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    高致病性豬藍(lán)耳病免疫金標(biāo)試紙條的研制與應(yīng)用

    2014-05-18 06:10:50張秀云
    中國(guó)動(dòng)物檢疫 2014年4期
    關(guān)鍵詞:金標(biāo)膠體金耳病

    吳 斌,張秀云,屈 菲,鄭 勇,蘇 旺

    (遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局,遼寧 大連 116001)

    高致病性豬藍(lán)耳?。℉P PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征(俗稱豬藍(lán)耳病,PRRS)病毒變異株引起豬的一種急性、高熱性、高致死性傳染病。仔豬發(fā)病率可達(dá)100%、死亡率可達(dá)50%以上,母豬流產(chǎn)率可達(dá)30 %以上,育肥豬也可發(fā)病死亡。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將高致病性豬藍(lán)耳病列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病,我國(guó)列為二類動(dòng)物疫病,加以重點(diǎn)防控[1-3]。尤其近年來(lái)高致病性豬藍(lán)耳病的出現(xiàn)已經(jīng)成為規(guī)?;i場(chǎng)的主要疫病之一,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。膠體金免疫層析試紙條技術(shù)是一種無(wú)需專業(yè)技術(shù)人員對(duì)微量樣品即可檢測(cè)的快速、簡(jiǎn)便、費(fèi)用低廉、結(jié)果容易判定的檢測(cè)方法[4]。本研究制備的高致病性豬藍(lán)耳病抗原免疫金標(biāo)試紙條具備敏感、特異的優(yōu)勢(shì),同時(shí)大大縮短檢測(cè)時(shí)間,僅十幾分鐘就可完成。這種快速便捷的檢測(cè)高致病性豬藍(lán)耳病的新型檢測(cè)技術(shù)具備廣闊的應(yīng)用前景,尤其適用于基層獸醫(yī)部門及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室的快速檢測(cè)。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞、毒株、臨床樣品和抗體

    Marc-145細(xì)胞及高致病性豬藍(lán)耳病病毒SD-4/2006分離株(HP-PRRSV/SD-4/2006)、PRRSV標(biāo)準(zhǔn)毒株、豬瘟病毒(CSFV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒(PCV)均由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定及保存;遼寧、上海、江蘇、山東等地7個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的60份豬肺臟、脾臟及淋巴結(jié)樣品;純化的抗HPPRRSV單克隆抗體及高致病性豬藍(lán)耳病多抗血清由本研究課題制備提供。

    1.2 試劑與材料

    DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司;胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司;檸檬酸鈉(C6H5Na3O7·2H2O)、氯金酸(AuCl3·HCl·4H2O)、羊抗鼠 IgG二抗、牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;NaCl、KCl、KH2PO4、Na2HPO4均為國(guó)產(chǎn)分析純;Tween20為化學(xué)純;硝酸纖維素膜(NC膜)購(gòu)自美國(guó)Whatman公司;玻璃纖維、吸水紙購(gòu)自美國(guó)基因公司。

    1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

    Biodot XYZ 3050三維噴點(diǎn)平臺(tái)、Biodot CM4000試紙條切刀機(jī),購(gòu)自美國(guó)Biodot公司;高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);微波催化合成/萃取儀XH2100A購(gòu)自北京祥鵠科技發(fā)展有限公司。

    1.4 膠體金標(biāo)記抗體的制備

    40 nm膠體金顆粒的制備:將98 mL去離子水放入干凈的錐形瓶中,用封口膜封住瓶口,放入微波合成儀中加熱攪拌,溫度上升到65 ℃,穩(wěn)定2~3 min,快速加入1 %的氯金酸1 mL,設(shè)置參數(shù)到95 ℃,當(dāng)溫度上升到95 ℃,穩(wěn)定2~3 min,快速加入1 mL 1%的檸檬酸三鈉,反應(yīng)約2~3 min,顏色發(fā)生變化直至呈酒紅色,穩(wěn)定3 min后取出,繼續(xù)攪拌至室溫。

    金標(biāo)抗體最適pH值的測(cè)定:取1.5 mL離心管,分別加入1 mL膠體金溶液,用0.1 mol/L K2CO3調(diào)pH值至7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。取酶標(biāo)板8孔,分別加入200 μL不同pH值的膠體金鋪底,每孔再分別加10 μL單抗,震蕩反應(yīng)30 min后,每孔加20 μL 10% NaCl溶液,震蕩反應(yīng)15min。用酶標(biāo)儀檢測(cè),在520 nm波長(zhǎng)條件下,選擇OD值最高的那一點(diǎn)處的pH值為最適的pH值。

    金標(biāo)抗體的最佳濃度確定:將純化的高致病性豬藍(lán)耳病病毒多抗稀釋至0.2 mg/mL,取酶標(biāo)板11孔,按表1順序依次加入:每孔200 μL膠體金鋪底,取不同體積多抗加入,去離子水補(bǔ)足體積。震蕩反應(yīng)30min后,每孔加入20 μL 10% NaCl溶液,震蕩反應(yīng)15 min。膠體金與抗體達(dá)到或超過(guò)最低穩(wěn)定量的各孔仍保持紅色不變,同時(shí)用酶標(biāo)儀檢測(cè),在520 nm波長(zhǎng)條件下,選擇OD值穩(wěn)定的含抗體量最低孔即為200 μL膠體金所需抗體的量。

    表1 膠體金標(biāo)記抗體最低穩(wěn)定量的測(cè)定

    金標(biāo)抗體的制備:用0.1 moL/L K2CO3調(diào)節(jié)1 mL膠體金溶液pH值至最適值。攪拌條件下,將最適抗體量緩慢加入膠體金溶液中,室溫反應(yīng)30 min,加入 600 μL 10 % BSA 封閉 30 min,12000 r/min離心30 min,棄上清,沉淀物用1 mL TBS(Tris-HCl 0.01 moL/L、0.02 % NaN3、1 %蔗糖、1 %BSA)混懸30 min,12000 r/min,4 ℃離心,棄上清,0.1 mL TBS重懸,4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.5 免疫層析試紙條的組裝

    樣品墊、結(jié)合墊(含金標(biāo)高致病性豬藍(lán)耳病病毒多抗,干燥)、硝酸纖維素膜(檢測(cè)線:HPPRRSV單克隆抗體1 mg/mL;質(zhì)控線:羊抗鼠IgG二抗1 mg/mL),吸水墊依次貼在帶有粘合劑的PVC背板上,切成4 mm寬的試紙條,室溫干燥備用。

    1.6 金標(biāo)試紙條效果驗(yàn)證及結(jié)果判定

    陰陽(yáng)性檢測(cè)試驗(yàn):分別將200μL接種Marc-145細(xì)胞的HP-PRRSV/SD-4/2006液和無(wú)HPPRRSV/SD-4/2006的細(xì)胞培養(yǎng)液滴加到試紙條的樣品墊上,查看結(jié)果是否與預(yù)期結(jié)果一致。

    敏感性試驗(yàn):按Reed-Muench法計(jì)算病毒TCID50。用試紙條對(duì)病毒增殖液進(jìn)行檢測(cè),以能夠出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的最低TCID50病毒含量確定該試紙條的靈敏度。同時(shí)以純化的滅活高致病性豬藍(lán)耳病病毒(HP-PRRSV/SD-4/2006)為檢測(cè)對(duì)象,先用稀釋液10倍稀釋,然后做系列倍比稀釋,分別將倍比稀釋的病毒液滴加到試紙條樣品墊上,確定出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的最低病毒含量。

    特異性試驗(yàn):3份不同稀釋度的高致病性豬藍(lán)耳病病毒(HP-PRRSV/SD- 4/2006)細(xì)胞培養(yǎng)液樣品,樣品標(biāo)記為1、2、3;3份不同稀釋度的PRRSV (ATCC VR2332)細(xì)胞培養(yǎng)液樣品,樣品標(biāo)記為4、5、6;2份豬細(xì)小病毒細(xì)胞培養(yǎng)液樣品,樣品標(biāo)記為7、8;2份豬偽狂犬病毒細(xì)胞培養(yǎng)液樣品標(biāo)記為9、10;2份豬流行性乙型腦炎病毒細(xì)胞培養(yǎng)液樣品,樣品標(biāo)記為11、12。用組裝的試紙條檢測(cè)以上樣品,驗(yàn)證其特異性。

    重復(fù)性試驗(yàn):將不同批次的試紙條分別檢測(cè)5份陽(yáng)性細(xì)胞培養(yǎng)液和5份陰性細(xì)胞培養(yǎng)液,每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次。

    穩(wěn)定性試驗(yàn):將高致病性豬藍(lán)耳病抗原金標(biāo)試紙條分別放在不同條件下貯存:37 ℃1周、4 ℃半年,每隔1月取出對(duì)相同的陽(yáng)性與陰性參考樣本進(jìn)行測(cè)試。

    臨床樣品的檢測(cè):將遼寧、上海、江蘇、山東7個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的60份豬肺臟、脾臟及淋巴結(jié)樣品病料中加入5倍體積的PBS研磨,反復(fù)凍融三次,8000 r/min離心15 min,取上清,樣品分為兩份,一份按照農(nóng)業(yè)部推薦的高致病性藍(lán)耳病試劑盒的診斷方法(RT—PCR方法)進(jìn)行檢測(cè),一份應(yīng)用本研究制備的高致病性豬藍(lán)耳病抗原金標(biāo)試紙條方法檢測(cè),每份樣品設(shè)置重復(fù)[4]。

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.1 膠體金的表面特征

    制備的膠體金溶液呈酒紅色,透光性好。電鏡下觀察顆粒大小一致,分布均勻,平均直徑約為40 nm(圖1)。

    2.2 最適pH值和最適抗體標(biāo)記量的優(yōu)選

    圖1 膠體金電鏡結(jié)果

    從圖2和圖3可以看出,當(dāng)pH值在8.5左右,純化的高致病性豬藍(lán)耳病病毒多抗?jié)舛葹? μg/mL時(shí),金標(biāo)抗體的OD520值最高,說(shuō)明在此條件下,膠體金標(biāo)記抗體的效率最高。因此我們選擇pH 8.0~8.5和多抗?jié)舛?μg/mL作為最佳實(shí)驗(yàn)條件。

    圖2 最適pH值的確定

    圖3 金標(biāo)抗體最佳濃度的測(cè)定

    2.3 陰、陽(yáng)性試驗(yàn)

    HP-PRRSV/SD-4/2006細(xì)胞培養(yǎng)陽(yáng)性液(1、2)的試紙條在檢測(cè)線處和質(zhì)控線處各出現(xiàn)一條紅色條帶,而滴加無(wú)HP-PRRSV/SD-4/2006的細(xì)胞培養(yǎng)液(3、4)的試紙條只在質(zhì)控線處出現(xiàn)紅色條帶(圖4)。試驗(yàn)證明:所研制的試劑條能準(zhǔn)確地檢測(cè)樣品中是否含有高致病性豬藍(lán)耳病。

    圖4 陰陽(yáng)性樣品檢測(cè)結(jié)果

    2.4 敏感性試驗(yàn)

    病毒接種后Marc-145細(xì)胞后培養(yǎng)3 d,待出現(xiàn)病變,按Reed-Muench法計(jì)算病毒TCID50。測(cè)定HP-PRRSV/SD-4/2006病毒的TCID50為10-8/mL。經(jīng)試紙條檢測(cè),出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的最低病毒含量為100 TCID50,以該值確定為高致病性豬藍(lán)耳病免疫金標(biāo)抗原試紙條的靈敏度檢測(cè)限。同時(shí)應(yīng)用該試紙條可檢測(cè)到1:1280稀釋倍數(shù)的病毒稀釋液,病毒含量為0.214mg/L(表2)。

    表2 金標(biāo)試紙條敏感性試驗(yàn)

    2.5 特異性試驗(yàn)

    使用制備的金標(biāo)試紙條檢測(cè)12個(gè)待測(cè)樣品,除與HP-PRRSV/SD-4/2006有較強(qiáng)的特異性反應(yīng)外,與PRRSV(ATCC VR2332)也有部分的較弱反應(yīng),而與其他病毒樣品均不反應(yīng)(表3)。

    表3 金標(biāo)試紙條特異性試驗(yàn)

    2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

    將不同批次的試紙條分別檢測(cè)5份陽(yáng)性樣品和5份陰性樣品,每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次。結(jié)果顯示不同批次的試紙條檢測(cè)結(jié)果都一致,表明試紙條具有較好的重復(fù)性。

    2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

    用不同貯存條件下取出的試紙條,對(duì)相同的陽(yáng)性與陰性參考樣本進(jìn)行檢測(cè),測(cè)試時(shí)PRRSV陽(yáng)性與陰性結(jié)果均成立,同時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明不同貯存條件下的試紙條,顯色程度與顯色時(shí)間無(wú)明顯差異,說(shuō)明其穩(wěn)定性較好。實(shí)驗(yàn)證實(shí)制備的試紙條可在4 ℃條件下至少保存半年。

    2.8 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

    對(duì)送檢的來(lái)自遼寧、上海、江蘇、山東7個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的60份豬肺臟、脾臟及淋巴結(jié)樣品,分別應(yīng)用試紙條和農(nóng)業(yè)部推薦的高致病性藍(lán)耳病診斷試劑盒的方法(RT—PCR方法)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,應(yīng)用該高致病性豬藍(lán)耳病抗原免疫金標(biāo)試紙條檢測(cè)出10份陽(yáng)性樣品,利用高致病性藍(lán)耳病RT—PCR診斷試劑盒檢測(cè)出11份陽(yáng)性樣品(圖5),兩種方法檢測(cè)結(jié)果的符合率達(dá)91 %(10/11)。

    圖5 臨床樣品的RT—PCR檢測(cè)結(jié)果

    3 討論

    目前,高致病性豬藍(lán)耳病主要檢測(cè)方法為RT—PCR檢測(cè)法和ELISA檢測(cè)法,這兩種檢測(cè)方法都需要專業(yè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備和相應(yīng)的人員。而免疫金標(biāo)試紙條檢測(cè)法檢測(cè)簡(jiǎn)便快捷,無(wú)設(shè)備和人員要求,具有更加廣泛的應(yīng)用性。

    膠體金溶液可與多種生物大分子結(jié)合成穩(wěn)定的復(fù)合物,已應(yīng)用于血清學(xué)試驗(yàn)、細(xì)胞生物學(xué)及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。膠體金制備方法很多,但采用檸檬酸鈉還原法制備單一粒度的膠體金顆粒效果較好。在制備膠體金過(guò)程中,影響因素很多,如使用的容器必須清潔,否則將導(dǎo)致金溶膠混濁或顆粒大小不勻;在試驗(yàn)中,對(duì)玻璃容器采用5’-二氯二甲硅烷的氯仿溶液硅化處理;還原劑檸檬酸鈉必須一次性快速加入,攪拌均勻,一次制備的量不宜過(guò)多;試劑溶液均需用四蒸水配制,并用微孔濾膜過(guò)濾。制備的膠體金存放于4℃?zhèn)溆茫霸鐦?biāo)記,避免放置過(guò)程中出現(xiàn)自凝或細(xì)菌生長(zhǎng)[4-5]。金溶膠與被標(biāo)蛋白質(zhì)的用量比例是影響標(biāo)記成功與否的一個(gè)重要因素。因此,在每次標(biāo)記時(shí),都要測(cè)定二者具體的穩(wěn)定點(diǎn),以獲得最佳標(biāo)記率。

    為了建立敏感可靠的高致病性藍(lán)耳病膠體金免疫層析檢測(cè)方法,本實(shí)驗(yàn)選用抗高致病性藍(lán)耳病病毒的多抗,減少了非特異性反應(yīng),提高了反應(yīng)的特異性,且多抗的制備簡(jiǎn)單而經(jīng)濟(jì),抗體濃度高且反應(yīng)靈敏。本實(shí)驗(yàn)制備的高致病性豬藍(lán)耳病試紙條,與豬藍(lán)耳病經(jīng)典毒株P(guān)RRSV(ATCC VR2332)有部分較弱的反應(yīng),說(shuō)明該試紙條在檢測(cè)區(qū)分高致病性豬藍(lán)耳病病毒和經(jīng)典型豬藍(lán)耳病病毒方面的精準(zhǔn)性上,還需進(jìn)一步的改進(jìn)和完善。分析原因可能是高致病性豬藍(lán)耳病是PRRSV (ATCC VR2332)NSP2基因存在30個(gè)氨基酸不連續(xù)缺失的變異株,同源性很高[6,7],易出現(xiàn)交叉反應(yīng)。如針對(duì)變異基因設(shè)計(jì)制備金標(biāo)單克隆抗體,會(huì)提高其特異性,但成本相應(yīng)變高。試驗(yàn)結(jié)果表明,免疫金標(biāo)試紙條是一種實(shí)驗(yàn)原料來(lái)源容易,可作為監(jiān)測(cè)和診斷高致病性藍(lán)耳病的常規(guī)手段,易于推廣使用。但由于技術(shù)限制造成它的檢測(cè)靈敏度低,尚不能實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè),故這類免疫金標(biāo)試紙條主要用以檢測(cè)正常體液中是否存在的生物活性物質(zhì)(如傳染病的抗原及抗體),因此該方法目前常作為初期篩查,用于疾病的輔助診斷。

    [1]劉業(yè)兵,鄭杰,寧宜寶.高致病性PRRSV(HuN株)NSP2基因的擴(kuò)增與分析[J].中國(guó)獸藥雜志,2007,41(10):10-12.

    [2]楊漢春.我國(guó)豬繁殖與呼吸綜合征的流行現(xiàn)狀與控制對(duì)策動(dòng)態(tài)[J].當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè),2004(5):112-115.

    [3]孫慶申,仇華吉,童光志等.豬繁殖與呼吸綜合征單克隆抗體研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2005,22(4):25-28.

    [4]任先平.膠體金標(biāo)記抗體技術(shù)[J].免疫學(xué)雜志,1989,5(1):62.

    [5]崔尚金,姜建宏,周艷君.豬繁殖與呼吸綜合征膠體金抗體檢測(cè)技術(shù)的建立和初步應(yīng)用[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2005,27(3):213-216.

    [6]Allende R,Lewis T L,Lu Z,et a1.North American and European porcine reproductive respiratory syndrome viruses different non-structural protein coding regions[J].Gen Virol,1999,80(2):307-315.

    [7]童光志,周艷君,郝曉芳.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及其分子流行病學(xué)分析[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2007,29(5):323-326.

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