肉桂單寧的提取工藝比較研究

陳薈蕓，馬 麗，賴 芳，李偉光，劉珈伶，劉雄民

（廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西南寧530004）

單寧，又稱鞣質(zhì)，是一種廣泛存在于植物根、莖、葉、果實(shí)及樹皮等部位的復(fù)雜酚類化合物[1]。單寧獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)和多元酚結(jié)構(gòu)使其在延緩衰老、預(yù)防和治療由自由基引起的疾病如腫瘤、癌變、心腦血管疾病等方面顯示出獨(dú)特的優(yōu)越性[2]，在臨床醫(yī)學(xué)、食品、化妝品等領(lǐng)域得到廣泛的關(guān)注和應(yīng)用[3]。

肉桂（cinnamon cortex）是樟科樟屬植物肉桂（Cinnamomum cassia Presl）的干燥樹皮[4]，是我國藥食兩用的植物資源。肉桂含揮發(fā)油[5]、黃酮[6]、多酚[7]、多糖[8]、皂苷[9]等多種成分，近年來，在對(duì)這些有效成分的提取、成分分析和藥理活性研究方面取得了不少進(jìn)展[10-15]。

目前，關(guān)于肉桂多酚的研究較多[16-18]，而針對(duì)肉桂單寧的則較少。已見報(bào)道的肉桂單寧類化合物的定量方法有Folin-Denis法[19]和酸化香草醛法[20]。但Folin-Denis法一般用于測(cè)定總酚含量，對(duì)單寧的測(cè)定并無特異性，測(cè)定縮合單寧帶來較大誤差。酸化香草醛法是測(cè)定縮合單寧含量常用的方法，其酸性催化介質(zhì)一般為鹽酸或硫酸，有研究[21]表明以硫酸為催化介質(zhì)測(cè)定單寧含量時(shí)準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性均優(yōu)于鹽酸。超聲提取具有提取溫度低、效率高、節(jié)能省時(shí)等優(yōu)勢(shì)，已廣泛用于多種植物單寧的提取，但其應(yīng)用于肉桂單寧的提取卻未見報(bào)道。

本文以廣西肉桂為原料，采用溶劑法和超聲輔助法對(duì)肉桂單寧提取工藝進(jìn)行比較研究，建立了以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品，香草醛-硫酸為顯色劑的分光光度法定量分析肉桂中單寧含量跟蹤提取工藝過程，旨在尋找一條節(jié)能高效的提取工藝，為肉桂單寧深度加工和開發(fā)高附加值的肉桂單寧產(chǎn)品的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肉桂 產(chǎn)于廣西防城，由南寧市景昌中藥飲片有限公司提供；兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品檢定所，純度為98%；石油醚（沸程60 ～90℃）、香草醛、濃硫酸、無水乙醇、甲醇 均為市售分析純。

FZ102型微型植物粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；DF-101B型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市英谷予華儀器廠；RE-52A型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；KQ-600DB型超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司；AR224CN型電子天平 OHAUS國際貿(mào)易有限公司；DL-6000B型大型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；UV-2550型紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 工藝流程

干燥肉桂→粉碎過60目篩→石油醚回流脫脂→脫脂肉桂粉→溶劑法/超聲輔助提取→離心（4200r/min，10min）、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮（40℃）、干燥、稱重→稱取一定量的粗提物→蒸餾水溶解、定容得樣品溶液→顯色并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度→計(jì)算單寧含量。

1.3 肉桂中單寧含量測(cè)定方法

采用改良的香草醛-硫酸法[21]測(cè)定肉桂單寧含量。

1.3.1 試劑的制備 準(zhǔn)確稱取兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品50mg置于50mL棕色容量瓶中，蒸餾水溶解并定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取儲(chǔ)備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，分別置于10mL棕色容量瓶中，蒸餾水稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mg/mL的系列兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液。再分別配制質(zhì)量濃度為30mg/mL香草醛-甲醇溶液和體積分?jǐn)?shù)為30%硫酸-甲醇溶液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確量取質(zhì)量濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mg/mL的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.5mL于6只25mL的棕色容量瓶中，依次加入2.5mL 30mg/mL香草醛-甲醇溶液、2.5mL30%硫酸-甲醇溶液，搖勻，30℃條件下放置20min。以蒸餾水和相應(yīng)體積的試劑做參比液，以0.20mg/mL兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液顯色后，在400 ～700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)，再在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定系列濃度標(biāo)液吸光度。以濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 肉桂單寧得率的計(jì)算 計(jì)算式為：

式中：C0為待測(cè)樣品溶液的質(zhì)量濃度mg/mL；V0為待測(cè)樣品溶液的體積，mL；m1為脫脂肉桂粉的質(zhì)量，g；m2為配制待測(cè)樣品溶液時(shí)所稱取的粗提物的質(zhì)量，g；m3為提取所得粗提物的總質(zhì)量，g。

1.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 溶劑法提取肉桂單寧實(shí)驗(yàn) 以5.0g脫脂肉桂粉作為提取對(duì)象，肉桂單寧得率為考察指標(biāo)，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度和提取時(shí)間4個(gè)因素對(duì)溶劑法提取肉桂單寧得率的影響，選擇最佳單因素提取條件。

1.4.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響 采用料液比為1∶20（g/mL），提取時(shí)間2.5h，提取溫度70℃，乙醇濃度分別40%、50%、60%、70%、80%、90%，分別考察肉桂單寧的得率。

1.4.1.2 料液比的影響 采用乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取時(shí)間2.5h，提取溫度70℃，料液比分別1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL），分別考察肉桂單寧的得率。

1.4.1.3 提取溫度的影響 采用乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比為1∶40（g/mL），提取時(shí)間2.5h，提取溫度分別40、50、60、70、80℃，分別考察肉桂單寧的得率。

1.4.1.4 提取時(shí)間的影響 采用乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比為1∶40（g/mL），提取溫度70℃，提取時(shí)間分別1.5、2.5、3.5、4.5、5.5h，分別考察肉桂單寧的得率。

1.4.2 超聲波輔助法提取肉桂單寧實(shí)驗(yàn) 以5.0g脫脂肉桂粉作為提取對(duì)象，肉桂單寧得率為考察指標(biāo)，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、提取時(shí)間和超聲功率5個(gè)因素對(duì)超聲波輔助法提取肉桂單寧得率的影響，選擇最佳單因素提取條件。

1.4.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響 采用料液比為1∶20（g/mL），提取時(shí)間40min，提取溫度50℃，超聲功率360W，乙醇濃度分別40%、50%、60%、70%、80%、90%，分別考察肉桂單寧的得率。

1.4.2.2 料液比的影響 采用乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取時(shí)間40min，提取溫度50℃，超聲功率360W，料液比分別1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），分別考察肉桂單寧的得率。

1.4.2.3 提取溫度的影響 采用乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比為1∶20（g/mL），提取時(shí)間40min，超聲功率360W，提取溫度分別30、40、50、60、70℃，分別考察肉桂單寧的得率。

1.4.2.4 提取時(shí)間的影響 采用乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比為1∶20（g/mL），提取溫度50℃，超聲功率360W，提取時(shí)間分別1.5、2.5、3.5、4.5、5.5h，分別考察肉桂單寧的得率。

1.4.2.5 超聲功率的影響 采用乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比為1∶20（g/mL），提取時(shí)間40min，提取溫度50℃，超聲功率分別240、300、360、420、480W，分別考察肉桂單寧的得率。

1.5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1 溶劑法提取單寧正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取溫度4個(gè)因素，以肉桂單寧的得率為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)肉桂單寧的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，因素水平見表1。

1.5.2 超聲輔助提取單寧正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定料液比為1∶20g/mL，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率、提取時(shí)間、提取溫度4個(gè)因素，以肉桂單寧的得率為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)肉桂單寧的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，因素水平見表2。

表2 超聲輔助法正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of the orthogonal test for ultrasonic extraction

2 結(jié)果與分析

2.1 肉桂單寧的定量分析

2.1.1 肉桂單寧和兒茶素的紫外可見光譜及兒茶素的標(biāo)準(zhǔn)曲線 配制兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品溶液及肉桂單寧提取物溶液，經(jīng)香草醛-硫酸顯色后，在400 ～700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果見圖1。兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液和肉桂單寧粗提物溶液在500nm左右均有最大吸收，故選擇500nm為測(cè)定波長(zhǎng)。在500nm波長(zhǎng)處測(cè)定系列濃度標(biāo)液吸光度。以濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖2）。結(jié)果表明：兒茶素在0.05 ～0.30mg/mL線性范圍內(nèi)，線性回歸方程為：Y=3.0153X+0.0050，R2=0.9997。

圖1 兒茶素和樣品溶液的最大吸收波長(zhǎng)掃描圖Fig.1 Maximum absorption wavelength scanning of catechin and sample solution

圖2 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of catechins

2.1.2 方法學(xué)考察結(jié)果 通過方法學(xué)考察結(jié)果顯示，該定量方法精密度良好，RSD=0.33%（n=5）；在10 ～50min內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD=0.68%（n=9），本實(shí)驗(yàn)中選擇顯色時(shí)間為20min；平均加標(biāo)回收率為101.08%，RSD=3.31%（n=5），故該方法精密度和穩(wěn)定性高，適于肉桂單寧的含量測(cè)定。

2.2 肉桂單寧提取條件的優(yōu)化

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)肉桂單寧得率的影響 由圖3可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大得率也逐漸升高，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)達(dá)到最大，隨后開始降低，而且對(duì)超聲輔助法的影響較溶劑法更為顯著。這是由于隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加溶劑極性也逐漸降低，其他醇溶性雜質(zhì)大量溶出使得得率降低。超聲波空化作用使得單寧等物質(zhì)與溶劑接觸更充分，影響更顯著。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)肉桂單寧得率的影響Fig.3 Effect of the ethanol concentration on yield of tannin from cinnamon

2.2.2 料液比對(duì)肉桂單寧得率的影響 由圖4可知，料液比較小時(shí)，單寧得率隨著溶劑量增加而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，這是因?yàn)槿軇┝康模龃罅藛螌庮愇镔|(zhì)擴(kuò)散空間，降低了原料顆粒周圍有效成分濃度，有利于單寧類物質(zhì)分子從物料高濃度部位向低濃度的溶液中運(yùn)動(dòng)、傳遞和擴(kuò)散，而后溶劑量繼續(xù)增加，單寧得率稍微下降后趨于平緩，這是因?yàn)槿軇┝吭龃蟮揭欢ǔ潭葧r(shí)，其他雜質(zhì)大量溶出，濃度差減小，導(dǎo)致單寧不能很好溶出，之后原料顆粒與溶劑接觸面積相對(duì)穩(wěn)定，濃度差趨于平衡，傳質(zhì)影響穩(wěn)定。溶劑量過大會(huì)增加后續(xù)提取液濃縮、分離純化等工作壓力以及能量和時(shí)間消耗，故分別選擇1∶40g/mL和1∶20g/mL為溶劑法和超聲輔助法提取肉桂單寧的最佳料液比。

2.2.3 提取溫度對(duì)肉桂單寧得率的影響 由圖5可知，肉桂單寧得率隨著提取溫度的增加先升高后下降，相對(duì)溶劑法而言，超聲輔助法受溫度影響更顯著。由于單寧類物質(zhì)在乙醇溶液中的溶解度和擴(kuò)散速度隨著溫度的升高而逐漸增大，但溫度繼續(xù)升高也會(huì)使得乙醇揮發(fā)，同時(shí)單寧類物質(zhì)可能部分被氧化，活性成分受到了一定破壞，故溶劑法和超聲輔助法最佳提取溫度分別為70℃和50℃，超聲輔助法最佳提取溫度更低，更有利于單寧類物質(zhì)的穩(wěn)定。

圖5 提取溫度對(duì)肉桂單寧得率的影響Fig.5 Effect of the extraction temperature on yield of tannin from cinnamon

圖6 提取時(shí)間對(duì)肉桂單寧得率的影響Fig.6 Effect of the extraction time on yield of tannin from cinnamon

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)肉桂單寧得率的影響 由圖6可知，肉桂單寧得率隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。這是因?yàn)槿夤鸪煞窒鄬?duì)比較復(fù)雜，提取時(shí)間延長(zhǎng)使雜質(zhì)成分溶出，部分單寧類物質(zhì)因部分組織過熱及雜質(zhì)影響結(jié)構(gòu)被破壞，從而導(dǎo)致單寧得率降低。綜合考慮，溶劑法和超聲輔助法提取肉桂單寧最佳提取時(shí)間分別為2.5h和40min，這樣超聲輔助法提取時(shí)間明顯少于溶劑法，使用超聲輔助法提取效率更高。

2.2.5 超聲功率對(duì)肉桂單寧得率的影響 由圖7可知，單寧得率隨著超聲功率的增大而逐漸升高，在360W附近達(dá)到最大，超過360W以后，開始降低。這是由于隨著超聲波功率增大，空化作用增強(qiáng)，體系中單寧分解的速度也增加。故選擇360W為超聲輔助法提取的最佳超聲功率。

圖7 超聲功率對(duì)肉桂單寧得率的影響Fig.7 Effect of the ultrasonic power on yield of tannin from cinnamon

2.2.6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果兩種提取方法的L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見表3、表4，從表3極差分析結(jié)果可以看出，各因素對(duì)溶劑法提取單寧得率的影響主次順序?yàn)锽＞C＞A＞D，即：提取時(shí)間＞提取溫度＞料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。溶劑法提取最佳組合條件為A1B2C2D2，即：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比為1∶30（g/mL），提取時(shí)間為2.5h，提取溫度為70℃，與正交實(shí)驗(yàn)單寧得率最高的實(shí)驗(yàn)組2條件一致。

表3 溶劑法正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析Table 3 Orthogonal experimental design and result analysis of solvents extraction

從表4中極差分析結(jié)果可以看出，各因素對(duì)超聲輔助法提取單寧得率的影響主次順序?yàn)镃＞D＞A＞B，即：超聲功率＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞提取時(shí)間。超聲輔助法提取最佳組合條件為A1B2C2D1，即提取溫度40℃，提取時(shí)間40min，超聲功率360W，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%。該組合不在正交表中，為此對(duì)最佳組合進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

表4 超聲輔助法正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析Table 4 Orthogonal test results and analysis ofultrasonic extraction

2.2.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照超聲提取法的優(yōu)化條件，進(jìn)行3次提取平行實(shí)驗(yàn)，經(jīng)計(jì)算：超聲輔助法提取肉桂單寧得率分別為：41.58、40.97、41.29mg/g，平均得率為41.28mg/g，比正交實(shí)驗(yàn)最高單寧得率40.08mg/g提高幅度2.99%，且RSD=0.74%（n=3），實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，優(yōu)化后的工藝提取條件單寧得率高、穩(wěn)定性好，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.2.8 兩種提取方法的比較 由表5可知，采用溶劑法和超聲輔助法提取單寧時(shí)，兩種方法的得率相近，但溶劑法用時(shí)約是超聲輔助法用時(shí)的4倍，溶劑法乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比及提取溫度均比超聲輔助法高。乙醇體積分?jǐn)?shù)高增加了生產(chǎn)成本，料液比高使得后期濃縮純化耗時(shí)較長(zhǎng)，提取溫度高一方面可能對(duì)所提單寧結(jié)構(gòu)性質(zhì)產(chǎn)生影響，另一方面所消耗的能量也會(huì)增加。綜上所述，從能耗和效率的角度考慮，超聲輔助法能耗低效率高，更適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

表5 兩種單寧提取方法的比較Table 5 The comparison of two methods of extracting tannin

3 結(jié)論

3.1 以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品，建立了香草醛-硫酸法測(cè)定肉桂單寧含量的測(cè)定方法，在500nm測(cè)定波長(zhǎng)下，得到兒茶素含量與吸光度在0.05 ～0.30mg/mL濃度范圍內(nèi)的線性回歸方程為：Y=3.0153X+0.0050，R2=0.987。

3.2 經(jīng)過正交優(yōu)化，溶劑法最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比為1∶30g/mL，提取時(shí)間為2.5h，提取溫度為70℃。超聲輔助法最佳工藝條件為：料液比為1∶20g/mL，提取溫度40℃，提取時(shí)間40min，超聲功率360W，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，此條件下單寧得率為41.28mg/g。超聲輔助法提取肉桂單寧比溶劑法更加節(jié)能、省時(shí)，有利于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。

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