樹(shù)脂法提取純化白藜蘆醇的新工藝研究

徐月?tīng)N，馬德新

湖南希爾天然藥業(yè)有限公司，永州425000

白藜蘆醇(resveratrol，Res．)，化學(xué)名稱(chēng)為 3，4'，5-三羥基-二苯乙烯(3，4'，5-trihydroxystilbene)。其別名為虎杖甙元，又稱(chēng)芪三酚，分子式為C14H12O3，其相對(duì)分子質(zhì)量為228．25，純品為無(wú)色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)為256～258℃，在261℃以上易升華。其藥理作用為:抗菌、抗氧化、預(yù)防心臟病、抗癌、抗血小板凝聚、保護(hù)肝臟、雌激素作用、防輻射、免疫調(diào)節(jié)、抗艾滋病活性等［1］。目前，白藜蘆醇的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)非常激烈，提取純化白藜蘆醇的方法很多，但都采用先酶解再有機(jī)溶劑萃取或者柱層析提純工藝［2，3］，生產(chǎn)成本高，產(chǎn)品收率低，不適用于工業(yè)化大生產(chǎn)。為了解決提取白藜蘆醇工藝中存在的上述問(wèn)題，提高市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)力，該文采用樹(shù)脂［4］法從虎杖中提取高含量的白藜蘆醇，工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低，更適合于工業(yè)化大生產(chǎn)。

1 材料與儀器

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

虎杖原藥材購(gòu)自湖北恩施;白藜蘆醇對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;各種大孔樹(shù)脂購(gòu)自西安藍(lán)曉科技有限公司;釀酒曲購(gòu)自安琪酵母股份有限公司;其余試劑均為分析純。

1．2 實(shí)驗(yàn)儀器

玻璃樹(shù)脂柱尺寸:20 mm×420 mm(自制);安捷倫高效液相色譜儀(HPLC，美國(guó)安捷倫公司);N-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛(ài)郎儀器儀器有限公司);真空干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);四孔水浴鍋(金壇市大地自動(dòng)化儀器廠(chǎng));AG135分析電子天平(梅特勒托利多儀器有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2．1 白藜蘆醇的提取純化

取200 g原料粗粉，加入1 g釀酒曲，再加入750 mL水充分搖勻，置于35～40℃水浴中浸泡過(guò)夜，接近24 h后，將水酶解液放下來(lái)，然后將藥渣加75%乙醇回流提取，提取三次，每次1 h，合并三次提取液，經(jīng)回收乙醇，濃縮至500 mL，離心過(guò)濾后，濾液上已處理好的XC-7大孔樹(shù)脂柱，柱體積100 mL，上完藥液后，用3倍量樹(shù)脂體積的10%乙醇洗脫，最后用5倍量樹(shù)脂體積的60%乙醇洗脫，收集60%乙醇洗脫液，經(jīng)回收乙醇減壓濃縮至稠膏，真空干燥即得產(chǎn)品。

2．2 HPLC檢測(cè)白藜蘆醇含量

2．2．1 色譜條件

色譜柱為ODSC18柱;流動(dòng)相為乙腈-水(25∶75)，流速1．0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)307 nm，進(jìn)樣量為10μL。

2．2．2 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣，如圖1，理論板數(shù)按白藜蘆醇峰計(jì)不低于3000。

圖1 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品(A)及白藜蘆醇樣品(B)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of resveratrol standard(A)and resveratrol sample(B)

2．2．3 線(xiàn)性關(guān)系考察

精密吸取上述對(duì)照品溶液2、4、6、8和10μL，注入液相色譜儀。按上述色譜條件測(cè)定，以對(duì)照品峰面積Y為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程y=238722x－4597，r=0．9997。線(xiàn)性范圍為白藜蘆醇0．03 ～0．15 μg。

2．2．4 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液，按上述色譜條件，同法連續(xù)測(cè)定6次，測(cè)得白藜蘆醇峰面積的RSD為0．94%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2．2．5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一白藜蘆醇供試品溶液，按上述檢測(cè)條件，分別于0、4、8和12 h時(shí)間間隔進(jìn)行測(cè)定，分別測(cè)定峰面積，計(jì)算得白藜蘆醇峰面積的RSD為1．12%，結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2．2．6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

分別稱(chēng)取已知白藜蘆醇含量的供試樣品共6份，照供試品溶液制備，分別加入白藜蘆醇對(duì)照品溶液4 mL，測(cè)定結(jié)果平均回收率為101．23%，RSD為1．15%(n=6)。

2．2．7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批次的虎杖原藥材粗粉，分為5份，按2．1項(xiàng)下方法制備供試品溶液共5份，并在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果為樣品中白藜蘆醇含量平均值為85%，RSD為0．95%，結(jié)果表明方法重復(fù)性較好。

2．2．8 對(duì)照品溶液的制備

取白藜蘆醇對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加稀乙醇制成每1 mL含15μg的溶液，即得。

2．2．9 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取按2．1方法試驗(yàn)下來(lái)的產(chǎn)品5 mg，精密加入稀乙醇50 mL，超聲溶解，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2．2．10 樣品測(cè)定

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

3 結(jié)果與討論

3．1 酶解物的選擇

不同酶解物對(duì)虎杖原藥材進(jìn)行對(duì)比酶解實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，在24 h內(nèi)酶解最完全的為釀酒曲，見(jiàn)表1。

3．2 純化白藜蘆醇的不同樹(shù)脂實(shí)驗(yàn)

不同樹(shù)脂對(duì)虎杖提取藥液中白藜蘆醇的除雜純化比較，結(jié)果表明，XC-7大孔吸附樹(shù)脂對(duì)白藜蘆醇純化最好，純化的白藜蘆醇含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其它樹(shù)脂的純化結(jié)果。結(jié)果見(jiàn)表2。

3．3 XC-7大孔樹(shù)脂對(duì)白藜蘆醇的動(dòng)態(tài)吸附

準(zhǔn)確量取 XC-7大孔樹(shù)脂100 mL，濕法裝柱(φ2 cm ×50 cm)，用95%乙醇浸泡24 h，并加水淋洗至無(wú)醇味。將白藜蘆醇質(zhì)量濃度為4．48 mg/mL的樣液，以10 mL/min上樣，同時(shí)控制洗脫液體積流量10 mL/min，每100 mL接一管，進(jìn)行HPLC法檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。當(dāng)上樣量達(dá)到800 mL時(shí)，流出液中白藜蘆醇的質(zhì)量濃度與樣液中的一致，表明此大孔樹(shù)脂的吸附已經(jīng)達(dá)到飽和。計(jì)算得出此大孔樹(shù)脂對(duì)白藜蘆醇的動(dòng)態(tài)吸附量為22．4 mg/mL濕樹(shù)脂。

表1 不同酶解物酶解情況Table 1 Enzymolysis resultswith different enzyme substrate used

表2 不同樹(shù)脂對(duì)白藜蘆醇純化結(jié)果Table 2 Resveratrol purification resultswith different resins

圖2 XC-7大孔樹(shù)脂對(duì)白藜蘆醇的動(dòng)態(tài)吸附曲線(xiàn)Fig.2 Dynamic adsorption curve of resveratrol on XC-7 macroporous resin

3．4 白藜蘆醇的洗脫

為研究乙醇對(duì)白藜蘆醇的洗脫性能，取白藜蘆醇質(zhì)量濃度為4．48 mg/mL的提取液500 mL進(jìn)行大孔樹(shù)脂分離，樹(shù)脂柱規(guī)格同3．3項(xiàng)下的。分別用10%、30%、50%、60%、70%乙醇各3BV洗脫，洗脫流速為10 mL/min，每100 mL接一管，進(jìn)行 HPLC法檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。300～600 mL洗脫液為30%乙醇，600～900 mL洗脫液為50%乙醇，900～1200 mL洗脫液為60%乙醇，可見(jiàn)白藜蘆醇主要被30%～60%乙醇洗脫。

圖3 乙醇對(duì)XC-7大孔樹(shù)脂上的白藜蘆醇洗脫Fig.3 Elution of resveratrolon XC-7macroporous resin with ethanol

4 結(jié)論

先將原藥材酶解，再利用樹(shù)脂對(duì)白藜蘆醇的吸附，只需簡(jiǎn)單設(shè)備幾步就可以將白藜蘆醇含量提高到85%以上，與傳統(tǒng)的萃取重結(jié)晶純化工藝相比，該法具有有工藝簡(jiǎn)單易行，操作安全方便，產(chǎn)品收率高，生產(chǎn)成本低的特點(diǎn)。

樹(shù)脂法從虎杖中提取高含量白藜蘆醇的最佳工藝:用釀酒曲于35～40℃將原藥材先酶解24 h，再用75%乙醇提取，提取液經(jīng)回收乙醇后上XC-7大孔樹(shù)脂柱，先加10%乙醇洗脫，然后再用60%乙醇洗脫并收集洗脫液，濃縮，真空干燥即可，產(chǎn)品中白藜蘆醇含量達(dá)85%，白藜蘆醇轉(zhuǎn)化率達(dá)85%以上。

1 Zeng CZ(曾超珍)，Liu ZX(劉志祥)，Wu YH(吳耀輝)，et al．Research developments in extraction technology and determination of resveratrol from Polygonum cuspidatum．Lishizhen Med Mater Med Res(時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥)，2007，18:2992-2993．

2 Deng MR(鄧夢(mèng)茹)，Liu S(劉韶)，Zhu ZJ(朱周覲)．Optimization of resveratrol from Polygonum cuspidatum by enzyme-assisted extraction．Central South Pharm(中南藥學(xué))，2011，9:699-672．

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