甲基京尼平差向異構(gòu)體的拆分與結(jié)構(gòu)確證

王美瑜，鄒茜茜，劉 珂，許 卉，范華英，車 鑫

煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院，煙臺(tái) 264005

梔子為茜草科植物梔子(Gardenia jaminoides Ellis)的干燥成熟果實(shí)。其性味苦，寒，歸心、肺、三焦經(jīng)［1］。具有保肝利膽［2］、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞［3］、抗抑郁［4］、抗炎［5］、抗腫瘤［6］、降血糖［7］、抗氧化、抗高血壓、抗血栓以及抗骨質(zhì)疏松［8］等作用。梔子果實(shí)的化學(xué)成分很多，主要包括藏紅花素類、環(huán)烯醚萜類、有機(jī)酸等［9］，其中環(huán)烯醚萜類的活性最高的成分為京尼平苷［10］。京尼平苷是一種單環(huán)環(huán)烯醚萜苷類化合物，無毒，易溶于水?！秱摗分杏涊d的梔子豉湯，主治“心煩不得眠，心中懊惱”，現(xiàn)代研究證實(shí)其中的京尼平苷具有明顯的抗抑郁作用［11］。但有文獻(xiàn)報(bào)道，大劑量應(yīng)用京尼平苷可導(dǎo)致明顯的肝、腎病理學(xué)改變，京尼平苷是梔子肝、腎毒性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。京尼平苷產(chǎn)生毒性的原因是其在腸道內(nèi)細(xì)菌的作用下水解成京尼平，京尼平與體內(nèi)氨基酸結(jié)合生成具有較強(qiáng)生物活性的梔子藍(lán)，梔子藍(lán)可能為其導(dǎo)致肝腎毒性的直接物質(zhì)基礎(chǔ)［12，13］。

為尋找化學(xué)和代謝穩(wěn)定性良好、生物利用度高、毒性較小的新型京尼平衍生物。本課題合成了新型京尼平衍生物:甲基京尼平，并發(fā)現(xiàn)甲基京尼平的肝毒性明顯小于京尼平苷。甲基京尼平是在京尼平苷的基礎(chǔ)上甲基化制備而得，在反應(yīng)的同時(shí)發(fā)現(xiàn)甲基京尼平為一對異構(gòu)體的混合物，同時(shí)含有R、S-甲基京尼平(圖1)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過制備型高效液相色譜同時(shí)分離得到R、S-甲基京尼平，為藥效的研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖1 R-甲基京尼平(A)及S-甲基京尼平(B)的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of R，S-methyl genipin

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20A高效液相色譜儀、島津SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器(日本島津);R205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海禾汽玻璃儀器有限公司);varian210制備型高效液相色譜(美國varian);島津UV-2550紫外光譜測定儀(日本島津);Bruker AV400 MHz核磁共振儀(以 TMS為內(nèi)標(biāo))(美國布魯克);Diamonsil C18反相液相色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm，中國迪馬公司)、Waters Bondapak C18色譜柱(19 mm ×200 mm，20 μm)。

1.2 試藥

京尼平苷(購自四川泰康有限公司，含量 ＞95%);甲醇(色譜純，Oceanpak)，無水甲醇(分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠);濃硫酸(分析純，煙臺(tái)市雙雙化工有限公司);石油醚(分析純，天津市化學(xué)試劑一廠);乙酸乙酯(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);氯仿(分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠);水(市售純凈水)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 甲基京尼平的合成

取1.0 g京尼平苷于50 mL圓底燒瓶中，量取1 mol/L硫酸-甲醇10.0 mL，65℃加熱回流4 h。用NaOH中和以后減壓蒸去溶劑，加水、氯仿(1∶2)萃取3次，氯仿層蒸干溶劑后，硅膠柱層析采用石油醚、乙酸乙酯梯度洗脫分離得到甲基京尼平，其1H NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致［14］，結(jié)果見表1。液相驗(yàn)證純度時(shí)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物為一對異構(gòu)體的混合物(見圖2)。

圖2 甲基京尼平HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of methyl genipin A:R-甲基京尼平;B:S-甲基京尼平A:R-methyl genipin;B:S-methyl genipin

2.2 (R)-甲基京尼平、(S)-甲基京尼平的拆分

取上述方法制備得到的甲基京尼平加甲醇制成30 mg/mL的溶液作為供試品溶液，經(jīng)制備型高效液相色譜分離，合并相同的餾分，50℃減壓蒸干，得到化合物A 80 mg、化合物B 15 mg。制備液相的色譜條件如下:流動(dòng)相為甲醇-水(15∶85)，流速為10.0 mL/min，檢測波長為238 nm，進(jìn)樣量2 mL，柱溫30℃。分析型液相驗(yàn)證條件如下:流動(dòng)相為乙腈-水(25∶75)，流速為 1.0 mL/min，檢測波長為 238nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量為20 μL。經(jīng)驗(yàn)證化合物A和化合物B的純度分別為98%、95%(見圖3)，可以用于結(jié)構(gòu)鑒定。

圖3 純化的R-甲基京尼平(A)及S-甲基京尼平(B)HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of purified R-methyl genipin(A)and S-methyl genipin(B)

3 結(jié)果與討論

3.1 (R)-甲基京尼平、(S)-甲基京尼平、甲基京尼平的結(jié)構(gòu)測定

以CDCl3為溶劑，在400 MHz的核磁下對化合物A和B進(jìn)行了氫譜、NOESY譜測試。

化合物A 黃色油狀固體，分析化合物A的1H NMR和NOESY譜數(shù)據(jù)，歸屬1H NMR信號(hào)(表1)，比較化合物A與甲基京尼平差向異構(gòu)體的混合物的1H NMR，發(fā)現(xiàn)大部分氫信號(hào)一致，說明為甲基京尼平的差向異構(gòu)體之一，結(jié)構(gòu)中的1位絕對構(gòu)型由NOESY決定，NOESY發(fā)現(xiàn)H-1位與H-5、H-9均不相關(guān)(見圖4)，證明化合物A為R-甲基京尼平。

化合物B 黃色油狀固體，分析化合物B的1H NMR和NOESY譜數(shù)據(jù)，歸屬1H NMR信號(hào)(表1)，比較化合物B與甲基京尼平差向異構(gòu)體混合物的1H NMR，發(fā)現(xiàn)氫信號(hào)有部分不完全一致，認(rèn)為可能是由于其在混合物中所占的比例小的緣故，但仍可以推測為甲基京尼平的差向異構(gòu)體之一，結(jié)構(gòu)中的1位絕對構(gòu)型由NOESY譜決定，NOESY發(fā)現(xiàn)H-1位與H-5、H-9均有相關(guān)(見圖4)，證明化合物B為S-甲基京尼平。

表1 R-甲基京尼平、S-甲基京尼平、甲基京尼平的1H NMR信號(hào)Table 1 1H NMR data of R-methyl genipin，S-methyl genipin and methyl genipin

圖4 R-甲基京尼平(A)與S-甲基京尼平(B)的NOESY圖譜Fig.4 NOESY spectra of R-methyl genipin(A)and S-methyl genipin(B)

3.2 討論

由于S-甲基京尼平的含量較低，約為R-甲基京尼平的1/6，因此在拆分甲基京尼平的過程中，R-甲基京尼平易得到，而S-甲基京尼平不易獲到純度較高的單體。實(shí)驗(yàn)過程中先后考察了甲醇-水28∶72、25∶75、20∶80、15∶85，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇-水為 15∶85 時(shí)效果最佳，能夠得到較好的分離。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)成功地合成了甲基京尼平，并且采用制備型高效液相色譜，成功的分離得到了R、S-甲基京尼平，并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了歸屬。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission(國家藥典委員會(huì)).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(中華人民共和國藥典).Beijing:China Medical Science Press，2010.

2 Takeuchi S，Goto T，Mikami K，et al.Genipin prevents fulminant hepatic failure resulting in reduction of lethality through the suppression of TNF-α production.Hepatol Res，2005，33:298-305.

3 Yamazaki M，Chiba K，Mohri T，et al.Cyclic GMP-dependent neurite outgrowth by genipin and nerve growth factor in PC12h cells.Euro J Pharmacol，2004，488:35-43.

4 Tian JS，Cui YL，Hu LM，et al.Antidepressant-like effect of genipin in mice.Neurosci Lett，2010，479:236-239.

5 Koo HJ，Lim KH，Jung HJ，et al.Anti-inflammatory evaluation of gardenia extract，geniposide and genipin.J Ethnopharmacol，2006，103:496-500.

6 Wang SW，Lai CY，Wang CJ.Inhibitory effect of geniposide on aflatoxin B1-induced DNA repair synthesis in primary cultured rat hepatocytes.Cancer Lett，1992，65:133-137.

7 Xie WL(謝文利)，Li HJ(李宏捷)，Jin YZ(晉玉章).Studies on the effects of geniposide in the lowering blood sugar of rat diabetic model.Acta Aeadee Med CPAF(武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào))，2008，17:580-581.

8 Ha H，Ho J，Shin S，et al.Effects of eucommiae cortex on osteoblast-like cell proliferation and osleoclast inhibition.Arch Pharm Res，2003，26:929-936.

9 Xu Y(徐燕)，Cao J(曹進(jìn))，Wang YM(王義明)，et al.Simultaneous determination of 3 kinds of components in Gardenia by high performance liquid chromatography under different UV-vis wave length.Acta Pharm Sin(藥學(xué)學(xué)報(bào))，2003，38:543-546.

10 Kitano A，Saika S，Yamanaka O，et al.Genipin suppression of fibrogenic behaviors of the alpha-TN4 lens epithelial cell line.J Cataract Refract Surg，2006，32:1727-1735.

11 Gao F(高芳).Experimental study on treating the depression with decoction of capejasmine and fermented soybean.Fuzhou:Fujian College of Traditional Chinese Medicine(福建中醫(yī)學(xué)院)，PhD.2007.

12 Yamano T，TsujimotoY，Noda T，et al.Hepatotoxicity of gardenia yellow color in rat.Toxicol Lett，1988，44:177-182.

13 Cheng L(成龍)，Yang HJ(楊洪軍)，Liang RX(梁日欣)，et al.Pharmacokinetics of geniposide and its metabolite in rats.China J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，2007，32:161-163.

14 Yu Q(余琴)，Zhao Q(趙慶)，Zou CH(鄒澄)，et al.Preparation of structure modifying intermediate of geniposide.J Yunnan Univ Tradit Chin Med(云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào))，2008，31(4):29-30.