國產(chǎn)替米沙坦分散片與進(jìn)口替米沙坦片在健康志愿者中的生物等效性研究

肖亞寶楊海淼宋冬梅

（1 浙江泰利森藥業(yè)有限公司，浙江 嘉興314300；2 長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長春130103；3 沈陽億靈醫(yī)藥科技有限公司，遼寧 沈陽110179）

國產(chǎn)替米沙坦分散片與進(jìn)口替米沙坦片在健康志愿者中的生物等效性研究

肖亞寶1楊海淼2宋冬梅3

（1 浙江泰利森藥業(yè)有限公司，浙江 嘉興314300；2 長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長春130103；3 沈陽億靈醫(yī)藥科技有限公司，遼寧 沈陽110179）

目的在24名男性健康受試者中比較國產(chǎn)替米沙坦分散片與原研進(jìn)口替米沙坦片的生物等效性。方法篩選24名健康男性志愿者，采用隨機交叉試驗設(shè)計，應(yīng)用高效液相色譜-熒光檢測法測定血漿中替米沙坦的濃度，根據(jù)測定結(jié)果計算主要藥動學(xué)參數(shù)，并以進(jìn)口替米沙坦片為參比制劑，評估替米沙坦分散片的生物等效性。結(jié)果經(jīng)DAS2.1.1數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件計算藥動學(xué)參數(shù)，受試制劑A的t1/2：（27.94±9.94）h、Cmax：（757.9±238.3）ng/mL、Tmax：（1.18±0.49）h、AUC0-t：（4423±2645）ng/（h·mL）、AUC0-∞：（4804±3146）ng/（h·mL）；受試制劑B的t1/2：（25.58±8.56）h、Cmax：（763.4±283.3）ng/mL、Tmax：（1.22±0.52）h、AUC0-t：（4195 ±1988）ng/（h·mL）、AUC0-∞：（4437±2122）ng/（h·mL）；參比制劑的t1/2：（28.98±11.66）h、Cmax：（755.6±268.2）ng/mL、Tmax：（1.15±0.51）h、AUC0-t：（4327±2039）ng/（h·mL）、AUC0-∞：（4622±2201）ng/（h·mL）。以AUC0-t計算，與參比制劑相比受試制劑A、受試制劑B中替米沙坦的相對生物利用度分別為（99.2±26.8）%、（98.3±26.4）%。結(jié)論國產(chǎn)替米沙坦分散片與原研進(jìn)口替米沙坦片具有生物等效性。

替米沙坦；生物等效性；高效液相色譜法

替米沙坦為德國Boehringer Ingelheim制藥公司研制開發(fā)的特異性的非肽類血管緊張素Ⅱ受體（AT1亞型）拮抗劑。臨床上主要用于治療原發(fā)性高血壓。本品與AT1亞型有高親和力，通過選擇性抑制血管緊張素Ⅱ與AT1受體結(jié)合，并降低血醛固酮水平，從而產(chǎn)生降壓作用。目前已在國內(nèi)外上市使用。本試驗采用乙醚-二氯甲烷為提取溶劑，通過酸化處理方法進(jìn)行血漿樣品的提取，建立高效液相色譜-熒光檢測法測定血漿中替米沙坦藥物濃度，并以進(jìn)口替米沙坦片（商品名：美卡素）作參比制劑，比較國產(chǎn)替米沙坦分散片與進(jìn)口替米沙坦片的生物等效性。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

受試制劑A：替米沙坦分散片，40毫克/片，批號：081101；受試制劑B：替米沙坦分散片，80毫克/片，批號：081102；受試制劑A、B均由浙江泰利森藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；參比制劑：替米沙坦片，80毫克/片，批號：804188，Boehringer Ingelheim International GmbH生產(chǎn)、上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司分裝；替米沙坦對照品（批號：080901；浙江省食品藥品檢驗所標(biāo)定），內(nèi)標(biāo)（坎地沙坦，批號：20090601；威海迪素制藥有限公司），甲醇、乙腈均為色譜純（山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司），水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

LC-10ATvp型高效液相色譜儀，Agilent熒光檢測器，Agilent ChemStation for LC工作站。FA1004電子天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司），XW-80A微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司），TGL-16G臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠），MTN-2800W氮吹濃縮裝置（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 受試者

獲醫(yī)學(xué)倫理委員會審批同意，24名健康男性志愿受試者，年齡18～40歲，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）在19～24，無心、肝、肺、腎、消化道、神經(jīng)系統(tǒng)、精神異常及代謝異常等疾病，經(jīng)體格檢查血壓、心電圖、呼吸狀況及肝、腎功能、血象均無異常，試驗前2周內(nèi)未服過任何藥物，自愿參加試驗并于試驗前簽署知情同意書。

1.3.2 標(biāo)本采集

圖1 空白血漿

圖2 替米沙坦＋內(nèi)標(biāo)

受試者于試驗前1 d吃清淡晚餐后過夜（禁食10 h后），于次日早7時在室溫條件下空腹將2片(40毫克/片)受試制劑A或1片（80毫克/片）受試制劑B或1片（80毫克/片）參比制劑（藥物總劑量80毫克）用250 mL溫開水送服。14 d后交叉服藥。分別于給藥前及給藥后0.167、0.333、0.667、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、48、72、96 h由靜脈采血5 mL。3500 rpm離心10 min，分離血漿，分離出的血漿樣本于-70 ℃保存至分析（注意以上過程需避光操作）。

1.4 血藥濃度測定

1.4.1 色譜條件

色譜柱（Diamonsil C18柱，200 mm×4.6 mm，5 μm），預(yù)柱（琛航C18保護(hù)柱），流動相為0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液（pH 3.13± 0.02）-乙腈（57∶43），熒光激發(fā)波長（Excitation）300 nm，熒光發(fā)射波長（Emission），385 nm；流速：1.2 mL/min；進(jìn)樣量：50 μL；柱溫：30 ℃。

1.4.2 樣品處理

將解凍后血漿樣品渦旋30 s，精密量取血漿500 μL，置于5 mL離心管中，依次加入甲醇-水（1∶1）50 μL，坎地沙坦內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，10%的磷酸溶液100 μL，再加入乙醚-二氯甲烷（3∶2）3 mL，渦旋混勻30 s，振蕩10 min，離心5 min（15000 rpm），移取有機相于另一5 mL離心管中，40 ℃水浴空氣流下吹干。殘留物用200 μL流動相復(fù)溶，渦旋混勻30 s，轉(zhuǎn)移溶液于另一1.5 mL離心管中，離心5 min（15000 rpm），取上清液50 μL進(jìn)樣分析（以上均避光操作）。

1.5 方法學(xué)考察

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

于空白血漿中加入不同量的替米沙坦標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成血漿中替米沙坦?jié)舛葹?.1、4.1、10.2、51.2、204.8、819.2、1228.8 ng/mL的樣品，按“血漿樣品處理方法”項下自加入“坎地沙坦內(nèi)標(biāo)溶液50 μL”起同法試驗，每一濃度進(jìn)行雙樣本分析，制備替米沙坦的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以待測物濃度為橫坐標(biāo)X，待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值（AS/Ai）為縱坐標(biāo)Y，用加權(quán)最小二乘法[2]（權(quán)重系數(shù)：1/χ2）進(jìn)行線性回歸運算，求得的線性回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.5.2 準(zhǔn)確度與精密度試驗

在空白血漿中分別加入不同量的替米沙坦標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成血漿中替米沙坦?jié)舛葹?.1、81.9和1024.0 ng/mL的血漿樣品（每濃度六樣本分析），按“血漿樣品處理方法”項下自加入“坎地沙坦內(nèi)標(biāo)溶液50 μL”起同法試驗，連續(xù)測定三批（與標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定同時進(jìn)行），計算血漿樣品的濃度，求得方法的精密度與準(zhǔn)確度。

1.5.3 穩(wěn)定性考察

配制低、高（5.1、1024.0 ng/mL）2個濃度的血漿樣品（每濃度三樣本分析），考察血漿樣品冷凍-解凍3個周期后的穩(wěn)定性、長期冷凍條件下血漿樣品的穩(wěn)定性。

1.6 回收率

配制低、中、高（5.1、81.9和1024.0 ng/mL）3個濃度的替米沙坦血漿樣品（每濃度六樣本分析），按“血漿樣品處理方法”項下自加入“坎地沙坦內(nèi)標(biāo)溶液50 μL”起同法試驗，獲得相應(yīng)色譜峰面積；另取對應(yīng)濃度的替米沙坦標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，加入坎地沙坦內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，流動相100 μL（每濃度六樣本分析），渦旋混合30 s，取50 μL進(jìn)樣分析，獲得相應(yīng)色譜峰面積（6次測定的平均值）。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計算提取回收率。

圖3 受試制劑A血漿樣品色譜圖

圖4 受試制劑B血漿樣品色譜圖

1.7 質(zhì)量控制

為減少系統(tǒng)誤差，每批樣品分析時，建立隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血藥濃度，隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線用加權(quán)最小二乘法[2]（W=1/χ2）進(jìn)行線性回歸運算，同時平行測定低、中、高三個濃度（替米沙坦第一分析批：5.1、81.9、1024.0 ng/mL；第二～四分析批：5.1、80.7、1009.0 ng/mL；第五～七分析批：5.0、79.2、990.0 ng/mL）的質(zhì)控樣品，質(zhì)控樣品測定結(jié)果的RE應(yīng)在±15%之內(nèi)，最多允許33%不在同一濃度的質(zhì)控樣品結(jié)果超限，當(dāng)批數(shù)據(jù)方可接受。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用DAS 2.1.1數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件將相關(guān)藥動學(xué)參數(shù)（Cmax、AUC0-t、AUC0-∞）進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換以評價受試者分別服用參比制劑和受試制劑后的藥動學(xué)參數(shù)及相對生物利用度。Tmax宜采用非參數(shù)檢驗法的秩和檢驗判定兩制劑是否具有顯著性差異。生物等效性評價是通過計算受試制劑和參比制劑Cmax、AUC0-t和AUC0-∞的對數(shù)比值的（取對數(shù)后）90%置信區(qū)間進(jìn)行的。AUC的對數(shù)比值的90%置信區(qū)間在80%～125%，Cmax對數(shù)比值的90%置信區(qū)間在75%～ 133%，則可判定受試制劑A和受試制劑B分別與參比制劑具有生物等效性。

2 結(jié) 果

2.1 方法特異性及色譜行為

圖1～圖4分別為空白血漿、空白血漿加替米沙坦標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液、受試制劑A血漿樣品、受試制劑B血漿樣品色譜圖。

上述色譜圖結(jié)果表明，坎地沙坦保留時間為6.8 min左右，替米沙坦的保留時間為10.7 min左右，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾替米沙坦和內(nèi)標(biāo)物坎地沙坦的測定。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低定量限

以血漿中替米沙坦?jié)舛葘μ婷咨程古c坎地沙坦的峰面積比值（AS/ Ai）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，替米沙坦在2.1～1228.8 ng/mL范圍內(nèi)與待測物和內(nèi)標(biāo)物峰面積之比線性關(guān)系良好，回歸方程及相關(guān)系數(shù)分別為：Y=0.00202+0.02496×X，R=0.9999（n=7），本試驗建立的高效液相色譜法測定血漿中替米沙坦?jié)舛鹊亩肯孪逓?.1 ng/mL。

2.3 方法精密度與準(zhǔn)確度

本試驗所建立的高效液相色譜法測定的準(zhǔn)確度和批內(nèi)、批間精密度均達(dá)到試驗要求[1]。見表1。

2.4 回收率

低、中、高濃度（5.1、81.9、1024.0 ng/mL）的血漿樣品提取回收率分別為75.0%、74.1%和77.3%，RSD（%）分別為4.9%、0.7%和3.2%（n=6）。

2.5 穩(wěn)定性及質(zhì)量控制

結(jié)果表明，替米沙坦血漿樣品經(jīng)過3次冷凍—解凍循環(huán)后穩(wěn)定，在-20 ℃保存94 d內(nèi)穩(wěn)定。見表2。

為減少系統(tǒng)誤差，每批血漿樣品分析時，建立隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血藥濃度，隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線用加權(quán)最小二乘法[2]（W=1/χ2）進(jìn)行線性回歸運算，同時平行測定低、中、高3個濃度的質(zhì)控樣品，質(zhì)控樣品測定結(jié)果的RE均在±15%之內(nèi)，符合有關(guān)規(guī)定[1]。

2.6 藥動學(xué)參數(shù)及結(jié)果

24名健康受試者分別口服替米沙坦分散片受試制劑A、受試制劑B和替米沙坦片參比制劑后藥-時曲線見圖5。主要藥動學(xué)參數(shù)以及生物利用度結(jié)果見表3。

表1 替米沙坦精密度與準(zhǔn)確度

表2 替米沙坦血漿樣品3次冷凍解凍循環(huán)穩(wěn)定性

表3 受試制劑A、B和參比制劑主要藥動學(xué)參數(shù)

2.7 生物等效性結(jié)果

方差分析結(jié)果顯示，AUC0-t、AUC0-∞和Cmax在藥劑間、周期間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但是在個體間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。采用雙單側(cè)t檢驗和[1-2α]置信區(qū)間法進(jìn)行生物等效性評價，其中Tmax采用非參數(shù)檢驗法。結(jié)果表明，替米沙坦分散片受試制劑A、受試制劑B的AUC0-t、AUC0-∞和Cmax均拒絕生物不等效假設(shè)。受試制劑A中，替米沙坦AUC0-t的90%置信區(qū)間為參比制劑的87.8%～105.1%，AUC0-∞的90%置信區(qū)間為參比制劑的87.7%～105.3%，Cmax的90%置信區(qū)間為參比制劑的92.5%～110.0%。受試制劑B中，替米沙坦AUC0-t的90%置信區(qū)間為參比制劑86.9%～104.1%，AUC0-∞的90%置信區(qū)間為參比制劑的85.6%～102.8%，Cmax的90%置信區(qū)間為參比制劑的91.1%～108.3%。Tmax在受試制劑A、受試制劑B與參比制劑間的Tmax均無顯著性差異。

根據(jù)以上結(jié)果判定，浙江泰利森藥業(yè)有限公司提供的國產(chǎn)替米沙坦分散片（受試制劑A，規(guī)格：40毫克/片和受試制劑B，規(guī)格：80毫克/片）與Boehringer Ingelheim International GmbH生產(chǎn)、上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司分裝的原研藥品替米沙坦片（參比制劑，商品名：美卡素?，規(guī)格：80毫克/片）具有生物等效性。

3 討 論

[3]，首先選擇乙腈直接沉淀蛋白的樣品處理方法，結(jié)果表明雜質(zhì)干擾較多。替米沙坦血漿蛋白結(jié)合率較高，為99%以上，故采用酸化后用提取溶劑進(jìn)行提取的樣品處理方法?？疾炝艘颐?二氯甲烷（3∶2）和乙酸乙酯作為提取溶劑，結(jié)果表明乙醚-二氯甲烷（3∶2）提取率較高，干擾較小，故選擇其為提取溶劑。

本試驗所建立的高效液相色譜法測定人體血漿中替米沙坦的濃度，具有分析時間短、操作簡便、靈敏度高等特點，適用于替米沙坦分散片的人體生物等效性研究。

本試驗采用DAS2.1.1數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件，對藥動學(xué)參數(shù)進(jìn)行計算，結(jié)果表明受試制劑與參比制劑的藥動學(xué)參數(shù)與文獻(xiàn)[3]報道基本一致。同時文獻(xiàn)報道，Cmax、AUC個體間差異較大，本試驗結(jié)果與報道基本一致。

對替米沙坦的主要藥動學(xué)參數(shù)進(jìn)行方差分析表明，兩制劑的Cmax、AUC經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后，在制劑間、周期間均無顯著性差異，兩制劑具有生物等效性。

參考文獻(xiàn)

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[2] 鐘大放.以加權(quán)最小二乘法建立生物分析標(biāo)準(zhǔn)曲線的若干問題[J].藥物分析雜志,1996,1(5):343-346.

[3] 喬海靈,田鑫,溫強,等.替米沙坦片在健康人體的藥代動力學(xué)和相對生物利用度[J].中國臨床藥理學(xué)雜志,2005,21(1):33-36.

R969.1

B

1671-8194（2014）21-0094-03