靈芝菌絲體中靈芝酸T、R和S的H P L C測定方法的建立和應用

趙 娜，馮 娜，賈 薇，馮 杰，劉艷芳，張勁松，*

（1.國家食用菌工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點開放實驗室，上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所，上海201403；2.上海海洋大學食品科學與工程，上海201306）

靈芝（Ganoderma lucidum）俗稱靈芝草，古稱瑞草、仙草、萬年覃等，是擔子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌，具有很高的藥用價值[1]，現(xiàn)代的研究證實其有抗腫瘤、保肝、降血壓、降血糖等生物活性，三萜是靈芝產(chǎn)生抗腫瘤、保肝等生物活性的主要藥用成分[2-3]。目前，靈芝相關(guān)的保健品和藥品多以靈芝子實體為原料，但因其栽培周期長，靈芝中的活性成分的種類和含量如三萜易受栽培環(huán)境的變化而變化，導致產(chǎn)品質(zhì)量難以控制。而利用發(fā)酵的方法制備靈芝的菌絲體作為靈芝產(chǎn)品開發(fā)的原料，具有生產(chǎn)周期短，質(zhì)量容易控制，易于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點，越來越得到業(yè)界的重視。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)靈芝酸T、靈芝酸S和靈芝酸R是靈芝菌絲體中主要的三萜成分，其具有抗肝癌[4]、抗子宮頸癌[5]、抗前列腺癌的作用。因此建立靈芝菌絲體中主要三萜成分的測定方法對開發(fā)靈芝菌絲體的產(chǎn)品就至關(guān)重要。靈芝子實體中三萜類化合物的液相色譜分析已有報道[6-7]，但涉及菌絲體中三萜成分檢測方法和質(zhì)量控制的很少有報道。本研究以已報道的關(guān)于靈芝酸的相關(guān)檢測方法為基礎(chǔ)[8-10]，建立了HPLC法對靈芝菌絲體中靈芝酸T、靈芝酸S和靈芝酸R進行同時測定的方法，為快速準確的檢測靈芝發(fā)酵菌絲體中靈芝酸含量提供了技術(shù)保證。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

靈芝酸T、S、R標準品 純度＞98%，上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌所深加工技術(shù)和發(fā)酵工程研究室；赤芝0125菌絲體、靈芝119菌絲體、靈芝G0023菌絲體中國微生物菌種保藏管理委員會農(nóng)業(yè)微生物中心上海食用菌分中心；水 超純水；甲醇 色譜純；冰醋酸 分析純。

Waters Acquity HPLCTM型高效液相色譜儀 美國Waters公司；KQ-600B型超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；超純水器 ELGA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 YMC C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相0.5%冰醋酸溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～20min，85%B→100%B；20～30min，100%B），流速為1mL/min；檢測波長為245nm；柱溫控制在30℃；進樣量為10μL。

1.2.2 樣品前處理條件選擇

1.2.2.1 提取溶劑的選擇 精密稱取樣品（G0023）粉末0.5g，分別加入95%乙醇、甲醇、氯仿各25mL，超聲2h，放冷，過濾，補足損失的溶劑，搖勻，濾液用0.22μm微孔濾膜過濾，即得。

1.2.2.2 浸提和超聲的選擇 精密稱取樣品（G0023）粉末0.5g，加入25mL甲醇，分別浸提14h、超聲1h、超聲2h、超聲3h、超聲4h，放冷，過濾補足損失的溶劑，搖勻，濾液用0.22μm微孔濾膜過濾，即得。

1.2.3 方法學考察

1.2.3.1 標準液的配制與曲線繪制 精密稱定靈芝酸T 10.67mg、靈芝酸S 10.59mg、靈芝酸R 10.65mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R對照品儲備液。分別吸取等量的靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R的對照品儲備液，混合制成標準混合母液。然后分別稀釋成5個濃度梯度，用孔徑0.22μm濾膜過濾，置于進樣瓶中。按照上述的色譜條件獲得色譜圖后，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，制作標準曲線，求出回歸方程。

1.2.3.2 精密度實驗 取混合對照品連續(xù)進樣6次，測定靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R峰面積，并計算峰面積的RSD值。

1.2.3.3 重復性實驗 精密稱取靈芝樣品（G0023）6份，按確定的方法制備供試溶液，測定靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R的含量，并計算含量的RSD值。

1.2.3.4 穩(wěn)定性實驗 精密稱取靈芝樣品（G0023）1份，按確定方法制備供試溶液，分別在制備后0、5、10、15、20、25h進樣測定靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R的峰面積，并計算峰面積的RSD值。

1.2.3.5 加樣回收率實驗 取已知含量的靈芝樣品（G0023）9份，精密稱取各約0.1g，按高、中、低3個濃度，各精密加入一定量的靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R對照品3份，按照確定方法制備供試溶液，測定靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R的含量，并計算含量的RSD值。1.2.3.6 樣品分析 在相同的液相色譜條件下，分別將對照品溶液和供試菌絲體的樣品溶液注入高效液相色譜儀中，用外標法計算含量，根據(jù)樣品對應的峰面積和標準曲線，計算各樣品中靈芝酸T、靈芝酸R、靈芝酸S的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的確定

2.1.1 提取溶劑的比較 圖1的結(jié)果表明，三種提取方法的三萜圖譜含有的三萜種類相同，但相同成分的峰高有差異。

表1 不同提取劑提取率的比較Table 1 Comparison of ganderic acids’extraction ratio by different extractants

表1表明，通過SAS 8.2軟件組間差異分析發(fā)現(xiàn)結(jié)合靈芝酸T、靈芝酸S和靈芝酸R三個指標來看，氯仿、甲醇、95%乙醇三種提取劑間，Wilks’Landa統(tǒng)計量F=8.39，p=0.0042＜0.01，表明三者存在極顯著差異；氯仿和甲醇組間，F(xiàn)=24.36，p=0.005＜0.01，說明兩者存在顯著差異；氯仿和95%乙醇組間，F(xiàn)=12.73，p=0.016＜0.05，說明兩者存在顯著差異；甲醇和95%乙醇組間，F(xiàn)=4.34，p=0.095＞0.05，說明兩者不存在差異。其中氯仿的提取效率最差，目標物質(zhì)提取量均最低，甲醇和95%乙醇譜圖相似度高，甲醇的提取效果更好，目標物質(zhì)均達到最高提取量，因此本研究確定采用甲醇作為提取溶劑。

2.1.2 超聲和浸提提取方式的比較 結(jié)合靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R三個指標來看，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)浸提和超聲各組組間的Wilks’Landa統(tǒng)計量F=4.34，p=0.0015＜0.01，表明各組間存在極顯著差異。浸提14h組與超聲1、2、3、4h組均存在顯著性差異，但超聲1、2、3、4h組之間不存在差異很明顯（p＞0.05）。隨著超聲時間的增加，靈芝酸的提取量升高。因超聲的方法耗時短、提取的得率高，因此確定超聲2h為最佳提取方式。

2.2 色譜條件的確定

全波長掃描發(fā)現(xiàn)靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R在245nm有最大吸收峰，當檢測波長設(shè)為245nm，流動相為0.5%冰醋酸溶液和甲醇，柱溫為30℃，流速為1mL/min時，靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R的保留時間分別為13.5、15.3、19.9min，達到基線分離（見圖2）。用該色譜條件分析G0023上層菌絲體樣品中這三種靈芝酸，發(fā)現(xiàn)它們和其他的色譜峰能很好的分開，說明該條件可用于靈芝菌絲體中這三種靈芝酸的檢測（見圖3）。

表2 不同提取方式提取率的比較Table 2 Comparison of GAs’extraction ratio in different extraction ways

圖2 混合對照品的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograms of mixed reference substances

圖3 G0023上層菌絲體樣品的HPLC圖Fig.3 HPLC chromatograms of Ganoderma sample G0023

2.3 方法學考察

2.3.1 標準曲線的制作 靈芝酸T、靈芝酸S和靈芝酸R的不同濃度的標準溶液的濃度和峰面積的標準曲線見圖4。靈芝酸T的線性回歸方程為Y=11106X-68267，r=0.9999；靈芝酸S的線性回歸方程為Y=15521X-51762，r=0.9999；靈芝酸R的線性回歸方程為Y=16736X-37108，r=1.0000。結(jié)果表明，靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R的測試濃度分別在4.571 ～584.256、5 ～320、4.921 ～629.888μg/mL內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

圖4 靈芝酸T（A）、靈芝酸S（B）、靈芝酸R（C）的標準曲線Fig.4 Standard curve of GA-T(（A）、GA-S（B）and GA-R（C）

2.3.2 精密度實驗 取混合對照品連續(xù)進樣6次，計算6次測定的峰面積的RSD，結(jié)果靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R峰面積的RSD值（n=6）分別為0.93%、1.76%、1.27%（見表3），表明方法的精密度良好。

2.3.3 重復性實驗 取靈芝樣品（G0023）6份進行重復性測試，結(jié)果靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R含量的RSD值（n=6）分別為1.31%，1.76%、1.29%（見表4），表明方法的重復性良好。

表3 精密度實驗Table 3 Precision of the measured results

2.3.4 穩(wěn)定性實驗 把靈芝樣品（G0023）的供試品溶液，分別在制備后0、5、10、15、20、25h進樣測定，發(fā)現(xiàn)靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R的RSD值（n=6）分別為0.71%、0.66%、1.14%（見表5），結(jié)果表明方法的穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率實驗 加樣回收率實驗結(jié)果表明靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R特異性良好。平均加樣回收率和RSD值（n=9）分別為99.1%、2.4%，100.6%、1.1%，100.7%、0.9%。

2.3.6 靈芝菌絲體中靈芝酸的含量的測定 利用建立的HPLC方法對不同菌絲體中靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R的含量進行測定（見表7）。利用SAS 8.2軟件組間差異分析，結(jié)合119上層菌絲、G0023上層菌絲、赤芝0125-1上層菌絲和下層菌絲四個指標來看，靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R三組間，Wilks’Landa統(tǒng)計量F=28.45，p=0.0003＜0.01。說明不同菌株間的靈芝酸T、靈芝酸S和靈芝酸R的含量差異大，且三者之間的比例也不同，119上層菌絲體靈芝酸T、靈芝酸S和靈芝酸R之間的比為15∶5∶1，而G0023上層菌絲體為2∶2∶1；說明同一菌株不同發(fā)酵部位的菌絲體中靈芝酸T、靈芝酸S和靈芝酸R的含量差異也很大，且比例也不同，如赤芝0125-1上層菌絲體為6∶2∶1，赤芝0125-1下層菌絲體為2∶1∶1。

表4 重復性實驗Table 4 Reproducibility of the measured results

表5 穩(wěn)定性實驗Table 5 Stability of the measured results

表6 加樣回收率Table 6 Recoveries for the measured results

表7 不同靈芝菌絲體中靈芝酸的測定結(jié)果Table 7 Determination of ganoderic acids in different Ganoderma mycelium samples

3 結(jié)論

本研究確定了靈芝菌絲體三萜的提取方法和優(yōu)化利用C18柱同時檢測靈芝酸T、靈芝酸S和靈芝酸R的色譜條件，通過精密度、重復性和加樣回收率的考察，表明本研究獲得的HPLC方法符合作為檢測方法的要求，適合靈芝發(fā)酵菌絲體中靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R的同時定量分析，是一種理想的靈芝菌絲體中三萜的定量分析方法。

[1]林志彬.靈芝的現(xiàn)代研究[M].北京：北京醫(yī)科大學出版社，2001：1-327.

[2]唐文.發(fā)酵靈芝菌絲體中靈芝酸的分離純化及其抗癌活性研究[D].上海：華東理工大學，2006.

[3]周月琴，楊曉彤，楊慶堯.靈芝三萜的藥理活性研究進展[J].菌物學報，2005，24：303-305.

[4]Tang W，Liu JW，Zhao W，et al.Ganoderic acid T from Ganoderma lucidum mycelia induces mitochondria mediated apoptosis in lung cancer cells[J].Life Sciences，2006，80：205-211.

[5]Liu RM，Zhong JJ.Ganoderic acid MF and S induce mitochondria mediated apoptosis in human cervical carcinoma HeLa cells[J].Phytomedicine，2011，18（5）：349-355.

[6]郭江紅，趙亞萍.HPLC法測定復方甲苯咪唑片中甲苯咪唑和鹽酸左旋咪唑的含量[J].中國藥品標準，2010，11（3）：219.

[7]張瑞麗，郝智慧，劉元元.HPLC法測定復方氯硝柳胺片的含量[J].中國獸藥雜志，2012，46（7）：34

[8]董虹玲，夏廣萍，趙娜夏，等.HPLC法測定靈芝子實體和孢子粉中靈芝酸C2、靈芝酸G和靈芝酸A[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2013，28（1）：41-43.

[9]Wagner R，Mitchell DA，Sassaki GL，et al.Current techniques for the cultivation of Ganoderma lueidum for the production of biomass，ganoderic acid and polysaeeharides[J].Food Technology and Biotechnology，2003，41：371-382.

[10]徐軍偉.在液體靜置培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)中單體靈芝酸的生產(chǎn)及差異表達基因的鑒定[D].上海：華東理工大學，2009.