雞鴨免疫禽流感Re-6疫苗后的抗體監(jiān)測(cè)

黃寶學(xué)，韋顯凱，梁素聯(lián)，班雪花2，黃美娜

（1.廣西田東縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西 田東 531500； 2.廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西 南寧 530001；3.廣西大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，廣西 南寧 530004）

高致病性禽流感是由正粘病毒科A 型流感病毒引起的一種禽類急性傳染病，可感染幾乎所有野生禽和家禽，嚴(yán)重影響?zhàn)B禽業(yè)的健康發(fā)展，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）定為名錄傳染病，我國(guó)政府將其列為一類傳染病[1]。疫苗免疫是預(yù)防和控制禽流感發(fā)生的最有效途徑，而免疫后抗體水平的高低是評(píng)估實(shí)際免疫效果的重要指標(biāo)[2]。目前報(bào)道較多的是對(duì)某個(gè)地區(qū)的禽流感免疫抗體的監(jiān)測(cè)[3，7]，然而對(duì)于家禽群的母源抗體情況，家禽的品種對(duì)抗體影響等很少進(jìn)行分析。為了掌握禽流感滅活疫苗在田東縣當(dāng)?shù)丶仪萜贩N的不同注射部位產(chǎn)生的免疫應(yīng)答和抗體消長(zhǎng)情況，提供可操作的免疫方法和免疫程序。特進(jìn)行本次試驗(yàn)研究，供廣大養(yǎng)殖戶和動(dòng)物防疫工作者參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)疫苗

重組禽流感滅活疫苗（H5亞型，Re-6株，批號(hào)2012053），哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn)。

1.1.2 試驗(yàn)雞、鴨群分組及免疫注射部位及免疫次數(shù)情況

選用14日齡田東本地土雞400只，分為4組，其中頸部皮下注射2組，胸部肌肉注射2組。選用14日齡田東本地土鴨400只，分為4組，其中頸部皮下注射2組，大腿部肌肉注射2組。共8個(gè)組，試驗(yàn)期84天。 其中，每種動(dòng)物的兩個(gè)注射部位分別設(shè)一免和二免各兩組（詳見(jiàn)表1）。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組情況

1.1.3 試驗(yàn)雞、鴨群免疫時(shí)間和免疫劑量情況

2013年5月1日對(duì)14日齡的雞鴨8個(gè)試驗(yàn)組進(jìn)行第一次免疫，免疫劑量按疫苗說(shuō)明書(shū)使用，雞0.3mL/只，鴨0.5mL/只。5月28日對(duì)42日齡的雞鴨8個(gè)試驗(yàn)組進(jìn)行第二次免疫，免疫劑量按疫苗說(shuō)明書(shū)使用，雞0.5mL/只，鴨1mL/只（詳見(jiàn)表1）。

1.1.4 血清樣品

對(duì)8個(gè)試驗(yàn)組雞群和鴨群一次免疫后，7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d、56d分別隨機(jī)采集血清各5份，二次免疫后，7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d、56d的 各 組分別隨機(jī)采集血清各5份，共計(jì)血清樣品320份。

1.1.5 診斷試劑

禽流感病毒H5亞型HI試驗(yàn)抗原（H5亞型）由哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn)（批號(hào)2013002），H5亞型陽(yáng)性血清（批號(hào)2013001）由哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn)，1%的非免雞紅細(xì)胞自制。

1.2 方法

1.2.1 免疫方法

雞1-4組在14日齡免疫注射疫苗0.3mL，雞2組和4組42日齡免疫注射疫苗0.5mL。鴨5-8組在14日齡免疫注射疫苗0.5mL，鴨6組和8組42日齡免疫注射疫苗1mL。

1.2.2 采血部位

21日齡以下的雞鴨在心臟采血，28日齡以上的雞鴨在頸靜脈采血。

1.2.3 檢測(cè)方法

按照 GB/T18936—2003 頒布的高致病性禽流感診斷技術(shù)方法，用 96 孔微量反應(yīng)板進(jìn)行微量血凝抑制（Heamoglutination Inhibition，HI）試驗(yàn)，試驗(yàn)用抗原稀釋倍數(shù)為4HAU，以完全抑制 4HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為 HI 滴度。并按常規(guī)方法設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.4 結(jié)果判定

只有陰性對(duì)照孔血清滴度不大于22 ，陽(yáng)性對(duì)照孔血清誤差不超過(guò)1個(gè)滴度，試驗(yàn)結(jié)果才有效。HI價(jià)小于或等于22判定HI試驗(yàn)陰性；HI價(jià)等于23為可疑，需重復(fù)試驗(yàn)；HI價(jià)大于或等于24 為陽(yáng)性，判為免疫合格。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析方法：采用SPSS statistics 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類動(dòng)物抗體產(chǎn)生結(jié)果

雞和鴨同時(shí)進(jìn)行禽流感疫苗免疫后，雞群H5抗體陽(yáng)性率為74.38%，鴨為86.88%，鴨的合格率高于雞，差異極其顯著（P<0.01）（詳見(jiàn)表2）。

表2 不同種類動(dòng)物抗體產(chǎn)生結(jié)果

2.2 不同免疫部位對(duì)家禽H5抗體效價(jià)的影響

在雞鴨的頸部皮下和肌肉進(jìn)行禽流感疫苗免疫注射后，頸部皮下注射和肌肉注射的抗體合格率分別為79.38%和81.88%，差異不顯著（P>0.05），兩組注射部位對(duì)家禽H5抗體效價(jià)產(chǎn)生沒(méi)有大的影響（表3）。

表3 不同免疫部位對(duì)抗體產(chǎn)生的影響

2.3 不同免疫部位和次數(shù)的抗體效價(jià)分布情況

通過(guò)表2和表3可知，雞鴨二免后抗體合格率為97.5%，而一免的只有63.75%，差異極其顯著（P<0.01）。通過(guò)比較不同免疫部位和次數(shù)的抗體效價(jià)分布情況，發(fā)現(xiàn)二免后的雞鴨禽流感抗體平均滴度為8.8075，比一免的4.6725高4.125個(gè)滴度，詳見(jiàn)表4。

表4 熒光定量RT—PCR和普通RT－PCR的敏感性試驗(yàn)

通過(guò)繪制雞、鴨一免和二免后的抗體消長(zhǎng)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)鴨一免后21天抗體可以達(dá)到合格水平，一直持續(xù)到56天抗體均合格。而雞在一免后28天抗體方能合格，并且持續(xù)到一免后56天均合格。而不管是雞和鴨在二免后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)采血，抗體均維持高水平，詳見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 雞一免和二免抗體產(chǎn)生消長(zhǎng)圖

3 討論與結(jié)論

當(dāng)前，為使我國(guó)高致病性禽流感疫情的發(fā)生得以有效控制，有關(guān)部門啟動(dòng)了一系列綜合生物安全體系，其中疫苗免疫是防止禽流感暴發(fā)的主要措施。因此，我們進(jìn)行了禽流感滅活疫苗對(duì)雞鴨的抗體產(chǎn)生規(guī)律的探索，為制定禽流感免疫程序和防治禽流感提供科學(xué)依據(jù)[4]。鴨類等水禽的免疫系統(tǒng)與雞有很大的區(qū)別，不能簡(jiǎn)單地將雞的免疫應(yīng)答規(guī)律類推到鴨等水禽上，因?yàn)樗麄儗?duì)相同的抗原產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可能有很大的區(qū)別[5]，所以本次實(shí)驗(yàn)對(duì)本地土鴨和雞的抗體產(chǎn)生規(guī)律進(jìn)行了對(duì)比。

據(jù)相關(guān)資料報(bào)道[6]，鴨和鵝免疫抗體和雞相比相對(duì)較低。但本研究發(fā)現(xiàn)，本地土鴨的高致病性禽流感H5抗體產(chǎn)生效果優(yōu)于雞，這是否和雞鴨的品種、飼養(yǎng)條件和飼養(yǎng)環(huán)境對(duì)禽流感抗體的產(chǎn)生有直接的關(guān)聯(lián)，或者用雞的紅細(xì)胞作為鴨禽流感抗體滴度測(cè)定是否有影響[7]，水禽血清中可能存在某種非特異性凝集因子，對(duì)雞紅細(xì)胞有非特異性凝集作用，這都有待進(jìn)一步研究。

圖2 鴨一免和二免抗體產(chǎn)生消長(zhǎng)圖

家禽的不同免疫部位對(duì)免疫操作的可操作性及工作效率有一定的影響，但對(duì)禽流感抗體產(chǎn)生是否有影響的報(bào)道較少，本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雞鴨的頸部皮下注射和胸部肌肉注射的抗體產(chǎn)生差異不顯著，用兩種方法均可進(jìn)行。實(shí)踐中，頸部皮下注射比較容易操作，42日齡以下的雞鴨一個(gè)人可以完成免疫注射工作，注射時(shí)用左手拇指和食指把頸部后1/3處皮膚捏起使皮膚和肌肉分離，右手持注射器針頭朝背部方向，以小于30°的角度刺入捏起的皮下，即可完成。胸部肌肉注射時(shí)，須兩人操作來(lái)完成，一人保定，一人注射。并且禽流感疫苗是油劑苗，肌肉注射會(huì)引起注射部位腫脹、吸收不快，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致家禽逐漸消瘦、死亡等免疫副反應(yīng)發(fā)生。進(jìn)針過(guò)深，還刺破肝臟導(dǎo)致禽只死亡。

不同的免疫次數(shù)對(duì)抗體產(chǎn)生效果有較大的差別。本研究發(fā)現(xiàn)，家禽進(jìn)行一次免疫后，21天起平均抗體滴度能達(dá)到4log2以上，但抗體合格率基本在40-60%，而二次免疫后，能達(dá)到95%左右。在對(duì)家禽進(jìn)行首次免疫后由于免疫系統(tǒng)是初次應(yīng)答，加上母源抗體的干擾，因而抗體效價(jià)普遍低；而商品肉雞鴨、蛋雞、種鴨由于在首次免疫后，機(jī)體對(duì)此種疫苗已具有免疫記憶，當(dāng)再次用此種疫苗進(jìn)行加強(qiáng)免疫時(shí)，機(jī)體可迅速產(chǎn)生比上次免疫更多的抗體，故抗體的效價(jià)普遍較高[8]。但在生產(chǎn)中：一方面，很多養(yǎng)殖戶防疫意識(shí)不強(qiáng)，認(rèn)為由于飼養(yǎng)周期短，免疫過(guò)一次就可以達(dá)到預(yù)防目的，對(duì)防疫人員進(jìn)村入戶開(kāi)展二免不配合不支持，產(chǎn)生抵觸情緒；另一方面，在給家禽注射疫苗時(shí)，由于一只一只抓捉和注射疫苗時(shí)疼痛與疫苗的副作用，家禽應(yīng)激反應(yīng)很大，可導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降和飼養(yǎng)成本的增加。家禽只進(jìn)行一次免疫，必然造成抗體滴度較低的現(xiàn)象，難以保護(hù)家禽群體，潛在受野毒攻擊暴發(fā)疫情的威脅。應(yīng)加大對(duì)養(yǎng)殖戶和防疫員的培訓(xùn)力度，強(qiáng)化防疫意識(shí)，確保免疫質(zhì)量。

結(jié)合本試驗(yàn)研究結(jié)果，推薦田東縣本地雞鴨在14日齡首次免疫重組禽流感滅活疫苗（H5N1亞型，Re-6株），頸部皮下注射雞0.3mL，鴨0.5 mL；42日齡二次免疫重組禽流感滅活疫苗（H5N1亞型，Re-6株），頸部皮下注射雞0.5mL，鴨1 mL，使雞、鴨群在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持較高的抗體水平。本研究采用的兩次免疫的時(shí)間間隔為1個(gè)月，對(duì)于不同的免疫間隔時(shí)間對(duì)抗體產(chǎn)生的研究在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步研究。

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