羧甲基茯苓多糖抗疲勞作用研究

符 輝，吳奇輝，王廣蘭，王 娟，劉 瑩，黃 文*

1華中農(nóng)業(yè)大學(xué)體育課部;2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢430070;3武漢體育學(xué)院健康科學(xué)學(xué)院，武漢 430079

茯苓為多孔菌科真菌屬茯苓(Poria cocos(Schw.)Wolf)的干燥菌核，具有利水滲濕、健脾寧心等功效，為中藥“四君八珍”之一［1］。但是，占茯苓菌核干重93%的β-茯苓聚糖(β-pachymose)不溶于水且生理活性較弱，不利于臨床應(yīng)用。β-茯苓聚糖在堿性條件下與氯乙酸反應(yīng)生成一種水溶性多糖，即羧甲基茯苓多糖(Carboxymethyl-pachyman，CMP)，具有抗腫瘤、增強免疫力、抗衰老、預(yù)防結(jié)石等作用，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)療保健領(lǐng)域［2，3］，但是至今還沒有對其抗疲勞研究的報道。本研究主要探討羧甲基茯苓多糖的抗運動疲勞作用，挖掘茯苓多糖新的潛在生物功能，為開發(fā)新型、健康的抗運動疲勞保健品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茯苓菌塊:購于湖北羅田，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用真菌研究所鑒定為茯苓(Poria cocos)。

紅景天(含1%的紅景天苷):由湖北欣愷生物科技有限公司提供，并經(jīng)湖北省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院鑒定。

小白鼠:昆明種健康雄性小鼠(SPF級)，體質(zhì)量19±4 g，購于華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院。

CMP由本實驗室制備，化學(xué)藥品均為國產(chǎn)分析純;乳酸測定試劑盒、尿素氮測定試劑盒、超氧化物歧化酶測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶測定試劑盒、乳酸脫氫酶測定試劑盒，均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 儀器與設(shè)備

WG2003型電熱鼓風(fēng)干燥箱:天津市泰斯特儀器有限公司;SHZ-C型循環(huán)水式真空泵:鞏義市予華儀器有限公司;722紫外可見分光光度計:上海光譜儀器有限公司;HH-S2型數(shù)顯恒溫水浴鍋:金壇市醫(yī)療儀器廠;Avanti J-E型冷凍離心機美國BECKMAN公司。

1.3 方法

1.3.1 羧甲基茯苓多糖(CMP)的制備

將茯苓菌塊用粉碎機粉碎，過100目，稱取10 g茯苓粉置于三口燒瓶中。然后加入50 mL 85%乙醇于55℃下攪拌溶脹30 min。之后加入3.4 g氫氧化鈉，堿化1 h。一小時之后再加入9.25 g氯乙酸及3.36 g氫氧化鈉反應(yīng)4 h。接著再加入3.36 g氫氧化鈉反應(yīng)3 h。取出，用乙酸中和至pH為6，用80%乙醇洗脫4次，與40℃下干燥5 h，得干燥小塊狀茯苓多糖，再將其用粉碎機粉碎，過100目，得干燥改性茯苓粉。然后，通過苯酚-硫酸法測得改性茯苓粉中羧甲基茯苓多糖(CMP)的含量為87.1%。

1.3.2 動物分組及給藥

將50只雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為空白對照組(蒸餾水)、紅景天陽性對照組(1 g/kg)、羧甲基茯苓多糖低劑量組(35 mg/kg)、羧甲基茯苓多糖中劑量組(70 mg/kg)、羧甲基茯苓多糖高劑量組(140 mg/kg)，每組10只。各組均以10 mL/(kg/d)的劑量，1 次/d，連續(xù)灌胃30 d［4］。飼養(yǎng)溫度:18～22℃，濕度:50% ～60%。飼喂常規(guī)飼料，自由取食。

1.3.3 小鼠體質(zhì)量的測定

首次灌胃前稱量并記錄各組小鼠體質(zhì)量，末次灌胃之后游泳前稱量并記錄各組小鼠體質(zhì)量，計算各組小鼠體質(zhì)量的增加量。

1.3.4 小鼠負重游泳實驗

末次灌胃后30 min，于尾部負重5%體質(zhì)量的鉛皮，在水深30 cm、水溫25℃的游泳箱中游泳，用秒表記錄小鼠自游泳開始至力竭的時間。當(dāng)小鼠頭部沉入水面10 s不能浮出，認為達到力竭［5］。

1.3.5 小鼠血清尿素氮(BUN)和血乳酸(BLA)的測定

小鼠負重游泳至力竭，休息15 min之后，摘眼球取血，用南京建成試劑盒測定小鼠血清尿素氮(BUN)和血乳酸(BLA)的含量。

1.3.6 小鼠肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)的測定

小鼠采血后立即取肝臟，用生理鹽水洗去殘留液，濾紙拭干，準確稱取0.5 g肝組織，加9倍生理鹽水制成10%的組織勻漿。用南京建成試劑盒測定肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSSl1.5軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CMP對小鼠體重的影響

記錄第一次灌胃之前和最后一次灌胃30 min之后，各組小鼠負重游泳前的體質(zhì)量，統(tǒng)計灌胃期間各組小鼠體質(zhì)量增量。結(jié)果見表1。

表1 茯苓多糖對小鼠體質(zhì)量的影響(n=10，±s)Table 1 The effect of CMP on body weight of mice(n=10，±s)

表1 茯苓多糖對小鼠體質(zhì)量的影響(n=10，±s)Table 1 The effect of CMP on body weight of mice(n=10，±s)

組別Group對照組Control紅景天組Rhodiola低劑量組CMP-L中劑量組CMP-M高劑量組CMP-H體質(zhì)量增量 (g)Body weight(g) 9.22±1.99 9.44±2.11 9.54±2.25 9.87±1.84 9.77±1.85

由表1可知，與空白對照組相比，CMP高劑量組、中劑量組、低劑量組和紅景天組小鼠的體質(zhì)量增量沒有顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 CMP對小鼠力竭游泳時間的影響

各組小鼠負重游泳致力竭，記錄并統(tǒng)計其負重力竭游泳時間。與空白對照組相比，紅景天組和3個CMP劑量組的小鼠負重力竭游泳時間明顯延長(P＜0.05)。結(jié)果見表2。

由表2可知，不同劑量組的CMP對小鼠負重力竭游泳時間具有不同程度的影響。低劑量組小鼠負重力竭游泳時間比空白對照組延長了51.01%(P＜0.05)，中劑量組小鼠負重力竭游泳時間比空白對照組延長了67.79%(P＜0.05);高劑量組小鼠負重力竭游泳時間比空白對照組延長了93.63%(P＜0.05)，具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。

表2 CMP對小鼠負重力竭游泳時間的影響(n=10，±s)Table 2 The effect of CMP on weight loaded-swimming time of mice(n=10，±s)

表2 CMP對小鼠負重力竭游泳時間的影響(n=10，±s)Table 2 The effect of CMP on weight loaded-swimming time of mice(n=10，±s)

注:與空白對照組比較，*P ＜0.05。Note:Compare with control，*P ＜ 0.05.

組別Group對照組Control紅景天組Rhodiola低劑量組CMP-L中劑量組CMP-M高劑量組CMP-H游泳時間(s)Swimming time(s) 945.5±136.6 1584.3±115.41* 1427.8±218.6* 1586.5±203.1* 1830.8±117.7*延長率(%)Increase(%)-67.56 51.01 67.79 93.63

表3 CMP對小鼠運動后血清尿素氮的影響(n=10，±s)Table 3 The effect of CMP on the levels of blood urea nitrogen of mice after exercise(n=10，±s)

表3 CMP對小鼠運動后血清尿素氮的影響(n=10，±s)Table 3 The effect of CMP on the levels of blood urea nitrogen of mice after exercise(n=10，±s)

注:與空白對照組比較，*P ＜0.05。Note:Compare with control，*P ＜ 0.05.

組別Group對照組Control紅景天組Rhodiola低劑量組CMP-L中劑量組CMP-M高劑量組CMP-H血清尿素氮含量(mg/L)Blood urea nitrogen(mg/L) 85.76±3.62 73.14±3.19* 83.06±2.15 65.82±2.55* 61.92±3.17*清除率Clearance(%)-14.72 3.15 23.25 27.80

2.3 CMP對小鼠運動后血清尿氮素的影響

各組小鼠負重游泳致力竭，休息15 min后摘眼球取血，測定并統(tǒng)計各組小鼠運動后血清中尿素氮的含量。結(jié)果見表3。

由表3可知，與空白對照組相比，紅景天組和CMP中劑量組、高劑量組的小鼠血清尿素氮含量明顯降低(P＜0.05)。相對于空白對照組，CMP中劑量組的血清尿氮素清除率為23.25%(P＜0.05)，CMP高劑量組的血清尿氮素清除率為27.80%(P＜0.05)，具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。

2.4 CMP對小鼠運動后血乳酸的影響

各組小鼠負重游泳致力竭，休息15 min后摘眼球取血，測定并統(tǒng)計各組小鼠運動后血清中乳酸的含量。結(jié)果見表4。

表4 CMP對小鼠運動后血乳酸的影響(n=10，±s)Table 4 The effect of CMP on the levels of blood lactic acid of mice after exercise(n=10，±s)

表4 CMP對小鼠運動后血乳酸的影響(n=10，±s)Table 4 The effect of CMP on the levels of blood lactic acid of mice after exercise(n=10，±s)

注:與空白對照組比較，*P ＜0.05。Note:Compare with control，*P ＜ 0.05.

組別Group對照組Control紅景天組Rhodiola低劑量組CMP-L中劑量組CMP-M高劑量組CMP-H血乳酸含量(mmol/L)blood lactic acid(mmol/L) 26.05±2.08 22.44±2.24* 23.68±2.66 18.69±1.21* 16.10±1.50*清除率Clearance(%)-13.86 9.10 28.25 38.20

由表4可知，與空白對照組相比，紅景天組和CMP中劑量組、高劑量組的小鼠血乳酸含量明顯降低(P＜0.05)。相對于空白對照組，CMP中劑量組的血乳酸清除率為28.25%(P＜0.05)，CMP高劑量組的血乳酸清除率為38.20%(P＜0.05)，具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。

表5 CMP對小鼠運動后肝組織中SOD的影響(n=10，±s)Table 5 The effect of CMP on the levels of SOD in liver of mice after exercise(n=10，±s)

表5 CMP對小鼠運動后肝組織中SOD的影響(n=10，±s)Table 5 The effect of CMP on the levels of SOD in liver of mice after exercise(n=10，±s)

注:與空白對照組比較，*P ＜0.05。Note:Compare with control，*P ＜ 0.05.

組別Group對照組Control紅景天組Rhodiola低劑量組CMP-L中劑量組CMP-M高劑量組CMP-H SOD(u/mgpro) 202.66±13.08 281.76±12.24* 244.26±15.66 311.63±11.21* 353.73±14.50*提高率Increase(%)-39.03 19.54 53.77 74.56

2.5 CMP對小鼠運動后肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)影響

各組小鼠負重游泳致力竭，休息15 min后脫臼處死，取其肝臟，測定并統(tǒng)計各組小鼠運動后肝組織中SOD的活性。結(jié)果見表5。

由表5可知，與空白對照組相比，紅景天組和CMP中劑量組、高劑量組的小鼠肝臟組織中SOD活性明顯升高(P＜0.05)。相對于空白對照組，CMP中劑量組的SOD活性提高率為53.77%(P＜0.05)，CMP高劑量組的 SOD活性提高率為74.56%(P＜0.05)，具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。

3 討論

疲勞是機體一系列復(fù)雜的生理生化變化過程，是機體在一定環(huán)境條件下，由于長時間或過于繁重緊張的體力或腦力勞動而引起的工作效率暫時降低的一種生理心理現(xiàn)象，一般的檢測指標是運動耐力和生化指標［6］。

疲勞最直接、最客觀的表現(xiàn)是運動耐力的下降，游泳是全身消耗性運動，劇烈的運動消耗大量的能量，所以力竭游泳時間是反映運動耐力的重要指標，常用于評價體力疲勞。本研究通過小鼠負重游泳實驗可知，與空白對照組相比，CMP低、中、高劑量組都可以可顯著提高小鼠的運動耐力(P＜0.05)，提示CMP具有一定的抗疲勞作用。

評價體力疲勞的生化指標中，血清尿氮素和血乳酸指標的改變具有代表性，試驗結(jié)果比較準確，是檢測體力疲勞常用的生化指標［7］。血清尿氮素含量的變化可以說明體內(nèi)含氮物質(zhì)的分解代謝情況，是評價機體在特殊條件下體力勞動負荷承受能力的一個較靈敏的指標。機體對負荷的適應(yīng)力越差，則血液中產(chǎn)生的尿素氮就越多;反之，則產(chǎn)生的尿素氮就越少。

本研究結(jié)果表明，與空白對照組相比，CMP中、高劑量組的小鼠血清尿素氮含量明顯降低(P＜0.05)，提示CMP可以減慢小鼠體內(nèi)含氮物質(zhì)分解速度，有效改善機體對運動負荷的壓力。長時間的運動會導(dǎo)致機體相對缺氧、糖酵解加快，進而產(chǎn)生大量的乳酸，使肌肉組織內(nèi)的pH值下降，最終導(dǎo)致疲勞，因此血乳酸水平也是反映機體疲勞程度的重要指標［8］。乳酸在肌肉中堆積越多，疲勞的程度越嚴重。本研究結(jié)果表明，與空白對照組相比，CMP中、高劑量組的小鼠血乳酸含量明顯降低(P＜0.05)，提示CMP可以抑制運動后乳酸的積累和生產(chǎn)，有利于減緩血乳酸的積累，從而減緩機體疲勞的發(fā)生，降低機體疲勞的程度。當(dāng)長時間運動訓(xùn)練時，體內(nèi)氧化作用會大大加強，產(chǎn)生大量自由基，導(dǎo)致肌肉和肝臟中脂質(zhì)過氧化物增多，引起細胞或組織損傷，也是機體疲勞的原因［9］。本研究結(jié)果表明，與空白對照組相比，CMP中、高劑量組的小鼠肝臟組織SOD活性明顯提高(P＜0.05)，提示CMP具有抗自由基氧化的功能，阻止脂質(zhì)過氧化，進而提高小鼠的運動能力。

1 Li YL(李燕凌)，Zhang ZX(張志旭)，Hu L(胡令).Antioxidant of polysaccharides from Poria coco.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2012，24:1126-1128.

2 Yan H，Xiao JZ，Yong L，et al.Novel biodegradable hydrogels based on pachyman and its derivatives for drug delivery.Int J Pharm，2009，37:89-98.

3 Lin Y，et al.Molecular mass and antitumor activities of sulfated derivatives of alpha-glucan from Poria cocos mycelia.Int J Biol Macromol，2004，34:289-294.

4 Ma L，et al.Anti-fatigue effects of salidroside in mice.J Med Col PLA，2008，23(2):88-93.

5 Jin FD，et al.Study on effect of jellyfish collagen hydrolysate on anti-fatigue and anti-oxidation.Food Hydrocolloids，2011，25:1350-1353.

6 Huang LZ，et al.Bioactivity-guided fractionation for anti-fatigue property of Acanthopanax senticosus．J Ethnopharmacol，2011，133:213-219.

7 You LJ，et al.In vitro antioxidant activity and in vivo anti-fatigue effect of loach(Misgurnus anguillicaudatus)peptides prepared by papain digestion.Food Chemistry，2011，124:188-194.

8 Wang J，et al.Anti-fatigue activity of the water-soluble polysaccharides isolated from Panax ginseng C.A.Meyer.J Ethnopharmacol，2010，130:421-423.

9 Tan W，et al.Anti-fatigue activity of polysaccharides extract from Radix Rehmanniae Preparata.Int J Biol Macromolecules，2012，50:59-62.