朱紅栓菌中兩個吩噁嗪酮類生物堿的分離與鑒定

朱 峰，盧衛(wèi)紅，陳 忻，吳靜姝

1佛山科學技術(shù)學院化學與化工系，佛山528000;2佛山科學技術(shù)學院動物醫(yī)學系，佛山528231

朱紅栓菌 Trametes cinnabarina(Jacq．)Franeh是一種野生高等真菌，在分類上屬于多孔菌科(Polyporaceae)，生于櫟、樺、鍛、櫸等闊葉樹的腐木上，偶爾生于松木上。分布于華北、西北及黑龍江、吉林、江蘇、安徽、浙江、江西、河南、湖南、廣東、廣西等省區(qū)。在香菇、木耳栽培的段木上，常出現(xiàn)此菌，屬食菌段木上常見的“雜菌”。它具有多種藥用價值，具有祛風除濕，清熱解毒，行氣，止血，止癢等功效。其提取物對小白鼠肉瘤S180和艾氏腹水瘤的抑制率達90%，能明顯增加小鼠免疫器官胸腺和脾臟的重量，提高巨噬細胞的吞噬活力，促進T細胞體外增殖及接觸性皮炎反應(yīng)，提高小鼠血清凝集素滴度，具有很高的開發(fā)利用價值［1，2］。

本文首次對采自廣東省上川島的野生朱紅栓菌化學成分進行了研究，發(fā)現(xiàn)其甲醇粗提物對大腸桿菌、沙門氏菌、鏈球菌和金黃葡萄球菌表現(xiàn)出有意義的抗菌活性，從該粗提物分離獲得兩個吩噁嗪酮類生物堿，通過波譜分析分別鑒定為朱紅菌素(1)和朱紅栓菌素(2)，結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 朱紅菌素(1)和朱紅栓菌素(2)的結(jié)構(gòu)式ig.1 The structures of cinnabarin(1)and tramesanguin(2)

1 材料與方法

1．1 儀器與材料

1．1．1 儀器

INOVA 500 NB超導(dǎo)核磁共振譜儀(美國Varian公司);ZAB-HS雙聚焦磁質(zhì)譜儀(英國VG公司);X4型顯微熔點測定儀(上海荊和分析儀器有限公司)。

1．1．2 材料

野生朱紅栓菌(2009年6月3日采自廣東省上川島，根據(jù)文獻［1，2］鑒定為朱紅栓菌 Trametes cinna-barina(Jacq．)Franeh);微晶纖維素薄層色譜板。

1．2 方法

1．2．1 甲醇粗提物的制備

137 g風干野生朱紅栓菌子實體粉碎后用1 L甲醇室溫浸泡提取3次，每次7 d，提取液合并減壓濃縮至一半體積，析出紅色沉淀，抽濾，得甲醇粗提物。

1．2．2 甲醇粗提物的抗菌活性

甲醇粗提物用DMSO配成1和5 mg/mL濃度樣品液。采用K-B紙片擴散法［3］，將試驗微生物菌株用無菌生理鹽水配置成為0．5麥氏單位的懸液，接種于M-H瓊脂平皿上，分別貼上1和5 mg/mL甲醇粗提物藥敏紙片，于35℃孵育24 h，測定抑菌圈大小。

1．2．3 化合物分離純化

甲醇粗提物用吡啶重結(jié)晶，得紅色物質(zhì)(120 mg)。微晶纖維素薄層色譜分析表明，該紅色物質(zhì)由兩個主要成分組成。因此取20 mg紅色物質(zhì)用少量混合溶劑(吡啶∶正丁醇∶水 v/v/v 6∶2∶2)溶解，進一步通過制備微晶纖維素薄層色譜分離純化(展開溶劑系統(tǒng)為吡啶∶正丁醇∶水v/v/v 6∶2∶2)，先后得到兩個紅色組分，這兩個紅色組分進一步通過吡啶重結(jié)晶，分別得到紅色晶體1(5mg)和紅色晶體2(9 mg)。

2 結(jié)果與討論

2．1 甲醇粗提物及其抗菌活性

甲醇提取液在濃縮到一半體積時便析出大量紅色固體，發(fā)現(xiàn)該固體很難再次溶解于甲醇，并且難溶于一般的有機溶劑和水，在吡啶和乙酸中溶解性能有所增加。采用K-B紙片擴散法［3］，以鏈霉素為參照，測定該甲醇粗提物對大腸桿菌、沙門氏菌、鏈球菌和金黃葡萄球菌等4種試驗微生物的體外抗菌活性，試驗結(jié)果見表1。

表1 朱紅栓菌甲醇粗提物的體外抗菌活性Table 1 Antibacterial activities in vitro of themethanol crude extract of Trametes cinnabarina(Jacq．)Franeh

體外抗菌試驗結(jié)果表明，甲醇粗提物對4種試驗菌株顯示出有意義的抑菌活性，其中對大腸桿菌的抑菌活性最強。

2．2 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 紅色晶體(吡啶)，mp．溫度大于300℃時逐漸分解。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ:9.56(br s，1H，2-NHα)，8．69(br s，1H，2-NHβ)，7.55(m，1H，H-7)，7．53(m，1H，H-8)，7．46(d，J=7．5 Hz，1H，H-6)，6．58(s，1H，H-4)，4．86(s，2H，H-12);13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ:177．6(s，C-3)，169．0(s，C-11)，152．0(s，C-2)，151．1(s，C-10')，146．1(s，C-4')，142．0(s，C-5')，138．2(s，C-9)，129．2(d，C-7)，126．6(s，C-9')，123．6(d，C-8)，114．5(d，C-6)，105．0(d，C-4)，92．2(s，C-1)，58．7(s，C-12);FABMS:m/z 287 ［M+H］+。NMR譜表明這是一個吩噁嗪酮類生物堿，其波譜數(shù)據(jù)與文獻［4］報道的朱紅菌素一致，因此鑒定為朱紅菌素，結(jié)構(gòu)式見圖1。

化合物2 紅色晶體(吡啶)，mp．溫度大于250℃逐漸分解;1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ:10．33(s，1H，H-12)，9．78(br s，1H，2-NHα)，8．90(br s，1H，2-NHβ)，7．98(d，J=7．5 Hz，1H，H-8)，7．85(d，J=7．8 Hz，1H，H-6)，7．72(dd，J=7．5，7．8 Hz，1H，H-7)，6．63(s，1H，H-4);13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ:191．4(d，C-12)，168．7(s，C-11)，177．8(s，C-3)，152．6(s，C-2)，150．4(s，C-10')，148．6(s，C-4')，142．0(s，C-5')，131．2(d，C-8)，128．9(d，C-7)，128．7(s，C-9')，128．4(s，C-9)，121．6(d，C-6)，105．0(d，C-4)，92．1(s，C-1);FABMS:m/z285［M+H］+?；衔?的NMR譜與化合物1的NMR譜非常相似，也是一個吩噁嗪酮類生物堿，其波譜數(shù)據(jù)與文獻［4］報道的朱紅栓菌素一致，因此鑒定為朱紅栓菌素，結(jié)構(gòu)式見圖1。

2．3 討論

生物堿廣泛存在于藥用植物中［5，6］，并且是許多微生物代謝產(chǎn)物的主要成分［7，8］，具有各種各樣的生物活性。吩噁嗪酮類生物堿也發(fā)現(xiàn)存在于其它多孔菌科高等真菌之中，比如Pycnoporus cinnabari-nus［4］、Trametes cinnabarina var．sanguinea(L．)Pilat［9］、T．cinnabarina Jacq．［10］和 Coriolus sanguineus(Polystictus cinnabarinus)［11］，并且被認為是這些真菌呈現(xiàn)鮮艷的紅色的主要原因［4，9-12］。近年來，發(fā)現(xiàn)海洋放線菌ACMA006也能產(chǎn)生吩噁嗪酮類生物堿［13］，其中放線菌素 D還具有顯著的抗腫瘤活性［14］。因而吩噁嗪酮類生物堿引起了人們的重視。

由于吩噁嗪酮類生物堿難溶于大多數(shù)有機溶劑和水溶液，因此人們一直致力于研究這類化合物的有效提取分離方法。早期對這類化合物的結(jié)構(gòu)分析手段主要是運用紅外和拉曼光譜、紫外光譜并結(jié)合化學合成與修飾方法［9-12，15-19］。近年來才開始逐漸應(yīng)用NMR手段對這類化合物進行表征，并導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)了一些新的吩噁嗪酮類生物堿［4，20，21］。

本文從廣東省上川島采集的野生朱紅栓菌分離獲得2個吩噁嗪酮類生物堿，經(jīng)NMR譜鑒定為朱紅菌素(1)和朱紅栓菌素(2)。由于這2個化合物難溶于一般有機溶劑，因而其生物活性還未得到有效研究。對其結(jié)構(gòu)進行修飾以增強其溶解性，從而深入研究其生物活性，開發(fā)其潛在的藥用價值，這些工作正在進一步研究之中。

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