微波輻射合成小檗紅堿的工藝研究

劉麗賢，袁 曉，高 英，周東斌，李衛(wèi)民

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州510006;2廣州牌牌生物科技有限公司，廣州510000;3廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥中心，廣州510006

小檗堿(Berberine，BBR)與小檗紅堿為異喹啉生物堿，均具有抗微生物、抗腫瘤、降壓、抗心律等作用［1，2］。此外，BBR 還具有降糖、治療阿爾茨海默病等多種藥理活性［1］，但因溶解性差及生物利用度低，制約其臨床應(yīng)用。BBR結(jié)構(gòu)中不存在制備前藥的“抓手”，如羥基(-OH)、羧基(-COOH)等基團(tuán)，而高溫下小檗堿(C9-CH3)易脫甲基生成小檗紅堿(C9-OH)。為此，小檗堿C-9位的修飾，大部分以小檗紅堿為中間體進(jìn)一步衍生，其衍生物具有抗腫瘤，抗 HIV 等多種活性［3，4］。

目前，小檗紅堿傳統(tǒng)合成方法是真空熱解法。Jwasa K［3］將 BBR 在真空 190 °C 加熱 15 min，粗品用乙醇/甲醇重結(jié)晶，產(chǎn)率69%;而 Hardik S［4］等，則反應(yīng)1～2 h，粗品用氯仿/甲醇9∶1硅膠柱層析，產(chǎn)率90%。本課題組對(duì)上述反應(yīng)方法進(jìn)行重現(xiàn)，未經(jīng)純化，產(chǎn)率約為84%。

其次也有2篇微波法合成的報(bào)道。2002年，Das［5］等首次提出微波合成法，以氧化鋁浴中微波反應(yīng)5 min，收率98%。2010年，張明曉［6］等則直接將BBR放入微波爐中600W反應(yīng)5 min。本課題組通過重現(xiàn)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，按方法［6］即使反應(yīng)1 h，BBR也基本不發(fā)生轉(zhuǎn)化;而方法［5］的重現(xiàn)結(jié)果則是BBR受熱十分不均，往往只有局部發(fā)生轉(zhuǎn)化，或局部反應(yīng)過劇而碳化，未能達(dá)到98%的收率。

由此可見，現(xiàn)時(shí)的微波合成法雖比真空熱解法節(jié)能省時(shí)，但兩種方法均存在受熱不均、產(chǎn)物純度低，產(chǎn)率低的問題。為此，本課題組創(chuàng)新選擇高沸點(diǎn)穩(wěn)定的極性介質(zhì)DMF為溶劑，采用微波法合成小檗紅堿，具有受熱均勻，反應(yīng)時(shí)間短，產(chǎn)物純度、產(chǎn)率高，純化方法簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1．1 儀器與試劑

微電腦微波化學(xué)反應(yīng)器WBFY-201(800W)，有機(jī)合成裝置，隔膜真空泵YH-700，X-5顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀，低溫冷卻循環(huán)泵DLSB-5/25(均購(gòu)于鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);HITACHI高效液相色譜儀(含HITACHI 1110泵，1410紫外檢測(cè)器，1210自動(dòng)進(jìn)樣器);UV-1601紫外可見分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司);Bio-Rad Merlin紅外譜儀;Agilent 1100 LC/MSD系統(tǒng);AVANCE-300超導(dǎo)核磁共振儀(德國(guó)BRUKER公司);分離純化系統(tǒng)Dr Flash-S(江蘇利穗科技);PiPo-02大孔樹脂(廣州牌牌生物科技有限公司);鹽酸小檗堿(BBR，96%);小檗紅堿對(duì)照品(自制，≥98%);N，N-二甲基甲酰胺(DMF，天津市富宇精細(xì)化工有限公司);其他試劑均為分析純。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 反應(yīng)原理

1．2．2 實(shí)驗(yàn)步驟

在圓底燒瓶中加入一定量料液比為1∶25(g∶mL)的BBR和DMF，數(shù)顆沸石，回流冷凝，在400 W 微波輻射下，反應(yīng)15 min。取出反應(yīng)瓶，趁熱加入1．5倍水稀釋冷卻，冷藏過夜，使析晶完全，抽濾，干燥，得紅色針晶，收率約72%;濾液另以PiPo-02大孔樹脂柱分離，依次用 40%、45%、50%、55%、60%、65%及70%甲醇洗脫，收集70%甲醇洗脫部位，濃縮，得紅色針晶，收率約21%;產(chǎn)品總收率約93%，純度≥98%。

1．2．3 單因素實(shí)驗(yàn)

1．2．3．1 反應(yīng)功率的考察

在100 mL圓底燒瓶中加入數(shù)顆沸石，小檗堿100mg(0．27mmol)，DMF 5mL，即料液比為1∶50(g∶mL)，分別在 240、400、640、800 W 微波輻射下，回流冷凝15 min，反應(yīng)重復(fù)3 次，按“1．2．6”項(xiàng)下計(jì)算產(chǎn)量及產(chǎn)率，取平均值。

1．2．3．2 料液比的考察

在250 mL圓底燒瓶中加入數(shù)顆沸石，小檗堿1 g(2．69 mmol)，分別加入 DMF 5、10、15、20、25、30、50 mL，400W 微波輻射下(即“1．2．3．1”項(xiàng)下的最佳反應(yīng)功率)，回流冷凝15 min，反應(yīng)重復(fù)3次，按“1．2．6”項(xiàng)下計(jì)算產(chǎn)量及產(chǎn)率，取平均值。

1．2．3．3 反應(yīng)時(shí)間的考察

在250 mL圓底燒瓶中加入數(shù)顆沸石，小檗堿1 g(2．69 mmol)，DMF25 mL，即“1．2．3．2”項(xiàng)下的最佳料液比1∶25(g∶mL)，400W 微波輻射下，回流冷凝，分別反應(yīng) 5、10、15、20、25、30 min，反應(yīng)重復(fù) 3次，按“1．2．6”項(xiàng)下計(jì)算產(chǎn)量及產(chǎn)率，取平均值。

1．2．4 HPLC分析條件及方法學(xué)考察

1．2．4．1 色譜條件

YMC-Pack ODS-AQ色譜柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈-0．2%甲酸水溶液(25∶75);柱溫:30°C;流速:1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):265 nm。在此條件下，小檗堿與小檗紅堿的色譜峰可達(dá)基線分離，分離度大于1．5。對(duì)照品、反應(yīng)物HPLC色譜圖見圖1。

1．2．4．2 對(duì)照品的制備

分別精密稱取小檗堿及小檗紅堿對(duì)照品25．0 mg置于200 mL量瓶中，以甲醇定容，配成濃度為0．125 μg/μL 的對(duì)照品液。

1．2．4．3 供試品的制備

①100 mg BBR反應(yīng)液:往反應(yīng)液加入適量甲醇，超聲溶解，補(bǔ)加甲醇定容至20 mL，搖勻，吸取5 mL轉(zhuǎn)移至200 mL量瓶定容，搖勻，即得。②1 g BBR反應(yīng)液:往反應(yīng)液加入適量甲醇，超聲溶解，補(bǔ)加甲醇定容至200 mL，搖勻，吸取5 mL轉(zhuǎn)移至200 mL量瓶定容，搖勻，即得。

1．2．4．4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

吸取小檗紅堿對(duì)照品 2、4、6、8、10 μL 進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線。

1．2．4．5 精密度試驗(yàn)

取小檗紅堿對(duì)照品，進(jìn)樣6μL，連續(xù)6次，測(cè)定小檗堿與小檗紅堿峰面積，計(jì)算RSD。

1．2．4．6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取檗紅堿對(duì)照品，在 0、2、4、8、16、24、48 h，分別進(jìn)樣6μL，測(cè)定小檗紅堿峰面積，計(jì)算RSD。

1．2．4．7 重復(fù)性試驗(yàn)

投料小檗堿 1 g，按“1．2．2”項(xiàng)下方法反應(yīng)及“1．2．4．3”項(xiàng)下方法制備供試品6 份，進(jìn)樣6 μL，測(cè)定峰面積計(jì)算小檗紅堿含量，計(jì)算RSD。

1．2．4．8 樣品含量測(cè)定

反應(yīng)液按“1．2．4．3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣6μL。按標(biāo)準(zhǔn)曲線法以峰面積計(jì)算小檗紅堿的含量。

1．2．5 結(jié)構(gòu)鑒定

對(duì)純化產(chǎn)品采用 UV、IR 、ESI-MS、1H NMR、13C NMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

1．2．6 產(chǎn)率的計(jì)算

產(chǎn)物產(chǎn)率y=產(chǎn)品實(shí)際質(zhì)量/產(chǎn)品理論質(zhì)量×100%

式中:產(chǎn)品實(shí)際質(zhì)量按“1．2．4．8”項(xiàng)下方法測(cè)定;產(chǎn)品理論質(zhì)量=(W×96% ×M1)/M2，W為小檗堿投料量，M1、M2分別為小檗紅堿、小檗堿的摩爾質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2．1 單因素實(shí)驗(yàn)

2．1．1 輻射功率對(duì)產(chǎn)率的影響

由表1可知，隨著微波功率的增大，產(chǎn)率逐漸提高，增到400 W達(dá)最大，后產(chǎn)率逐漸下降，故選用400 W功率輻射。

表1 微波輻射功率對(duì)產(chǎn)率的影響Table 1 Effect ofmicrowave power on yield of berberrubine

2．1．2 料液比對(duì)產(chǎn)率的影響

由表2可知，隨著DMF溶劑量的增大，產(chǎn)率逐漸提高，增到 BBR∶DMF=1∶25(g∶mL)達(dá)最大，后產(chǎn)率基本平穩(wěn)，這是因?yàn)锽BR在該比例的熱DMF中可完全溶解，故選用料液比1∶25(g∶mL)反應(yīng)。

2．1．3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)率的影響

由表3可知，隨著微波輻射時(shí)間的增加，產(chǎn)率逐漸提高，輻射15 min時(shí)產(chǎn)率達(dá)最大，而后產(chǎn)率趨于穩(wěn)定。這是由于反應(yīng)已基本達(dá)到平衡所致，故選用輻射15 min為宜。

表2 料液比對(duì)產(chǎn)率的影響Table 2 Effect of the solid-liquid ratio on yield of berberrubine

表3 微波輻射時(shí)間對(duì)產(chǎn)率的影響Table 3 Effectofmicrowave radiation time on yield ofberberrubine

2．2 與真空熱解法的比較

按文獻(xiàn)［4］操作，并考察了不同的反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)率的影響，見表4。由表4可見，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為1 h時(shí)，基本穩(wěn)定，最高產(chǎn)率為83．9%，而微波法最高產(chǎn)率是98．4%，反應(yīng)時(shí)間為15 min，與真空熱解法相比，微波法產(chǎn)率提高近15%，反應(yīng)時(shí)間縮短近4倍。

表4 真空熱解時(shí)間對(duì)產(chǎn)率的影響Table 4 Effect of vacuum pyrolysis time on yield of berberrubine

2．3 HPLC分析及方法學(xué)考察結(jié)果

2．3．1 對(duì)照品及反應(yīng)物的HPLC圖

圖1 小檗堿(A)、自制小檗紅堿對(duì)照品(B)及反應(yīng)物(C)的 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of berberine standard(A)，internal berberrubine standard(B)and the crude reaction product(C)

2．3．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

小檗紅堿回歸方程:y=3887678．8x-21327．3，r=0．9999，線性范圍為0．253 μg～1．254 μg。

2．3．3 精密度試驗(yàn)

以峰面積計(jì)算，小檗紅堿RSD為0．68%，表明精密性良好。

2．3．4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

以峰面積計(jì)算，小檗紅堿的 RSD為2．44%，表明它們?cè)?8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2．3．5 重復(fù)性試驗(yàn)

含量計(jì)算小檗紅堿平均 RSD分別為1．40%，表明重現(xiàn)性好。

2．4 結(jié)構(gòu)表征

小檗紅堿 紅色針晶(MeOH);mp．280．3 ～281．5℃;UV(MeOH)λmax232，271，351，440 nm;IR(KBr)νmax3408(s，-OH)，1250 cm–1(vs，C-O);ESIMS m/z 322．2 ［M-Cl］+(calcd for C19H16NO4，322.2);1H NMR(CDCl3，300 MHz)δ:7．35(1H，s，H-1)，6．76(1H，s，H-4)，3．04(1H，t，J=5．8 Hz，H-5)，4．53(1H，t，J=5．8 Hz，H-6)，9．20(1H，s，H-8)，6．83(1H，d，J=9．1 Hz，H-11)，7．46(1H，d，J=9．1 Hz，H-12)，7．97(1H，s，H-13)，5．95(1H，s，H-15)，3．81(1H，s，H-16);13C NMR(CDCl3，75 MHz)δ:106．27(C-1)，121．81(C-1a)，151．42(C-2)，149．97(C-3)，109．14(C-4)，131．16(C-4a)，57．04(C-6)，143．72(C-8)，134．21(C-8a)，147.84(C-9)，147．84(C-10)，120．21(C-11)，123．21(C-12)，131．16(C-12a)，124．22(C-13)，136．23(C-14)，103．68(C-15)，55．94(C-16);與文獻(xiàn)［5，7］基本一致。

3 討論

小檗紅堿的合成一直以真空熱解法為主，由于真空熱解法，是固體直接反應(yīng)，易受熱不均，產(chǎn)物純度較低，重現(xiàn)試驗(yàn)收率80%左右。而應(yīng)用微波合成法的研究報(bào)道僅有兩篇［5，6］。本課題組對(duì)微波法的兩篇文獻(xiàn)也進(jìn)行了重現(xiàn)試驗(yàn)，按文獻(xiàn)［6］操作，BBR直接微波5 min后，根本沒發(fā)生轉(zhuǎn)化，即使延長(zhǎng)時(shí)間也不能順利轉(zhuǎn)化;按文獻(xiàn)［5］，加入氧化鋁做熱傳導(dǎo)介質(zhì)后，反應(yīng)5 min也只有極少量的BBR發(fā)生轉(zhuǎn)化;延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間至10 min，局部BBR發(fā)生轉(zhuǎn)化;而反應(yīng)15 min則有碳化現(xiàn)象，存在很明顯的受熱不均的問題。

由于BBR轉(zhuǎn)化小檗紅堿的臨界溫度在160℃左右，而微波輻射在極性介質(zhì)中效率高，為此本課題組選用高沸點(diǎn)穩(wěn)定的極性溶劑DMF作為反應(yīng)介質(zhì)，進(jìn)行輻射反應(yīng)。本課題組也曾嘗試以低成本的水作為溶劑，但發(fā)現(xiàn)以水為介質(zhì)并不能達(dá)到熱解溫度，BBR不轉(zhuǎn)化。另外，也嘗試了以DMSO為溶劑，但反應(yīng)液產(chǎn)物復(fù)雜，可能因DMSO高溫下易分解所致。

4 結(jié)論

本文首次以DMF為反應(yīng)介質(zhì)微波合成小檗紅堿，較系統(tǒng)地考察了反應(yīng)功率、反應(yīng)時(shí)間、料液比三個(gè)影響因素，并與傳統(tǒng)的真空熱解法進(jìn)行了比較，相對(duì)于真空熱解法而言，微波法具有快速、節(jié)能、產(chǎn)率高的優(yōu)點(diǎn)，為制備小檗紅堿提供了一種新的合成途徑。

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