不同提取方法對(duì)印度紫檀葉片揮發(fā)性成分的GC-MS分析

鄭麗霞，高澤正，2，吳偉堅(jiān)* ，梁廣文，符悅冠

1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣州510642;2中國(guó)科學(xué)院華南植物園，廣州510520;3中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，儋州571737

印度紫檀(Pterocarpus indicus)屬蝶形花科紫檀屬，俗稱(chēng)紫檀、薔薇木、赤檀、青龍木、紅木。原產(chǎn)印度、印度尼西亞、馬來(lái)西亞、菲律賓等國(guó)［1］，我國(guó)廣東、廣西、海南及云南均有引種栽培，主要種植于植物園、樹(shù)木園和四旁綠化［2］。印度紫檀作為熱帶、亞熱帶地區(qū)的珍貴用材樹(shù)種之一，不僅具有重要的經(jīng)濟(jì)利用及觀(guān)賞價(jià)值，而且具有速生、土壤改良等特點(diǎn)［3］。2006年，在海南發(fā)現(xiàn)一種新入侵害蟲(chóng)——螺旋粉虱(Aleurodicus dispersus)，其對(duì)印度紫檀等造成嚴(yán)重危害［4］。

植物揮發(fā)性次生物質(zhì)對(duì)昆蟲(chóng)的行為有著重要的影響。植物揮發(fā)性次生物質(zhì)是一些分子量在100～200的有機(jī)化學(xué)物質(zhì)，包括烴類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)、有機(jī)酸、內(nèi)酯、含氮化合物以及有機(jī)硫等化合物［5］。常用的植物揮發(fā)物的分離提取方法主要有同時(shí)蒸餾萃取法(simultaneous distillation extraction，SDE)、固相微萃取法(solid phase micro-extraction，SPME)、動(dòng)態(tài)頂空吸附法(dynamic headspace adsorption，DHA)和超臨界流體萃取(supercritical fluid extraction，SFE)等［6］，以上方法都各具特點(diǎn)。國(guó)外已有研究報(bào)道了印度紫檀樹(shù)皮和心材的揮發(fā)物化學(xué)成分［7］。印度紫檀葉片揮發(fā)物的化學(xué)成分還未見(jiàn)報(bào)道。選擇合適的揮發(fā)性成分分離提取方法，對(duì)于研究印度紫檀葉片的揮發(fā)性成分有重要意義。本文作者使用SDE、SPME和DHA三種方法提取印度紫檀葉片中的揮發(fā)性成分，使用氣相色譜—質(zhì)譜(GC-MS)來(lái)對(duì)印度紫檀葉片中的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，從而建立一種快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單的揮發(fā)性成分提取方法，以期為研究螺旋粉虱等害蟲(chóng)與印度紫檀的相互關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

從廣州華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園采集新鮮印度紫檀葉片，洗去表面灰塵雜質(zhì)，晾干備用;華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲(chóng)生態(tài)室栽培的印度紫檀盆栽。

1．2 儀器和設(shè)備

動(dòng)態(tài)頂空采集裝置，定制;同時(shí)蒸餾萃取裝置，定制;手動(dòng)SPME進(jìn)樣器，100μm PDMS-GC/MS萃取頭，美國(guó)Supelco公司生產(chǎn);RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)生產(chǎn);GCMS-QP2010聯(lián)用儀，日本島津公司生產(chǎn)。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

1．3．1 同時(shí)蒸餾萃取

將印度紫檀葉片洗凈切碎稱(chēng)取25 g置于1 L圓底燒瓶中，加入蒸餾水500 mL，連接于同時(shí)蒸餾萃取裝置一端，用電熱套加熱，電熱套的電壓保持在100 V左右保持沸騰;裝置的另一端連接裝有150 mL無(wú)水乙醚的500mL圓底燒瓶，在50℃下水浴加熱，連續(xù)萃取3 h。以無(wú)水硫酸鈉脫水，過(guò)濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙醚，得到的淺黃色油狀物即是印度紫檀揮發(fā)油。

1．3．2 固相微萃取

將印度紫檀葉片洗凈切碎稱(chēng)取25 g置于1 L的樣品瓶中，用聚氟乙烯隔墊密封，備用。將SPME的萃取纖維頭在氣相色譜的進(jìn)樣口活化30 min，活化溫度為250℃，活化后將固相微萃取的針管插入樣品瓶?jī)?nèi)，推出萃取頭，頂空萃取30 min，縮回纖維頭，將針管推出樣品瓶。將SPME針管插入GC/MS進(jìn)樣口，250℃熱脫附樣品進(jìn)色譜柱。

1．3．3 動(dòng)態(tài)頂空吸附

采樣用大氣采樣儀(QCD-1500型，中國(guó)鹽城銀河科技有限公司生產(chǎn))，Tenax-TA吸附管(15 cm ×0．6 cm)和 GDX-101 過(guò)濾管(15 cm × 0．6 cm)，采集的印度紫檀樣枝和韌皮部組織用Tedlar(30 cm×26 cm)采樣袋裝裹。其基本組成如下:大氣采樣儀(流量計(jì)(活性炭柱空氣過(guò)濾裝置(GDX-101過(guò)濾管(采樣袋(Tenax-TA吸附管(流量計(jì)(大氣采樣儀。大氣采樣儀出氣口和進(jìn)氣口流量分別為250 mL/min和200 mL/min，連續(xù)吸附8 h后取下吸附管，正己烷2 mL進(jìn)行洗脫，用氮?dú)獯颠M(jìn)行濃縮至約1 mL，每一吸附管洗脫及濃縮時(shí)間為2 min。

1．3．4 GC-MS 分析條件

使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀為島津 GCMSQP2010，DB-5MS型氣相色譜柱(30 m ×0．25 mm，0．25μm)，色譜條件:進(jìn)樣量為1μL，分流比為10∶1，進(jìn)樣口、接口溫度分別為250℃和280℃;柱升溫程序:起始溫度60℃，保持2 min，以10℃/min速度升溫至250℃，保持10 min，載氣為高純氦氣，流量1．0 mL/min。質(zhì)譜條件:EI離子源200℃，電子能量70 eV，掃描質(zhì)量范圍40～450 amu。

1．4 化合物的初步鑒定

定性分析采用計(jì)算機(jī)譜庫(kù)(美國(guó)NIST 2005)進(jìn)行初步檢索及匹配分析，并結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行人工譜圖解析，確定揮發(fā)性化合物的各個(gè)化學(xué)成分。采用面積歸一法計(jì)算已確定的印度紫檀揮發(fā)性化合物的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2．1 三種方法提取揮發(fā)性成分的檢出結(jié)果

圖1為SDE、SPME和DHA三種方法所得印度紫檀揮發(fā)物的總離子流圖，從圖1和表1可知，三種方法檢出并鑒定出印度紫檀的揮發(fā)性成分共70種，包括烴類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)、酚類(lèi)、酯類(lèi)、醚類(lèi)、縮醛及其它種類(lèi)的化合物等。其中SDE法檢出25種，SPME法檢出27種，DHA法檢出27種;SDE法和DHA法檢出的化合物出峰時(shí)間較靠前，在前20 min內(nèi)，SDE法檢出22種化合物，DHA法檢出20種化合物，而SPME法則只檢出10種化合物。三種方法檢出的物質(zhì)只有2種相同，即葉醇和乙酸葉醇酯;SDE法和DHA法檢出的相同物質(zhì)有6種;SPME法和DHA法檢出的相同物質(zhì)只有(Z)-丁酸-3-己烯酯和乙酸葉醇酯;19種物質(zhì)僅由SDE法檢出，24種物 質(zhì)僅由SPME法檢出，20種物質(zhì)僅由DHA法檢出。

圖1 SDE(a)、SPME(b)及DHA(c)所得印度紫檀揮發(fā)性物質(zhì)的GC-MS總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion chromatograms of volatile components of P．indicus extracted by SDE，SPME and DHA

2．2 揮發(fā)性成分的比較

印度紫檀通過(guò)SDE、SPME和DHA三種方法分析之后，所檢出的揮發(fā)性成分差異比較明顯。GCMS鑒定出的印度紫檀揮發(fā)性成分及其相對(duì)含量見(jiàn)表1。SDE法檢出烴類(lèi)2種、醇類(lèi)6種、酮類(lèi)1種、酯類(lèi)5種、醚類(lèi)3種、縮醛8種，其中醇類(lèi)和縮醛的相對(duì)含量分別為47．44%和31．57%，主要是2-硝基乙醇 (35．29%)、葉 醇 (4．23%)、2，3-丁 二 醇(3.16%)、1-辛烯-3-醇(0．88%)、4-甲基-1，3-二氧基雜環(huán)戊烷(11．18%)、2，4，5-三甲基-1，3-二氧雜環(huán) 戊 烷 (5．57%)、2-甲 氧 基-1，3-二 氧 戊 烷(4.41%)、甘油縮甲醛(3.57%)、1，1-二氧基乙烷(3.49%)等;SPME法檢出的烴類(lèi)5種、醇類(lèi)4種、酮類(lèi)4種、酚類(lèi)1種、酯類(lèi)9種、醚類(lèi)1種、其它化合物3種。其主要檢出的是酯類(lèi)(62.77%)和烴類(lèi)(15.67%)，其中乙酸葉醇酯和己酸葉醇酯的相對(duì)含量分別為33.62%和25.36%，剩余7種酯的相對(duì)含量之和為3.79%，檢出的烴類(lèi)主要是紫蘇烯(5.99%)和石竹烯(7.89%);DHA法檢出的醇類(lèi)8種、醛類(lèi)2種、酮類(lèi)4種、酚類(lèi)1種、酯類(lèi)4種、醚類(lèi)3種、縮醛3種及其它化合物2種，醇類(lèi)、醚類(lèi)和縮醛所占相對(duì)含量分別為47.92%、18.05%和10.87%，主要是 2-己醇(0.82%)、2-硝基乙醇(30.42%)、2-異丙氧基乙醇(3.51%)、葉醇(10.65%)、2，4-二甲基-3-戊醇(1.49%)、2-乙氧基丁烷(5.44%)、2-乙氧基-3-氯丁烷(4.58%)、2-乙氧基戊烷(8.03%)、2-乙基-1，3-二氧戊烷(1.78%)、二乙醇縮乙醛(7.84%)和 2，4，5-三甲基-1，3-二氧雜環(huán)戊烷(1.25%)。三種方法檢出的結(jié)果差異較大，共同檢出的化合物只有葉醇和乙酸葉醇酯。SDE法和DHA法所檢出的主要是分子量較小的醇類(lèi)、醚類(lèi)和縮醛等，所檢出的相同物質(zhì)也相對(duì)較多，這兩種方法都檢出了含量較高的2-硝基乙醇，相對(duì)含量分別達(dá)到了35.29%和30.42%;而SPME法所檢出的主要是分子量相對(duì)較大的酯類(lèi)和烴類(lèi)物質(zhì)，這與萃取頭的選擇關(guān)系很大，不同種類(lèi)涂層的萃取頭有著不同的性能，對(duì)不同揮發(fā)物的萃取效果影響很大。

3 討論

昆蟲(chóng)在尋找寄主植物的過(guò)程中，寄主植物的氣味傳遞著有關(guān)取食、產(chǎn)卵及其它活動(dòng)的可行性信息，對(duì)昆蟲(chóng)的行為反應(yīng)起著關(guān)鍵的作用［8］。三種方法都檢出了葉醇和乙酸葉醇酯，其中葉醇和反-2-己烯-1-醇、1-己醇結(jié)合棉鈴象甲聚集信息素使用，能夠顯著提高棉鈴象甲的田間誘捕量［9］。蚜蟲(chóng)的天敵食蚜蠅、瓢蟲(chóng)和草蛉等，能夠利用綠葉植物氣味找到蚜蟲(chóng)進(jìn)行捕食［10，11］。本研究采用 SDE、SPME 和 DHA三種方法，提取分析了螺旋粉虱的寄主植物印度紫檀揮發(fā)物的主要化學(xué)成分。三種方法提取印度紫檀葉片揮發(fā)物的化學(xué)組成相差較大，SDE法和DHA法檢出的主要是分子量較小的醇類(lèi)和縮醛等，而SPME法所檢出的主要是分子量相對(duì)較大的酯類(lèi)和烴類(lèi)物質(zhì)，其重復(fù)性和重復(fù)效果不佳。所以將SDE法和DHA法這兩種方法結(jié)合起來(lái)，能更好更全面地得到一些分子量較小的植物揮發(fā)性次生物如一些6個(gè)碳的醇類(lèi)、烴類(lèi)和酯類(lèi)等，這些6個(gè)碳的綠葉植物氣味在植食性昆蟲(chóng)尋找寄主時(shí)起著重要的作用，同時(shí)也為進(jìn)一步探究螺旋粉虱等植食性昆蟲(chóng)危害寄主植物的化學(xué)機(jī)制提供理論依據(jù)。

表1 SDE、SPME和DHA提取的印度紫檀揮發(fā)性成分分析結(jié)果Table 1 Analysis result of volatile components of P.indicus extracted by SDE，SPME and DHA

33 植酮Hexahydrofarnesyl acetone C18 H36O－ － － － － －39.342 0.61 95酚類(lèi)(2種)Phenols(two)34 乙烯基苯酚Ethenyloxybenzene C8H8 O － － － － － － 20.384 2.29 86 35 2，6-二叔丁基對(duì)甲酚Butylated hydroxytoluene C15 H24O － － － 27.615 0.69 85 － － －酯類(lèi)(15種)Esters(fifteen)36 丁酸乙酯Ethyl butyrate C6H12 O2 5.215 0.04 81 － － － － － －37 丙二醇甲醚醋酸酯1-Methoxy-2-propyl acetate C6 H12 O3 5.493 4.38 87－－－－－－36 3-甲氧基乙酸丙酯3-Methoxypropyl acetate C6 H13 O3 8.770 1.30 87－－－－－－39 乙酸甲氧三甘酯Triethylene glycolmonomethyl ether acetate C9H18 O5 8.987 2.21 85－－－－－－40 乙酸葉醇酯cis-3-Hexenyl-1-acetate C8H14 O2 11.213 0.48 94 10.302 33.62 95 12.545 4.18 96 41 乙酸己酯Hexyl acetate C8 H16 O2 － － － 14.258 0.31 96 － － －42 (Z)-丁酸-3-己烯酯cis-3-Hexenyl butyrate C10 H18O2 － － － 16.770 1.79 91 25.965 0.65 94 43 丁酸己酯Hexyl butyrate C10 H20O2 － － － 16.965 0.16 74 － － －44 戊酸葉醇酯cis-3-Hexenylvalerate C11 H20O2 － － － 18.394 0.20 78 － － －45 2-(1-乙氧基乙氧基)丙酸乙酯Ethyl 2-(1-ethoxyethoxy)propancate C9 H18 O4－ － － － － －18.771 2.05 86 46 己酸葉醇酯cis-3-Hexenyl hexanoate C12 H22O2 － － － 23.434 25.36 84 － － －47 甲酸環(huán)己酯Cyclohexyl formate C7 H12 O2 － － － 24.962 0.49 80 － － －48 異丁烯酸環(huán)己酯Gyclohexylmethacrylate C10 H16 O2 － － － － － － 26.124 0.56 82 49 苯甲酸葉醇酯cis-3-Hexenyl benzoate C13 H16O2 － － － 29.337 0.46 87 － － －50 亞硫酸，丁基十三烷基酯Sulfurous acid，butyl tridecyl ester C17 H36 O3 S－ － － 31.530 0.38 88 － － －醚類(lèi)(5種)Ethers(five)51 2-乙氧基丁烷2-Ethoxybutane C6 H14O 5.364 2.51 92 － － － 5.648 5.44 91 52 2-乙氧基丙烷2-Ethoxypropane C5 H12O 5.798 2.08 85 － － － － － －53 2-乙氧基-3-氯丁烷2-Ethoxy-3-chlorlbutane C6 H13 ClO － － － － － － 6.079 4.58 92 54 2-乙氧基戊烷2-Ethoxypentane C7 H16O 8.484 0.98 88 － － － 7.504 8.03 88 55 1-丁氧基戊烷1-Butoxypentane C9 H20O － － － 17.250 0.18 79 － － －縮醛類(lèi)(10種)Acetals(ten)56 1，1-二氧基乙烷1，1-Diethoxyethane C6 H14 O2 3.713 3.49 93 － － － － － －57 1-乙氧基-1-丙氧基乙烷1-Ethoxy-1-propoxyethane C7H16 O2 9.219 0.93 88 － － － － － －58 2-甲氧基甲基-2，4，5-三甲基-1，3-二氧戊烷2(Methoxymethyl)-2，4，5-trimethyl-1，3-dioxolane C8 H16 O3 10.923 1.13 87 － － － － － －59 2-乙基-2，4，5-三甲基-1，3-二氧戊烷2-Ethyl-2，4，5-trimethyl-1，3-dioxolane C8 H16 O2 12.426 1.26 85 － － － － － －60 2-乙基-1，3-二氧戊烷2-Ethyl-1，3-dioxolane C5H10 O2 － － － － － － 18.419 1.78 84 61 二乙醇縮乙醛1，1-Diethoxyethane C6 H14 O2 － － － － － － 7.873 7.84 88 62 甘油縮甲醛1，3-Dioxan-5-ol C4 H8 O3 11.104 3.57 86 － － － － － －63 2，4，5-三甲基-1，3-二氧雜環(huán)戊烷2，4，5-Trimethyl-1，3-dioxolane C6H12 O2 3.667 5.57 96 － － － 4.303 1.25 95 64 4-甲基-1，3-二氧基雜環(huán)戊烷4-Methyl-1，3-dioxane C5H10 O2 4.151 11.18 86 － － － － － －65 2-甲氧基-1，3-二氧戊烷2-Methoxy-1，3-dioxolane C4 H8 O3 11.530 4.41 87 － － － － － －其它(5種)Others(five)66 苯乙氰Benzyl cyanide C8 H7 N － － － － － － 17.440 3.64 96 67 十甲基環(huán)五硅氧烷Decamethylcyclopentasiloxane C10H30 O5 Si5－ － －15.735 4.67 93 － － －

注:“－”表示未檢測(cè)到。Note:“－”indicates not detected．

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