響應(yīng)曲面優(yōu)化枇杷葉綠原酸超聲微波提取工藝

唐純翼，吳顯明

1吉首大學(xué)城鄉(xiāng)資源與規(guī)劃學(xué)院，張家界427000;2吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，吉首416000

枇杷葉，薔薇科植物枇杷［Eriobotrya japonica(Thunb．)Lindl．］的干燥葉，別名巴葉、蘆桔葉，傳統(tǒng)中藥，性微寒，味苦辛，歸肺、胃經(jīng)，具有清肺止咳，降逆止嘔等功效。藥理研究表明枇杷葉具有較好的抗炎和止咳作用，近年研究還發(fā)現(xiàn)，枇杷葉有抗腫瘤、抗病毒、降血糖、保肝利膽、清除氧自由基、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等作用［1］。

綠原酸具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗菌消炎、抗病毒、增高白血球、保肝利膽、降血壓、延緩衰老作用及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等［2，3］，廣泛用于食品保鮮劑、食品添加劑、植物生長激素及一些高級(jí)化妝品的添加劑等，是食品、藥品、化妝品等工業(yè)的重要原料［4］。

響應(yīng)面法(RSM)是采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對(duì)回歸方程進(jìn)行分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種用于開發(fā)、改進(jìn)、優(yōu)化的統(tǒng)計(jì)和數(shù)學(xué)方法。Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法是響應(yīng)面法的一種，它可以提供3到10個(gè)因素，進(jìn)行低、中、高三水平的的二階實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，評(píng)價(jià)因素和指標(biāo)間的非線性關(guān)系［5，6］。

綠原酸的提取方法有水提法、醇提法、微波提取法、超聲波提取法等，都是單一提取方法且提取率均偏低。本研究以枇杷葉原料，采用超聲波和微波協(xié)同技術(shù)提出綠原酸，應(yīng)用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法研究相關(guān)因素對(duì)提取率的影響，篩選出最佳的提取工藝參數(shù)，以期為枇杷葉中綠原酸的提取提供借鑒。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

枇杷葉－，2012年3月采自張家界(洗凈，40℃恒溫干燥至恒重，粉碎過80目篩);綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品－，中國藥品生物制品檢定所;無水乙醇為分析純;蒸餾水為自制。

1．2 儀器與設(shè)備

SK3200H型超聲波清洗器－，上海壘固儀器有限公司;SF8213型醫(yī)藥不銹鋼粉碎機(jī)－，上海科太粉碎設(shè)備廠;TDZ5-WS型臺(tái)式離心機(jī)－，賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋－，常州國華有限公司;UV-160A型紫外-可見分光光度計(jì)、AUY120型電子天平－，日本島津公司;改制格蘭仕微波爐－，格蘭仕電器實(shí)業(yè)公司。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

1．3．1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，無水乙醇溶解并定容至 1000 mL。分別吸取 0．0、1．0、2．0、3．0、5．0、6.0 mL，無水乙醇定容25 mL。用1 cm比色皿，無水乙醇為空白，在329nm處測定吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)、綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:y=0．0383x+0．123，相關(guān)系數(shù)R2=0．9991。

1．3．2 枇杷葉綠原酸提取及提取率計(jì)算

稱取樣品2．0 g于250 mL錐形瓶中，70%乙醇浸泡12 h，在50℃、200W條件下超聲30 min，再在400W條件下微波輻射回流5 min，將提取物冷卻、過濾，測定提取液吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算綠原酸含量，由下式計(jì)算提取率［7］。

綠原酸提取率/%=(C×n×V)/(m×106)×100

式中:C為通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的綠原酸質(zhì)量濃度(μg/mL);n為稀釋倍數(shù);V為配成溶液體積(mL);m為樣品的質(zhì)量(g)。

1．3．3 單因素試驗(yàn)

在料液比1∶15(g/mL)、超聲功率200 W、超聲溫度50℃、超聲時(shí)間30 min、微波功率400W、微波時(shí)間5 min等基本工藝條件下，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、微波功率、微波時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響。

1．3．4 響應(yīng)曲面法試驗(yàn)

選取4因素3水平，以綠原酸提取率為響應(yīng)值，運(yùn)用 Design Expert建立的中心組合試驗(yàn) Box-Benhnken設(shè)計(jì)方案進(jìn)行優(yōu)化。4因素為乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)、料液比(X2)、微波功率(X3)、微波時(shí)間(X4)，3 水平為低(-1)、中(0)、高(+1)。

2 結(jié)果與分析

2．1 單因素試驗(yàn)

2．1．1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)綠原酸提取率的影響

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of chlorogenic acid

圖1顯示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，綠原酸提取率逐漸升高，70%乙醇時(shí)最高，之后隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增大而降低。這是因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)過大時(shí)，乙醇分子間的結(jié)合力高于乙醇分子與綠原酸分子間的結(jié)合力，綠原酸溶出率反而下降，故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)70%。

2．1．2 超聲溫度對(duì)綠原酸提取率的影響

圖2 超聲溫度對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on extraction yield of chlorogenic acid

圖2顯示，溫度升高，綠原酸提取率上升，原因是溫度升高綠原酸溶解度增大。至50℃時(shí)達(dá)最大值，隨后溫度升高綠原酸的提取率開始下降，原因是綠原酸分子的鄰二酚羥基高溫時(shí)易被氧化，以及高溫時(shí)不利于形成超聲波微射流對(duì)細(xì)胞表面產(chǎn)生沖擊、剪切時(shí)所需要的高密度與強(qiáng)壓梯度氣泡，從而使綠原酸溶解度下降。因此，選擇50℃為適宜提取溫度。

2．1．3 料液比對(duì)綠原酸提取率的影響

圖3 料液比對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.3 Effect of sample-to-solvent ratio on the extraction yield of chlorogenic acid

圖3顯示，料液比的降低，綠原酸提取率上升，原因是料液比降低加大了提取過程的傳質(zhì)推動(dòng)力。至1∶15(g/mL)時(shí)，綠原酸提取率達(dá)到了最大，之后料液比降低提取率反而下降，原因是料液比過小使溶劑升高到相同的溫度所需要的時(shí)間變長，從而降低了提取率。

2．1．4 微波功率對(duì)綠原酸提取率的影響

圖4 微波功率對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.4 Effect ofmicrowave power on the extraction yield of chlorogenic acid

圖4顯示，微波功率增大，綠原酸提取率隨之增大，原因是功率增大體系溫度升高，綠原酸溶解度增大。至400 W時(shí)，提取率達(dá)到最大，之后綠原酸提取率隨功率加大反而下降，原因是微波功率增大導(dǎo)致溫度升高，綠原酸分子的鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)被氧化分解而使提溶解度下降?？紤]到離子溶液吸收微波的能力較強(qiáng)，小功率即可將樣品中的綠原酸萃取完全，功率過大使綠原酸降解以及成本問題，選擇提取功率400W。

2．1．5 微波輻射時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響

圖5 微波輻射時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.5 Effect ofmicrowave irradiation time on the extraction yield ofchlorogenic acid

圖5顯示，提取率隨微波輻射時(shí)間延長而升高，原因是提取液溫度隨微波輻射時(shí)間延長而升高導(dǎo)致綠原酸溶解度增加。至5 min達(dá)到最大值，之后提取率隨微波輻射時(shí)間延長反而下降，原因是過高的溫度使提取液爆沸而與樣品的有效接觸時(shí)間減少，故輻射時(shí)間取5 min較適宜。

2．2 響應(yīng)面分析

2．2．1 中心組合試驗(yàn)Box-Behnken方案設(shè)計(jì)的因素及水平編碼

表1 中心組合試驗(yàn)Box-Behnken方案設(shè)計(jì)的因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnkencenter-composite experimental design

2．2．2 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-Behnken design matrix and extraction vieldofchlorogenic acid

3-1 +1 0 0 5．79 5．84 4+1 +1 0 0 5．83 5．84 5 0 0-1 -1 5．85 5．81 6+1 -1 5．81 5．82 7 0 0-1 +1 5．84 5．87 0 0+1 +1 5．48 5．40 9-1 0 0 -1 5．77 5．66 10 +1 0 0 -1 5．53 5．46 11 -1 0 0 +1 5．43 5．54 12 +1 0 0 +1 5．84 5．84 13 0 -1 -1 0 5．54 5．51 14 0 +1 -1 0 5．77 5．69 15 0 -1 +1 0 5．75 5．85 16 0 +1 +1 0 5．69 5．52 17 -1 0 -1 0 5．48 5．49 18 +1 0 -1 0 5．43 5．52 19 -1 0 +1 0 5．67 5．66 20 +1 0 +1 0 5．47 5．54 21 0 -1 0 -1 5．44 5．48 22 0 +1 0 -1 5．85 5．84 23 0 -1 0 +1 5．62 5．64 24 0 +1 0 +1 5．86 5．84 25 0 0 0 0 5．46 5．55 26 0 0 0 0 5．33 5．38 27 0 0 0 0 5．74 5．61 28 0 0 0 0 5．64 5．66 8 0 0 29 0 0 0 0 5．41 5．53

2．2．3 二次回歸模型建立

利用Design Expert7．0軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得枇杷葉綠原酸提取率(Y)對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)、料液比(X2)、微波功率(X3)、微波時(shí)間(X4)的二次多項(xiàng)回歸模型方程為:

Y=5．84+0．061X1+0．04 X2+0．12X3+0.035X4+0．11 X1X2+0．12 X1X3+0．12X1X4+0.12 X2X3-0．013 X2X4+0．02X3X4-0．11X21-0.11X32-0．15X23-0．09 X24，相關(guān)系數(shù) R2=0．9450。

2．2．4 顯著性檢驗(yàn)

模型顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3，回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表4。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for fitted quadratic polynomialmodel

表3顯示，該模型方程具有極顯著性(P＜0.01)，失擬差不顯著(P＞0．05)，表明無失擬因素存在，對(duì)模型有利，可用于枇杷葉中綠原酸提取率的預(yù)測與分析。

表4 回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 4 Testing results of significancefor regression coefficient

表4顯示，模型一次項(xiàng)X1、X2、X4對(duì)Y影響顯著，X3對(duì) Y 影響極顯著;二次項(xiàng)影響顯著不具顯著性影響;交互項(xiàng) X1X2、X1X3、X1X4、X2X3影響顯著，X2X4、X3X4不具顯著性影響。

2．2．5 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化條件的確定

根據(jù)回歸分析結(jié)果作出 X1、X2、X3、X4及其交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響(圖6～11)。響應(yīng)曲面平面投影的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。

圖6 微波功率和料液比對(duì)提取率的影響Fig.6 Effects of microwave power and solidsample-to-solvent ratio on the extraction yield

圖7 微波時(shí)間和微波功率對(duì)提取率的影響Fig.7 Effects ofmicrowave power andmicrowavetime on the extraction yield

圖8 料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響Fig.8 Effects of ethanol concentration and sample-to-solvent ratio on the extraction yield

圖9 微波時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響Fig.9 Effects of ethanol concentration andmicrowavetime on the extraction yield

圖10 微波功率和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響Fig.10 Effects ofmicrowave power and ethanol concentration on the extraction yield

圖11 微波時(shí)間和料液比對(duì)提取率的影響Fig.11 Effects ofmicrowavetime and sample-to-solvent ratio on the extraction yield

由圖6～11可知，4因素間均有較明顯的交互作用。依據(jù)軟件給出的工藝條件，考慮成本、實(shí)際操作需要等因素后修訂的最佳工藝條件為:微波功率400 W、溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶15(g/mL)、輻射時(shí)間5 min。此條件下實(shí)驗(yàn)得到平均提取率為 5．85%，平均回收率為 97．4%，RSD為4.04%，比理論平均提取率5．65%高0．20%，所以基于響應(yīng)曲面法所得的優(yōu)化提取工藝數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

RSM法優(yōu)化后的枇杷葉中綠原酸超聲波微波協(xié)同提取最佳工藝為:枇杷葉粒度80目，預(yù)浸泡12 h，料液比1∶15(g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、50 ℃超聲30 min、微波功率400 W、微波時(shí)間5 min。本試驗(yàn)條件下枇杷葉綠原酸提取率達(dá)到5．84 g/mg。枇杷葉中其它活性成分如黃酮類物質(zhì)對(duì)于綠原酸提取是否干擾，以及梯次提出枇杷葉中主要活性成分，還有待進(jìn)一步研究。

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