雙波長(zhǎng)薄層掃描法測(cè)定不同來源枸杞子中甜菜堿的含量

譚 亮，冀 恬，曹靜亞，胡風(fēng)祖

中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧810008

枸杞子(Fructus Lycii)為茄科植物寧夏枸杞(Lycium barbarum L．)的干燥成熟果實(shí)。夏、秋二季果實(shí)呈紅色時(shí)采收，熱風(fēng)烘干，除去果梗?；蛄乐疗ぐ櫤螅瑫窀?，除去果梗［1］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，枸杞子有抗衰老、降血糖、降血脂、內(nèi)分泌激素調(diào)節(jié)等多方面藥理作用［2-4］。近年來，有關(guān)枸杞子中多糖、甜菜堿、總黃酮、原花青素、β-胡蘿卜素、東莨菪內(nèi)酯等成分的含量測(cè)定屢有文獻(xiàn)報(bào)道［5-8］。其中，甜菜堿是枸杞果、葉、柄中主要生物堿之一，在體內(nèi)起甲基供體作用，是枸杞中對(duì)脂質(zhì)代謝或抗脂肪肝作用的主要活性物質(zhì)［9］。目前甜菜堿的檢測(cè)方法主要有薄層掃描法［1］、高效液相色譜法［10］、比色法［11］等。《中國(guó)藥典》2010年版一部中，規(guī)定枸杞子中甜菜堿的含量測(cè)定采用薄層掃描法。但按藥典方法操作并不能得到滿意的結(jié)果，于是我們以藥典方法為基礎(chǔ)，對(duì)其中部分操作做出了改進(jìn)，建立了TLCS法測(cè)定枸杞子中甜菜堿的含量，并對(duì)枸杞子主產(chǎn)地以及周邊省20批枸杞子進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可為枸杞子質(zhì)量控制提供了一定參考，為枸杞資源的研究與開發(fā)利用提供了科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料、試劑與儀器

枸杞子:自不同產(chǎn)地收集20批枸杞子，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所分析測(cè)試中心胡風(fēng)祖教授鑒定確認(rèn)為正品。樣品預(yù)處理:將收集的枸杞子陰干，裝入密封袋中密封，置干燥器中保存。

甜菜堿對(duì)照品(批號(hào):894-200202，中國(guó)藥品生物制品檢定所);甲醇、丙酮、無水乙醇、甲酸(天津市百世化工有限公司);鹽酸(甘肅白銀瑞斯物資貿(mào)易有限公司);雷氏鹽、碘化鉍鉀(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);活性炭(常州碧海環(huán)保技術(shù)有限公司)，以上化學(xué)試劑均為分析純。水為一級(jí)超純水。

CS-9000薄層掃描儀(日本島津公司);ASE 350快速溶劑萃取儀(賽默飛世爾科技戴安公司);PHS-3C型pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);AG 135電子天平(METTLER TOLEDO);RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);G1號(hào)垂熔砂芯漏斗(上海閎達(dá)玻璃儀器有限公司);薄層層析硅膠G板(青島海洋化工廠分廠);CN61M/290181毛細(xì)管(北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司第一分公司);101-3型烘箱(北京科偉儀器有限公司)。

1．2 方法

1．2．1 對(duì)照品溶液的制備

取甜菜堿對(duì)照品適量，精密稱定，加鹽酸甲醇溶液(0．5→100)制成每1 mL含4 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

1．2．2 供試品溶液的制備

使用美國(guó)戴安公司ASE 350快速溶劑萃取儀來提取枸杞子中的甜菜堿。取本品剪碎，取約2 g，精密稱定，與硅藻土拌勻后填裝入儀器配備的34 mL不銹鋼萃取池中。在80°C條件下用80%甲醇水溶液靜置提取15 min，循環(huán)提取1次。將提取液濃縮至10 mL，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1，加入活性炭l g，加熱煮沸，放冷，濾過，用水15mL分次洗滌，合并洗液與濾液，加入新配制的2．5%雷氏鹽溶液20 mL，攪勻，10°C以下放置3 h。用G1垂熔漏斗濾過，沉淀用少量冰水洗滌，抽干，殘?jiān)颖芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

1．2．3 薄層層析與掃描條件

照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液5μL，分別交叉點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以丙酮-無水乙醇-甲酸(10∶6∶3)為展開劑，預(yù)飽和30 min，展開，取出，揮干溶劑，立即噴以新配制的改良碘化鉍鉀試液，置105°C烘箱中加熱20 min至斑點(diǎn)清晰。照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)進(jìn)行掃描，在350 nm ～700 nm范圍內(nèi)作全波長(zhǎng)掃描，確定檢測(cè)波長(zhǎng)λS=530 nm，參比波長(zhǎng)λR=625 nm，測(cè)量供試品與對(duì)照品的吸光度積分值進(jìn)行計(jì)算。按上述條件所得結(jié)果見圖1。

圖1 枸杞子的薄層色譜圖Fig.1 Thin-layer chromatogram of F．Lycii

1．2．4 線性關(guān)系的考察

精密吸取對(duì)照品溶液(3．84 mg/mL)1、2、4、6、8、10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開，顯色，測(cè)定其峰面積值，結(jié)果依次為 1196．15、2389．30、4864．59、7084．89、9479．18、12215．48。以峰面積為縱坐標(biāo)，點(diǎn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y=314．76 X-49．90(r=0．9995)。結(jié)果表明甜菜堿點(diǎn)樣量在3．84 ～38．40μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1．2．5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一枸杞子藥材(紅果枸杞，青海德令哈)6份，精密稱定，分別按“1．2．2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。點(diǎn)樣5μL，展開，顯色至斑點(diǎn)清晰，測(cè)定其峰面積值。結(jié)果甜菜堿平均含量為0．48%，RSD為2.64%。結(jié)果表明該測(cè)定方法重復(fù)性良好。

1．2．6 精密度試驗(yàn)

1．2．6．1 同板精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液(紅果枸杞，青海德令哈)5μL，在同一硅膠G薄層板上分別點(diǎn)樣6次，展開，顯色至斑點(diǎn)清晰，測(cè)定其峰面積值。測(cè)得峰面積值的平均值為3009．75，RSD為1．89%。結(jié)果表明該測(cè)定方法同板精密度良好。

1．2．6．2 異板精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液(紅果枸杞，青海德令哈)5μL，在不同的6塊硅膠G薄層板上分別點(diǎn)樣，展開，顯色至斑點(diǎn)清晰，測(cè)定其峰面積值。測(cè)得樣品中甜菜堿平均含量為0．50%，RSD為3．55%。結(jié)果表明該測(cè)定方法異板精密度良好。

1．2．7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液(紅果枸杞，青海德令哈)5μL，點(diǎn)樣，展開，顯色至斑點(diǎn)清晰，每隔30 min測(cè)定其峰面積值1次，共測(cè)定7次。測(cè)得峰面積值的平均值為3027．34，RSD為2．78%。結(jié)果表明供試品溶液在3 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1．2．8 加樣回收率試驗(yàn)

采用加樣回收法，取已知含量的枸杞子樣品(紅果枸杞，青海德令哈，含量為0．48%)粉末6份，每份1．0 g，精密稱定，按低、中、高濃度分別精密加入甜菜堿對(duì)照品溶液。按“1．2．2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按含量測(cè)定方法計(jì)算甜菜堿的回收率。測(cè)定平均回收率為98．3%，RSD為2．55%(n=9)。

1．2．9 樣品的含量測(cè)定

分別稱取所收集的不同來源的枸杞子適量，精密稱定，按“1．2．2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果見表1～3。

表1 不同產(chǎn)地紅果枸杞子樣品中甜菜堿的含量測(cè)定結(jié)果(n=3)Table 1 Determination results of betaine contents in F．Lycii samples from different origins(n=3)

表2 同產(chǎn)地枸杞子不同種樣品中甜菜堿的含量測(cè)定結(jié)果(n=3)Table 2 Determination results of betaine contents of different species from the same origin(n=3)

表3 同產(chǎn)地枸杞子不同野生和栽培樣品中甜菜堿的含量測(cè)定結(jié)果(n=3)Table 3 Determination results of betaine contents of differentwild and cultivation samples from the same origin(n=3)

2 結(jié)果與分析

2．1 樣品的前處理和提取

2．1．1 在線凈化過程

ASE是多組分高效萃取技術(shù)，在萃取過程中一些干擾物質(zhì)有時(shí)會(huì)被一起萃取出來，這些共萃取物可能會(huì)干擾樣品的分析。在供試品制備中若直接加80%甲醇水溶液提取，經(jīng)點(diǎn)樣，展開，顯色后發(fā)現(xiàn):斑點(diǎn)很多，尤其是有些斑點(diǎn)與甜菜堿斑點(diǎn)出現(xiàn)在同一位置，無法分離，勢(shì)必對(duì)分析造成一定的干擾。故在用80%甲醇水溶液提取前先加二氯甲烷，以除去大部分的脂溶性成分，減免干擾斑點(diǎn)的出現(xiàn)，使甜菜堿與雜質(zhì)斑點(diǎn)分離。

2．1．2 ASE 提取條件的選擇

(1)提取溶劑:考察了乙醇、70%，80%，90%甲醇水溶液;(2)提取溫度:考察了60、70、80、90 °C;(3)提取靜置時(shí)間:考察了10、15、20、30 min;(4)提取循環(huán)次數(shù):考察了1、2、3、4次。結(jié)果表明在80°C下用80%甲醇水溶液靜置提取15 min，循環(huán)提取1次時(shí)提取效率最高。

2．2 薄層層析與掃描條件的改進(jìn)

在實(shí)際操作過程中發(fā)現(xiàn)完全按藥典方法操作測(cè)定甜菜堿并不能得到滿意的結(jié)果，于是以藥典方法為基礎(chǔ)，對(duì)其中部分操作做出了改進(jìn):(1)藥典法采用加熱回流1 h，中間有多次的轉(zhuǎn)移、洗滌等操作，勢(shì)必造成提取成分的損失，回收率不高。本研究使用美國(guó)戴安公司ASE 350快速溶劑萃取儀來提取枸杞子中的甜菜堿，減少了提取過程中的損失，而且該技術(shù)是在高壓(1000 psi)條件下進(jìn)行，大大提高了提取效率;(2)藥典中所用展開劑為丙酮-無水乙醇-鹽酸(10∶6∶1)，但在展開過程中發(fā)現(xiàn)展開效果并不佳，前沿不平，呈鋸齒狀分裂。本研究采用展開劑丙酮-無水乙醇-甲酸(10∶6∶3)，結(jié)果展開效果明顯有所改善，且Rf=0．47;(3)藥典中顯色后需放置1～3 h至斑點(diǎn)清晰，而在實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)無論放置多長(zhǎng)時(shí)間，顯色斑點(diǎn)都不是很清晰，并且本人認(rèn)為顯色時(shí)間過長(zhǎng)。本研究在顯色后置105°C烘箱中加熱20 min至斑點(diǎn)清晰，極大地縮短了顯色時(shí)間且顯色效果不錯(cuò);(4)藥典中薄層掃描條件是檢測(cè)波長(zhǎng)λS=515 nm，參比波長(zhǎng)λR=590 nm。實(shí)際操作中在350 nm～700 nm范圍內(nèi)作全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)最佳檢測(cè)波長(zhǎng)λS=530 nm，參比波長(zhǎng)λR=625 nm，故選用后者作為薄層掃描條件。

2．3 實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果分析

(1)不同產(chǎn)地紅果枸杞子中甜菜堿含量依次為寧夏 ＞青海 ＞甘肅 ＞內(nèi)蒙古 ＞新疆，但也有部分青海樣品中甜菜堿含量低于甘肅樣品;(2)同產(chǎn)地枸杞子不同種之間甜菜堿含量依次為紅果枸杞＞黑果枸杞 ＞黃果枸杞;(3)同產(chǎn)地枸杞子不同野生和栽培樣品中甜菜堿含量野生 ＞栽培。

3 結(jié)論

本研究對(duì)枸杞子樣品提取、脫色時(shí)間等前處理?xiàng)l件進(jìn)行了優(yōu)化，并以藥典方法為基礎(chǔ)，對(duì)其中部分操作做出了改進(jìn)，建立了枸杞子主產(chǎn)地以及周邊省20批不同來源枸杞子中甜菜堿含量的雙波長(zhǎng)薄層掃描法。結(jié)果使用二氯甲烷除去脂溶性成分，使用ASE 350在80°C下用80%甲醇水溶液靜置提取15 min，循環(huán)提取1次提取出甜菜堿。以丙酮-無水乙醇-甲酸(10∶6∶3)為展開劑，顯色后置105 °C 烘箱中加熱20 min至斑點(diǎn)清晰，在檢測(cè)波長(zhǎng)λS=530 nm，參比波長(zhǎng)λR=625 nm條件下進(jìn)行薄層掃描。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，適用于測(cè)定枸杞子中甜菜堿的含量測(cè)定。

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