不同刺激參數(shù)rTMS對慢性不可預見應激大鼠行為的作用及大腦BDNF水平的影響*

李子青 薛芬 陳冠婕 王化寧 彭正午 譚慶榮

不同刺激參數(shù)rTMS對慢性不可預見應激大鼠行為的作用及大腦BDNF水平的影響*

李子青 薛芬 陳冠婕 王化寧 彭正午 譚慶榮

目的觀察不同刺激參數(shù)重復經(jīng)顱磁刺激(rTMS)對慢性不可預見應激(CUS)模型大鼠行為學的作用，并觀察其對大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)水平的影響。方法64只SD大鼠隨機分為對照組(8只)、模型組(8只)和干預組(共6個亞組，每組8只)。對照組正常飼養(yǎng)21d后連續(xù)7d給予rTMS假刺激;模型組在造模后連續(xù)7d給予rTMS假刺激;干預組在造模后每天給予不同頻率和強度的rTMS刺激，連續(xù)7 d。實驗期間觀察大鼠體質(zhì)量的變化，并采用運動箱和強迫游泳實驗評估大鼠抑郁樣行為，最后以酶聯(lián)免疫吸附法測定大腦BDNF的水平。結(jié)果(1)造模結(jié)束后，對照組大鼠的體質(zhì)量、強迫游泳靜止時間與其他兩組相比均存在顯著性差異(P＜0.01，P＜0.05)，而模型組和干預組大鼠比較沒有上述差異(P＞0.05)。各組大鼠水平運動距離沒有顯著性差異(P＞0.05)。(2)rTMS干預后，①模型組大鼠的體質(zhì)量顯著低于對照組及干預組(5 Hz，0.84/1.26 T和10 Hz，0.84/1.26 T)(P＜0.05)。②各組大鼠水平運動距離之間沒有顯著性差異;模型組強迫游泳靜止時間百分比明顯高于對照組及干預組(P＜0.05)。③模型組BDNF的水平低于對照組，而一定刺激條件的rTMS可以改善這一現(xiàn)象。④雙因素方差分析顯示，刺激頻率可能是改善大鼠抑郁行為和調(diào)節(jié)BDNF的關(guān)鍵因素，而且5 Hz的抗抑郁效應更為顯著。結(jié)論不同刺激參數(shù)的rTMS對CUS動物抑郁行為的改善作用存在差異，大腦BDNF水平的變化可能參與了這一改善過程。

重復經(jīng)顱磁刺激慢性不可預見應激腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子大鼠

抑郁癥是目前臨床上最常見的精神疾患之一，是以情緒低落、思維遲緩并伴有興趣減低、主動性下降等精神運動性遲滯癥狀為主要臨床表現(xiàn)的一類心境障礙綜合征。其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，嚴重影響著人類的健康和生活質(zhì)量，也給社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔［1］。抑郁癥的發(fā)病原因涉及生物、心理、社會等多方面因素，并且與遺傳因素有著密切關(guān)系，但其病因及發(fā)病機制尚不完全明了［2］。目前，抗抑郁藥物是治療抑郁癥的首選方式，它們可以有效緩解抑郁癥狀，并且能夠抑制其復發(fā)［3，4］，但是，抗抑郁藥物的抗抑郁療效并不令人滿意，而且大多數(shù)抗抑郁藥物往往具有不同的副作用［5，6］。因此，開發(fā)新的抗抑郁療法具有重要意義。重復經(jīng)顱磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS)做為新的治療手段，目前已被越來越多的應用于臨床，而且在2008年被美國FDA批準用于抑郁癥的臨床治療。但是，rTMS作用參數(shù)的選擇仍然存在爭議，不同強度和頻率的rTMS作用的分子生物學機制亦不明確。

因此本實驗通過建立CUS抑郁動物模型，觀察了不同頻率(1 Hz、5 Hz和10 Hz)和強度(0.84 T和1.26 T)rTMS對其體質(zhì)量、抑郁行為以及大腦BDNF表達的作用，為rTMS治療參數(shù)的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物64只成年雄性清潔級Sprague Dawley (SD)大鼠，體質(zhì)量150～180 g，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。所有大鼠適應性飼養(yǎng)7 d后，按照數(shù)字隨機法分為對照組(8只)、模型組(8只)、干預組(按照刺激參數(shù)的不同，分為1 Hz、0.84 T，1 Hz、1.26 T，5 Hz、0.84 T，5 Hz、1.26 T，10 Hz、0.84 T，10 Hz、1.26 T共6個處理組，每組8只)。

1.1.2 主要試劑和儀器BDNF大鼠Elisa試劑盒(SunRed，0477)，YRD CCY－Ⅰ磁場刺激儀和小動物刺激線圈拍(武漢依瑞德公司)，磁場強度測試儀(Bell公司)，大鼠強迫游泳測試記錄箱(上海吉量公司)，酶聯(lián)免疫檢測儀(BioTek公司)，TopScan行為學分析系統(tǒng)(Clever Sys公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗過程對照組正常飼養(yǎng)21 d后連續(xù)7 d給予rTMS假刺激;模型組為CUS造模結(jié)束后，連續(xù)7d給予rTMS假刺激;干預組在CUS造模結(jié)束后，每天給予不同頻率和強度的rTMS刺激，連續(xù)7 d。每周末記錄大鼠體質(zhì)量，最后一次rTMS干預結(jié)束24 h后，檢測大鼠的行為學表現(xiàn)，隨后提取腦組織蛋白，采用ELISA方法檢測BDNF表達水平。

1.2.2CUS模型的建立模型組和干預組接受CUS處理，CUS模型的建立包括以下處理:(1)晝夜節(jié)律顛倒和光照性質(zhì)改變(閃光刺激、晝夜顛倒、間斷光照); (2)食物和飲水供應的改變(禁食、禁水);(3)居住環(huán)境的改變(單籠飼養(yǎng)、鼠籠傾斜、潮濕墊料);(4)短時間內(nèi)足底電擊;(5)強迫游泳;(6)束縛應激;(7)高溫環(huán)境;(8)噪音干擾;(9)陌生氣味;(10)陌生異常物品(塑料杯、木勺、碎布片等)。幾種不同的應激處理在實驗中全部應用，順序隨機，使動物不能預料刺激的發(fā)生。整個造模過程持續(xù)3周。

1.2.3rTMS刺激模式線圈拍的中點放在大鼠頭顱頂點;刺激頻率和強度如前所述，通過調(diào)整刺激串之間的間隔，使得不同頻率rTMS作用的時間相一致;每天1 000個脈沖，連續(xù)7 d(共7 000個脈沖)。rTMS假性刺激是將rTMS的拍子置于大鼠頭上5 cm處并且旋轉(zhuǎn)90度，確保大鼠能感受到線圈拍的震動但處于rTMS磁場之外。由于rTMS干預的整個過程中大鼠會受到人為的束縛，為了排除非特異性應激對大鼠造成的影響，rTMS干預前1周，將大鼠置于相似的環(huán)境中，即每只大鼠每天接受相同的束縛及rTMS噪聲刺激15 min。

1.2.4 強迫游泳實驗將大鼠放入圓柱形玻璃瓶中(高45 cm，直徑55 cm，水深25 cm，水溫22～24℃)，每桶一只大鼠。實驗第一天，每只大鼠預游泳15 min，隨后取出擦干放入籠中。24 h之后再次將大鼠放入水中即開始計時，連續(xù)觀察5 min，記錄每只大鼠在水中“不動時間”的百分率。其中，“不動”定義為大鼠三肢不動，第四肢只有輕微的運動。

1.2.5 運動箱實驗將大鼠單獨置于運動行為觀察箱中(底面積47 cm×47 cm，高47 cm的隔音箱)，10 s適應期后，使用紅外線攝像頭記錄大鼠運動行為10 min，采用Topscan視頻分析系統(tǒng)分析大鼠的水平運動總路程。

1.2.6BDNF酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測每組腦組織按重量加入適量PBS，冰上勻漿，4℃，12 000 rpm離心10 min;并使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量;按照BDNF試劑盒說明書向96孔板加入標準液體和待測樣品，并向每個樣品孔加入BDNF抗體10 μl及Str－HRP 50 μl;輕輕震蕩，37℃孵育1 h;洗滌液洗板6次，每孔加入50 μl A液和50 μl B液，置37℃暗處反應10min;每孔加入50 μl終止液，在450 nm測吸光度(OD)值，繪制標準曲線并計算BDNF的含量。

1.3 統(tǒng)計分析采用SPSS14.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(x±s)表示。組間差異采用單因素方差分析或雙因素方差分析，兩兩數(shù)據(jù)比較則采用LSD檢驗，設P＜0.05時有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各處理組體質(zhì)量變化對各處理組進行方差分析發(fā)現(xiàn)，各處理組基線時及入組后第1、2周末體質(zhì)量比較無顯著性差異(F=0．521，P=0．814;F=0．803，P =0．589;F=1．028，P=0．424)，入組后第3、4周末體質(zhì)量比較存在顯著性差異(F=2．469，P=0．030;F= 3．106，P=0．009)。進一步兩兩比較t檢驗顯示，入組3周末，對照組與其他組大鼠體質(zhì)量之間存在顯著性差異(P＜0.01);入組4周末，對照組體質(zhì)量與模型組，1 Hz、0.84 T干預組和1 Hz、1.26 T干預組之間存在顯著性差異(P＜0．05，P＜0.01)，而5 Hz、0.84 T干預組，5 Hz、1.26 T干預組，10 Hz、0.84 T干預組，10 Hz、1.26 T干預組與對照組體質(zhì)量比較沒有顯著性差異(P＞0．05)，但是與模型組比較，存在顯著性差異(P＜0．05)。見表1。入組后第4周末各干預組的體質(zhì)量經(jīng)雙因素方差分析，結(jié)果顯示，刺激強度(F= 2．244，P=0．119)和頻率(F=0．06，P=0．807)的不同水平對體質(zhì)量的影響不顯著，而且這兩個因素之間也沒有交互作用(F=0．014，P=0.986)。

表1 各組大鼠體質(zhì)量的變化(x±s)

2.2 各組大鼠行為學實驗結(jié)果比較運動箱實驗結(jié)果顯示，各處理組大鼠rTMS干預前后的水平運動距離之間沒有顯著性差異(P＞0.05)。強迫游泳實驗結(jié)果顯示:造模結(jié)束后，對照組與模型組和干預組之間不動時間百分比均存在顯著性差異(P＜0.05)，而模型組和各干預組之間均沒有顯著性差異(P＞0.05)。經(jīng)方差分析運動箱實驗結(jié)果顯示，各處理組大鼠rTMS干預后的水平運動距離之間無顯著性差異(F= 46．210，P=0.080);強迫游泳實驗結(jié)果顯示，各處理組大鼠rTMS干預后的不動時間百分率均存在顯著性差異(F=3．525，P=0.006)。進一步兩兩比較t檢驗顯示，rTMS干預后對照組不動時間百分比低于模型組(P＜0.05)，5 Hz、0.84 T干預組，5 Hz、1.26 T干預組，10 Hz、0.84 T干預組，10 Hz、1.26 T干預組則高于模型組(P＜0．05，P＜0.01)。見表2。雙因素方差分析結(jié)果顯示，刺激強度的不同水平對強迫游泳不動時間百分比有顯著性影響(F=3．243，P=0．049)，而刺激頻率對不動時間百分比無顯著性影響(F=0．026，P =0．873)，兩個因素之間也沒有交互作用(F=0．221，P=0.803)。兩兩比較結(jié)果顯示，假刺激0 Hz與1 Hz之間存在顯著性差異(P＜0.05)，而且與5 Hz和10 Hz之間也存在顯著性差異(P＜0.01);此外，1 Hz與5 Hz之間存在顯著性差異(P＜0.05)，但是和10 Hz之間無顯著性差異(P＞0.05)。

表2rTMS干預后各組大鼠運動箱、強迫游泳實驗結(jié)果以及BDNF水平的比較(x±s)

2.3 各處理組BDNF水平的比較經(jīng)方差分析ELISA檢測結(jié)果顯示，各處理組大鼠rTMS干預后的大腦BDNF水平均存在顯著性差異(F=3．490，P= 0.040)。進一步兩兩比較t檢驗顯示，對照組大腦BDNF的水平高于模型組，1 Hz、0.84 T干預組和1 Hz、1.26 T干預組(P＜0.01)，而且5 Hz、0.84 T干預組，5 Hz、1.26 T干預組，10 Hz、0.84 T干預組，10 Hz、1.26 T干預組與模型組比較，也存在顯著性差異(P＜0.05)。見表2。雙因素方差分析結(jié)果顯示，刺激強度的不同水平對BDNF有顯著性影響(F=3．975，P =0．026)，而刺激頻率對不動時間無顯著性影響(F= 0．440，P=0．511)，兩個因素之間也沒有交互作用(F =0．018，P=0.992)。兩兩比較結(jié)果顯示，假刺激0 Hz與5 Hz之間存在顯著性差異(P＜0.05)，而且與5 Hz和1 Hz之間也存在顯著性差異(P＜0.05);此外，1 Hz與10 Hz之間無顯著性差異(P＞0.05)。

3 討論

不同刺激強度和頻率的rTMS對大腦皮層興奮性的影響不同，研究表明，高頻刺激(5～20 Hz)可提高治療側(cè)皮層的興奮性［7］，而低頻刺激(＜1 Hz)對治療側(cè)皮層興奮性具有抑制作用［8，9］。臨床上，治療抑郁癥常選擇高頻率rTMS刺激左側(cè)前額葉背外側(cè)皮質(zhì)，或低頻率rTMS刺激右側(cè)前額葉背外側(cè)皮質(zhì)［10］。但是，目前的研究尚不能揭示如1 Hz、5 Hz或10 Hz等不同高頻率對抑郁癥的治療效果之間是否存在差異，不同刺激強度對抑郁癥的治療效果也不清楚。

本研究結(jié)果顯示，CUS干預后，模型組體質(zhì)量顯著低于對照組(P＜0.05);經(jīng)過1周的rTMS治療后，5 Hz、0.84 T干預組，5 Hz、1.26 T干預組，10 Hz、0.84 T干預組，10 Hz、1.26 T干預組大鼠的體質(zhì)量與對照組沒有顯著性差異，但是顯著高于模型組;1 Hz、0.84 T干預組和1 Hz、1.26 T干預組大鼠的體質(zhì)量與模型組無顯著性差異，但是顯著低于對照組。同時，本研究采用強迫游泳和運動箱實驗觀察不同處理組抑郁行為的差異，結(jié)果顯示，各處理組大鼠的水平運動距離之間均沒有顯著性差異，而強迫游泳不動時間的結(jié)果與體質(zhì)量的變化相似:模型組不動時間百分比顯著高于對照組(P＜0.05);5 Hz、0.84 T干預組，5 Hz、1.26 T干預組，10 Hz、0.84 T干預組，10 Hz、1.26 T干預組大鼠的不動時間百分比與對照組比較無顯著性差異，但是均顯著低于模型組;1 Hz、0.84 T干預組和1 Hz、1.26 T干預組與模型組和對照組比較均沒有顯著性差異。此外，各處理組體質(zhì)量(4周)經(jīng)雙因素方差分析，頻率和刺激強度對其均無顯著性影響。提示不同參數(shù)rTMS對大鼠體質(zhì)量的作用并不顯著。然而刺激頻率對強迫游泳不動時間百分比卻有顯著性影響，而且0 Hz與1Hz、5Hz或10 Hz之間均存在顯著性差異(P＜0.05)，1 Hz與5 Hz之間也存在顯著性差異(P＜0.05)，提示rTMS刺激頻率而非刺激強度，是改善動物抑郁行為的關(guān)鍵因素，而且5 Hz的抗抑郁效果更好。

為了進一步探討不同參數(shù)rTMS可能的分子機制，本研究觀察了各處理組BDNF水平的差異。越來越多的證據(jù)表明，BDNF參與了抑郁癥的病理生理過程:重癥抑郁癥(major depressive disorder，MDD)患者血清BDNF的水平低于正常人群，且MDD患者尸檢發(fā)現(xiàn)大腦BDNF的水平低于健康對照人群［11］;還有研究發(fā)現(xiàn)在抗抑郁藥物的基礎上增加低劑量的非典型抗精神病藥物，不僅能增加患者服藥的依從性，改善其臨床癥狀，還能增加患者血漿BDNF的水平［12］;而且大鼠海馬內(nèi)注射BDNF能使抑郁模型(強迫游泳和習得性無助)大鼠抑郁樣行為得到改善［13］，外周給予BDNF也能產(chǎn)生類似的抗抑郁效應［14］，BDNF已經(jīng)成為一個重要的抗抑郁效果的候選預測指標［15］。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠BDNF水平顯著下降，但給予rTMS干預后，與模型組比較，5 Hz、0.84 T干預組，5 Hz、1.26 T干預組，10 Hz、0.84 T干預組，10 Hz、1.26 T干預組的BDNF水平增加，差異具有統(tǒng)計學意義，表明rTMS干預能明顯改善模型大鼠的BDNF水平。雙因素方差分析結(jié)果也顯示，刺激強度的不同水平對BDNF的影響顯著，而且5 Hz對BDNF的調(diào)節(jié)作用更為顯著。提示rTMS刺激頻率也是改善大鼠BDNF水平的關(guān)鍵因素。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)不同刺激參數(shù)的rTMS治療對大鼠抑郁樣行為和BDNF的表達具有差異性，而且刺激頻率具有關(guān)鍵作用。為rTMS在抑郁癥的臨床應用和治療參數(shù)選擇提供了實驗依據(jù)。但本實驗的刺激頻率只選用了1 Hz、5 Hz和10 Hz，強度也僅選擇了0.84和1.26 T，更多的刺激參數(shù)組合的抗抑郁作用還不清楚，而且不同rTMS治療參數(shù)對于抑郁癥其它相關(guān)指標(如神經(jīng)遞質(zhì)水平、神經(jīng)發(fā)生等)的影響也有待進一步研究。

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(修回日期:2014－02－13)

統(tǒng)計學中有關(guān)問題

1.假設檢驗的注意事項

(1)假設檢驗應注意資料的可比性。

保證比較組間的可比性是假設檢驗的前提。為了保證資料的可比性，必須要有嚴密的抽樣設計。

(2)要注意選用的假設檢驗方法的應用條件。

資料性質(zhì)不同，設計類型不同，樣本含量大小不同，檢驗方法也不同。

(3)結(jié)論不能絕對化。

由于假設檢驗是根據(jù)抽得的樣本資料對總體的某種特征作出判斷，而樣本只反映總體的部分特征，由它來推斷總體的特征就不能有百分之百的把握，因此假設檢驗作出的判斷有可能是錯誤的。

(4)正確區(qū)分差別有無統(tǒng)計意義與有無專業(yè)上的實際意義。

差別有統(tǒng)計意義只說明相應的總體均數(shù)有差別，不說明差別的大小。至于相應總體均數(shù)相差多少，有何專業(yè)意義，那是另一個概念。

2.什么是小概率原理

小概率原理:發(fā)生概率很小的隨機事件(小概率事件)在一次實驗中幾乎是不可能發(fā)生的。

根據(jù)這一原理，可以先假設總體參數(shù)的某項取值為真，也就是假設其發(fā)生的可能性很大，然后抽取一個樣本進行觀察，如果樣本信息顯示出現(xiàn)了與事先假設相反的結(jié)果且與原假設差別很大，則說明原來假定的小概率事件在一次實驗中發(fā)生了，這是一個違背小概率原理的不合理現(xiàn)象，因此有理由懷疑和拒絕原假設;否則不能拒絕原假設。

檢驗中使用的小概率是檢驗前人為指定的。

《精神醫(yī)學雜志》編輯部

Effect of rTMS with different parameters on behavior and level of cerebral BDNF of chronic unpredictable stress model rats．

LI Ziqing，XUE Fen，CHEN Guanjie，et al．Department of Psychosomatic Medicine，Xijing Hospital，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，China

ObjectiveTo investigate the effect of different parameters of rTMS on the behavior and the levels of cerebralBDNF of chronic unpredictable stress ( CUS) model rats.Method64 adult male Sprague Dawley rats were randomly dividedinto sham group ( 8 rats) ，model group ( 8 rats) ，treatment group ( 48 rats averaged into 6 subgroups with different rTMSparameters) . Rats in sham group were treated with fake rTMS for consecutive 7 days after 21－day normal breeding，rats in modelgroup were treated with fake rTMS for consecutive 7 days after successful modeling，and rats in treatment group were treated withrTMS with different parameters according with their subgroup for consecutive 7 days after successful modeling. The body weight ofall rats were recorded weekly. The open field test and forced swimming test were used to evaluate the depression－like behavior.Level of cerebral BDNF was measured by Elisa assay at the end of the study.Results( 1) After successful modeling，therewere significant differences in body weight and immobility time of forced swimming among sham group，model group and treatmentgroup ( P ＜ 0. 01 or 0. 05) . While no significant difference was found between model group and treatment group in body weightand immobility time ( P ＞ 0. 05) . There was no significant difference in distance of horizontal movement among the three groups( P ＞ 0. 05) . ( 2) After the 7－day rTMS or fake rTMS，average body weight in model group was significantly lower than that insham group and in high－frequency treatment group with the parameter of 5 Hz，0. 84 /1. 26 Tesla or 10 Hz，0. 84 /1. 26 Tesla ( P＜ 0. 05) . There was no significant difference in distance of horizontal movement among the three goups，while the immobilitytime of forced swimming was significantly longer in model group than that in sham group and high－frequency treatment group ( P ＜0. 05) . Level of cerebral BDNF in model group was significantly lower than that in sham group，which could be alleviated byrTMS at some parameters. Two－way ANOVA showed that the frequency of rTMS，especially the 5 Hz treatment group，was thekey factor for improving depression－like behaviors and regulating the level of BDNF.ConclusionrTMS with different parametershave different efficacy in improving depression－like behavior of CUS rats. The protein expression of BDNF may be involved in theprocess of improving.

Repetitive transcranial magnetic stimulation ( rTMS) Chronic unpredictable stress ( CUS) Brain derivedneurotrophic factor ( BDNF) Rat

R749.3

A

1009－7201(2014)－02－0123－05

10.3969/j.issn.1009－7201.2014.02.014

2014－01－06)

國家自然科學基金(編號:81171285，81371478)

710032陜西西安，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院

譚慶榮，教授，E－mail:tanqingr@fmmu.edu.cn