，產(chǎn)生抑制神經(jīng)元凋亡作用［5－6］。最近研究報道［7－8］利用 PTD轉(zhuǎn)導(dǎo) HO-1蛋白，改善大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型的腦血管痙攣。本研究擬評價轉(zhuǎn)導(dǎo)HO-1蛋白對腦缺血／再灌注沙土鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響，探討直接HO-1蛋白治療的腦保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 ♂沙土鼠50只，體質(zhì)量60～80 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 主要儀器及試劑 pET-21a（＋）-p53-11R質(zhì)粒、大腸桿菌Topo 10、大腸桿菌 BL21-DE3（Novagen公司，美國），質(zhì)粒純化試劑盒（上海生工生物工程有限公司），HO-1、Caspase-3抗體（Calbiochem公司，英國）。

1．3 pET-21a（＋）-11R質(zhì)粒的構(gòu)建［8－9］從美國Novagen生物技術(shù)公司購買pET-21a（＋）-p53-11R質(zhì)粒，Bam HI和Hind III雙酶切除p53。測序、鑒定由上海生工生物工程有限公司完成。

1．4 pET-21a（＋）-11R-HO-1質(zhì)粒的構(gòu)建［8，9］以Topo TA vector質(zhì)粒為摸板PCR擴增HO-1cDNA的編碼序列，上游引物為：5′-GGATCCATGGAGCGTCCGCAACCCGACAGC-3′；下游引物為：5′-AAGCTTGCATGGCATAAAGCCCTACAGCAAC-3′。用 Bam HI和HindⅢ對質(zhì)粒載體pET-21a（＋）-11R和HO-1 DNA目的片段分別進行雙酶切，連接產(chǎn)物用經(jīng)典CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Topo 10，進行Bam HI和HindⅢ雙酶切，pET-21a（＋）-11R-HO-1重組質(zhì)粒進行DNA測序鑒定。測序、鑒定由上海生工生物工程有限公司完成。

1．5 11R-HO-1細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)及11R-HO-1蛋白鑒定、收集［8－9］將測序正確的 pET-21a（＋）-11RHO-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 BL21-DE3，挑取單克隆接種于5 ml氨芐抗性LB液體培養(yǎng)基過夜擴增，收集蛋白上清，電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，鑒定目的蛋白的表達(dá)量與純度。把純化的11R-HO-1融合蛋白采用Bradford法行蛋白定量，－80℃凍存?zhèn)溆谩Ｓ缮虾Ｉど锕こ逃邢薰就瓿伞?/p>

1.6 沙土鼠腦缺血／再灌注損傷模型［10］腹腔注射100 mg·kg－1氯胺酮麻醉沙土鼠，加溫毯上分離暴露沙土鼠兩側(cè)頸總動脈，分別將2個無損傷動脈同時夾住兩頸總動脈阻斷血流，5 min后松開雙側(cè)動脈夾恢復(fù)腦血流。加溫毯上觀察同時監(jiān)測肛溫維持37℃，沙土鼠蘇醒后正常喂養(yǎng)。

1.7 實驗分組及處置 50只沙土鼠隨機分為5組（n＝10）：腦缺血／再灌注（C組），沙土鼠行腦缺血／再灌注損傷。腦缺血／再灌注＋生理鹽水組（S組），沙土鼠腹腔注射5 mg·kg－1生理鹽水，3 h后行腦缺血／再灌注損傷。腦缺血／再灌注＋11R組（R組），沙土鼠腹腔注射5 mg·kg－111R蛋白，3 h后行腦缺血／再灌注損傷。腦缺血／再灌注＋5 mg·kg－111R-HO-1組（H1組），沙土鼠腹腔注射5 mg·kg－111R-HO-1蛋白，3 h后行腦缺血／再灌注損傷。腦缺血／再灌注 ＋25 mg·kg－111R-HO-1組（H2組），沙土鼠腹腔注射25 mg·kg－111R-HO-1蛋白，3 h后行腦缺血／再灌注損傷。

1.8 標(biāo)本制作 腦缺血／再灌注24 h后脫頸處死沙土鼠，在冰面上迅速分離海馬，其中1／3海馬組織作電鏡觀察和神經(jīng)元凋亡檢測，2／3液氮冷凍后－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 電鏡樣本制備及觀察 沙土鼠海馬組織塊常規(guī)制作電鏡超薄切片，電鏡下觀察海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的改變。神經(jīng)元損傷程度以線粒體變性百分率表示，具有以下任一現(xiàn)象即認(rèn)為線粒體發(fā)生變性：線粒體腫脹、線粒體膜破壞、線粒體嵴減少或斷裂、線粒體基質(zhì)出現(xiàn)空泡。計算10個神經(jīng)細(xì)胞變性線粒體的平均數(shù)代表該例標(biāo)本線粒體變性的百分率。

1.10 神經(jīng)元凋亡情況 采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）法進行檢測。其步驟如下：玻片上的海馬組織切片，加TBS 1∶200新鮮稀釋Proteinase K 37℃消化10min，加入TdT／DIG-d-UTP混合液 ，加生物素化地高辛抗體，DAB染色。計數(shù)25個相鄰視野中凋亡神經(jīng)元所占百分率。重復(fù)3次取其均值。

1．11 Caspase-3和HO-1蛋白表達(dá)的檢測 采用Western blot法，內(nèi)參照為GAPDH。取100μg蛋白樣品進行電泳，一抗（兔抗沙土鼠Caspase-3或HO-1單克隆抗體，分別按1∶250或1∶200稀釋）室溫孵育2 h，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶3 000）室溫封閉 1 h，酶法顯色。Metamorph／BX41圖像分析系統(tǒng)測各條帶平均吸光度（A）值和條帶的面積，每一條帶的蛋白含量用此條帶的吸光度值乘以條帶的面積與同一樣本的GAPDH條帶的吸光度值乘以條帶的面積的比值表示。

1．12 cAMP水平的檢測 按試劑盒說明書操作。用全自動放射免疫γ計數(shù)儀測標(biāo)記已知濃度的cAMP每 min放射脈沖數(shù)（counts／min），用 counts／min和相應(yīng)濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后檢測每組海馬組織中cAMP每min放射脈沖數(shù)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出其相應(yīng)的濃度。

1.13 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理，計量資料以ˉx±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 線粒體變性率的變化 C組、S組和R組3組海馬神經(jīng)元線粒體變性率均達(dá)70%以上，但3組間海馬神經(jīng)元線粒體變性率無差異（P＞0.05）；H1組神經(jīng)元線粒體變性率降低到47%（vs C組、S組和R組，P＜0.01）、H2組神經(jīng)元線粒體變性率降低28%（vs H1組，P＜0.01），見 Fig 1，Tab 1。

Fig 1 M itochondria damage observed by election m icroscopy（8 000×）

2.2 神經(jīng)元凋亡率的變化 C組、S組和R組3組海馬神經(jīng)元凋亡率達(dá)65%左右，3組間海馬神經(jīng)元凋亡率的變化無差異（P＞0.05）；H1組神經(jīng)元凋亡率的下降到33%（vs C組、S組和R組，P＜0.01）、H2組神經(jīng)元凋亡率下降到20%（vs H1組，P＜0.01），見 Tab 1。

Tab 1 Comparisons ofm itochondria damageand apoptosis in each groups，n＝10）

Tab 1 Comparisons ofm itochondria damageand apoptosis in each groups，n＝10）

**P＜0.01 vs C，S，R group；＃＃P＜0.01 vs H1 Group

Group Mitochondrial degeneration rate Neuronal apoptosis rate C組77±7 65±5 S組 79±6 69±6 R組 75±7 68±5 H1組 47±4** 33±3**H2組 28±2＃＃ 20±2＃＃

2．3 Caspase-3和HO-1蛋白表達(dá)的變化 C組、S組和R組3組間海馬Caspase-3和HO-1蛋白表達(dá)的變化無差異（P＞0.05）；H1組海馬Caspase-3蛋白表達(dá)下調(diào)、HO-1蛋白表達(dá)上調(diào)（vs C組、S組和R組，P＜0.01）；H2組海馬Caspase-3蛋白表達(dá)下調(diào)、HO-1蛋白表達(dá)上調(diào)（vs H1組，P＜0.01），見 Fig 2，Tab 2。

Fig 2 Expressions of Caspase-3 and HO-1protein in each group

Tab 2 Comparisons of Caspase-3，HO-1 protein and cAMP in each group（n＝10，s）

Tab 2 Comparisons of Caspase-3，HO-1 protein and cAMP in each group（n＝10，s）

**P＜0.01 vs C，S，R group；＃＃P＜0.01 vs H1 Group

Group Caspase-3 protein HO-1 protein cAMP／pmol·L－1 C 1.13±0.10 0.20±0.03 31±3 S 1.11±0.11 0.22±0.03 30±3 R 1.06±0.10 0.20±0.02 33±4 H1 0.42±0.03** 1.32±0.13** 57±5**H2 0.19±0.01＃＃ 2.75±0.23＃＃ 76±5＃＃

2．4 海馬組織cAMP水平的變化 C組、S組和R組3組海馬cAMP水平為30 pmol·L－1左右，3組間海馬cAMP的變化無差異（P＞0.05）；H1組cAMP水平達(dá)到57 pmol·L－1（vs C組、S組和 R組，P＜0.01）、H2組 cAMP的水平達(dá) 76 pmol·L－1（vs H1組，P＜0.01），見 Tab 2。

3 討論

蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域（protein transduction domain，PTD）或細(xì)胞穿膜肽（cell penetrating peptide，CPP）是一種可以與化合物或蛋白質(zhì)結(jié)合并轉(zhuǎn)導(dǎo)它們跨越細(xì)胞膜的載體。將靶蛋白用重組技術(shù)或化學(xué)偶聯(lián)等方法連接到PTD上，可以將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子、轉(zhuǎn)錄因子、酶類、反義寡核苷酸等遞送到細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)導(dǎo)肽可攜帶活性生物大分子進入難以達(dá)到的部位，發(fā)揮治療作用，如利用轉(zhuǎn)導(dǎo)肽攜帶抗凋亡肽進入腦組織對缺血性腦損傷產(chǎn)生保護作用［10］。Matsui等［11］報道多聚精氨酸肽由6～12個精氨酸殘基組成，其中由11個精氨酸殘基組成的 CPP（11R）的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力最強。Zhang等［12］研究發(fā)現(xiàn) TAT-11R轉(zhuǎn)導(dǎo)效率幾乎都為100%。

Guegan等［13］發(fā)現(xiàn)靜脈注射的TAT-XIAP能夠進入小鼠大腦皮層細(xì)胞，能夠有效地抑制Caspase的活性，明顯地降低了梗死的體積。Bcl-xL蛋白在線粒體中能夠?qū)Χ喾N細(xì)胞的凋亡過程具有抑制作用。研究［14－15］發(fā)現(xiàn)在不同的臨床前動物模型中，給藥TAT-Bcl-xL均能夠進入腦組織中，并使缺血損傷造成的梗死體積減少，Caspase-3的活性降低，神經(jīng)元喪失減少；在培養(yǎng)的神經(jīng)元中，TAT-Bcl-xL能夠在極低的濃度下（30～100 nmol·L－1）抑制細(xì)胞凋亡，遠(yuǎn)低于目前常用的小分子凋亡抑制劑作用濃度，顯示出良好的應(yīng)用前景。

細(xì)胞凋亡主要通過線粒體／細(xì)胞色素C通路、死亡受體Fas通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路，作為凋亡效應(yīng)者的Caspase-3是上述3條通路級聯(lián)激活的必經(jīng)之路，是Caspase級聯(lián)“瀑布”下游最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶，在各種因素啟動的凋亡程序中起最后樞紐作用，被稱為“死亡蛋白酶”，可直接水解與細(xì)胞解體相關(guān)的結(jié)構(gòu)和功能蛋白，促使細(xì)胞降解并生成凋亡小體［16］。

HO-1催化血紅素的代謝相關(guān)產(chǎn)物一氧化碳（CO）、膽綠素、轉(zhuǎn)鐵蛋白均有抗氧化功能，是HO-1發(fā)揮抗氧化、抗凋亡的主要效應(yīng)分子。產(chǎn)物CO可以結(jié)合鳥苷酸環(huán)化酶中血紅素基團的亞鐵離子而催化cGMP生成，從而可以發(fā)揮各種作用；膽綠素是一種抗氧化劑，其抗氧化作用甚至超過維生素C和維生素E，是抗凋亡作用的另一種重要物質(zhì)；鐵蛋白具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。HO-1主要通過其產(chǎn)物CO結(jié)合鳥苷酸環(huán)化酶中血紅素基團的亞鐵離子而催化生成cGMP發(fā)揮效應(yīng)，因此cGMP可反應(yīng)HO-1的活性。Ogawa等［7－8］報道利用 PTD-11R轉(zhuǎn)導(dǎo) HO-1蛋白，改善沙土鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型的腦血管痙攣，他們的研究開啟了HO-1蛋白治療的新篇章。

本研究發(fā)現(xiàn)，給予11R-HO-1蛋白處理后，沙土鼠腦缺血／再灌注損傷后海馬HO-1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，cGMP含量升高，Caspase-3蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，電鏡觀察海馬神經(jīng)元線粒體損傷減輕，神經(jīng)元凋亡率降低。增加11R-HO-1蛋白劑量（5倍）HO-1蛋白表達(dá)上調(diào)和Caspase-3蛋白表達(dá)下調(diào)更加明顯。本研究結(jié)果表明，給予HO-1蛋白可以減輕沙土鼠腦缺血／再灌注損傷。

目前TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域介導(dǎo)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中已顯示出巨大的優(yōu)勢，相信在不久的將來，基于TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域技術(shù)的HO-1蛋白腦保護研究會進入臨床造福人類。

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