鵝毛竹葉提取物抗氧化及酪氨酸酶抑制活性的研究

張 蕾，王 姝，倪勤學(xué)，許光治，高前欣，張有做*

（1. 浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310023；2. 浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310023；

3. 浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 臨安 311300；4. 浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 臨安 311300）

鵝毛竹葉提取物抗氧化及酪氨酸酶抑制活性的研究

張 蕾1,2，王 姝3,4，倪勤學(xué)3,4，許光治3,4，高前欣3,4，張有做3,4*

（1. 浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310023；2. 浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310023；

3. 浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 臨安 311300；4. 浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 臨安 311300）

采用Folin試劑還原比色法、硝酸鋁—亞硝酸鈉比色法和香草醛—冰醋酸比色法測定鵝毛竹葉甲醇提取物及不同極性部位中總酚、總黃酮和三萜的含量，采用DPPH法、ABTS法、FRAP法評價(jià)各提取物的抗氧化能力及還原能力，同時(shí)采用酪氨酸酶催化氧化左旋多巴（L-DOPA）速率法體外測定酪氨酸酶活力。結(jié)果表明：鵝毛竹（Shibataea chinensis）葉乙酸乙酯相的總酚、總黃酮及三萜的含量最高，分別為（28.63±0.19）%、（23.74±0.17）%和（15.27 ±0.67）%；該相在不同抗氧化體系中的抗氧化活性最強(qiáng)，同時(shí)該相抑制酪氨酸酶的活性也最強(qiáng)，其半抑制濃度為3.29 mg/mL；鵝毛竹葉醇提物及其不同極相部位的總黃酮含量與還原力和DPPH、ABTS自由基的清除能力呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.947 0、0.900 1和0.965 3，表明總黃酮是鵝毛竹葉提取物抗氧化活性的主要成分；總酚含量與酪氨酸酶抑制活性呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.991 0，表明總酚是鵝毛竹葉提取物抑制酪氨酸酶活性的主要成分；鵝毛竹葉乙酸乙酯相對酪氨酸酶的抑制作用及抗氧化活性最強(qiáng)，其對酪氨酸酶抑制機(jī)制為可逆的競爭性抑制，其抑制常數(shù)為27.49 mg/mL。

鵝毛竹；竹葉；提取；抗氧化；酪氨酸酶；抑制類型

竹子是非常有利用價(jià)值的植物之一，屬于禾本科竹亞科，是多年生的常綠植物。竹葉里含有豐富的次生代謝物，除纖維素、半纖維素、糖類等物質(zhì)外，還含有許多對人體有益的活性物質(zhì)，如類黃酮、酚酸類、氨基酸肽類、蒽醌類、萜類內(nèi)酯等[1～2]。這些成分具有顯著的抗氧化[3]、抗衰老[4]、抗菌[5]、類SOD活性[6]、阻斷亞硝化反應(yīng)[7]等生理活性。而有關(guān)酪氨酸酶活性抑制的報(bào)道較少，最早由程科軍等[8]在苦竹筍中分離得一個(gè)具有抑制酪氨酸酶活性的氰苷化合物；張永兵等[9]在闊葉箬竹竹葉提取物中分離得具有抑制酪氨酸酶活性的化合物——對羥基肉桂酸乙酯。在我國，竹子品種繁多，分布廣泛，竹葉資源是一種量大而且廉價(jià)的林業(yè)潛在資源，但是經(jīng)過化學(xué)成分分析的竹種不到20種，僅僅占我國竹種數(shù)量的4%左右[10]，而且以往的研究主要集中在剛竹屬的竹種上。倭竹屬鵝毛竹（Shibataea chinensis）由于稈形矮小，被歸為地被竹種，具有開發(fā)成葉用竹林的潛在優(yōu)勢，課題組前期工作比較了6種地被竹種的有效成分含量和抗氧化性能，發(fā)現(xiàn)鵝毛竹具有顯著強(qiáng)于其他竹種的抗氧化性能，具有進(jìn)一步研究的潛力[11]。

本研究對鵝毛竹甲醇提取物及其不同極性部位中的總酚、總黃酮和三萜含量進(jìn)行了測定，并通過清除DPPH·、ABTS+自由基和還原鐵離子的能力評價(jià)了其抗氧化能力，同時(shí)對酪氨酸酶活性的抑制作用也進(jìn)行了初步研究，以期為鵝毛竹資源在食品、化妝品、醫(yī)藥和保健領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品葉采集：鵝毛竹于2011年9月采自浙江省臨安市浙江農(nóng)林大學(xué)的翠竹園竹種質(zhì)資源庫。

主要試劑：酪氨酸酶、DPPH（2,2’-二苯基-1-苦味酰苯肼）、ABTS+購自Sigma公司，純度均大于98%；左旋多巴（L-DOPA）購自阿拉丁公司，純度大于99%；甲醇、乙醇、氯化鐵、硫酸、二甲基亞砜、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等為分析純，水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

DGG-9053AD型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），UV-1800紫外分光光度計(jì)（島津公司），MultiSkan FC型酶標(biāo)儀（Thermo Scientific公司），PHSJ-3F型pH計(jì)（雷磁公司）等。

1.3 樣品的制備

采集新鮮的鵝毛竹葉子，清洗，瀝干，立刻用微波爐（間隙加熱3次，每次1 min），然后置于烘箱中干燥，粉碎，過40目篩，備用。

稱取5.00 g粉末樣品，加入15倍的甲醇熱回流提取2 h，提取3次，趁熱過濾，洗渣，合并濾液，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至浸膏狀，得到醇提取物。將醇提取物用一定體積的蒸餾水充分混懸，加入一定量的石油醚除去蠟質(zhì)、色素、油脂等弱極性物質(zhì)，然后以體積比1：1的溶劑量依次用乙酸乙酯、正丁醇分別萃取3次，分別旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后，得到乙酸乙酯相、正丁醇相以及水相，各相溶液濃縮干燥至恒重，備用。

1.4 總酚含量的測定

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 以對羥基苯甲酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Folin試劑還原比色法[11]測定，精密稱取對羥基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品17.2 mg，無水乙醇溶解，容量瓶定容至50 mL，配成0.344 mg/mL的對羥基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.20、1.60 mL，移入25 mL具塞試管中，分別用無水乙醇稀釋至10.0 mL。各加入1.0 mL Folin試劑和2.0 mL 20% Na2CO3水溶液，在沸水浴上加熱10 min，用水冷卻并稀釋至25 mL。室溫放置30 min，在745 nm的波長處測定吸光度（A）。以A值為縱坐標(biāo)（Y），對羥基苯甲酸的質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：

1.4.2 樣品測定 分別精密量取待測液0.1 mL，按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線中的方法在745 nm處測定A值，并根據(jù)對羥基苯甲酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各試樣的總酚量。

式中：m1為依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出被測液中總酚含量（mg），m為供試品取樣量（mg），V1為待測液分取的體積（mL），V2為待測液的總體積（mL）。

1.5 總黃酮含量的測定

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，參照丁明等人[12]的硝酸鋁—亞硝酸鈉比色法加以改進(jìn)，準(zhǔn)確吸取濃度為150 μg/mL的蘆丁溶液0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL移入10 mL具塞試管中，用無水乙醇定容至5 mL，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置5 min，加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min后加入

2 mL 1.0 mol/L氫氧化鈉溶液，用無水乙醇定容至10 mL，靜置10 min。在波長510 nm處測定A值。以A值為縱坐標(biāo)（Y），以蘆丁的質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：

1.5.2 樣品測定 分別精密量取待測液1.0 mL，在510 nm的波長處測定A值，并根據(jù)蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各試樣總黃酮含量。

式中：m1為依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出被測液中黃酮含量（μg），m為供試品取樣量（g），V1為待測液分取的體積（mL），V2為待測液的總體積（mL）。

1.6 三萜含量的測定

1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 用熊果酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用香草醛—冰醋酸比色法[11]繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品2.5 mg，用無水乙醇溶解，容量瓶定容至25 mL，即得100 μg/mL熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，于加熱狀態(tài)下氮?dú)獯蹈扇軇?，分別加入5%香草醛—冰醋酸0.5 mL，高氯酸0.8 mL，混勻后于65 ℃水浴反應(yīng)15 min，取出放置冰水中冷卻，加冰醋酸5 mL，混勻，在548 nm處測定A值。以在548 nm處測定的A值為縱坐標(biāo)（Y），以熊果酸的質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：

1.6.2 樣品測定 樣品用無水乙醇適度稀釋，分別精密量取不同待測液0.04 mL，在548 nm處測定A值，并根據(jù)熊果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各試樣的三萜量。

式中：m1為依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出被測液中熊果酸含量（μg），m為供試品取樣量（g），V1為待測液分取的體積（mL），V2為待測液的總體積（mL）。

1.7 不同極相抗氧化活性測定

1.7.1 DPPH自由基清除試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取DPPH試劑0.01 g，用甲醇溶解至250 mL量瓶中，搖勻得0.10 mmol/L。分別取0.1 mL待測樣液和3.9 mL DPPH溶液混合搖勻，在室溫下反應(yīng)1 h，517 nm波長下測定A值。以VC作為陽性對照并以甲醇為空白對照，計(jì)算各樣品抑制率。

以待測樣品濃度為橫坐標(biāo)（X），抑制率為縱坐標(biāo)（Y）得待測樣品清除DPPH自由基的關(guān)系曲線。計(jì)算得到待測樣品的半數(shù)抑制濃度（IC50值）。

1.7.2 ABTS+自由基清除試驗(yàn) 取176 μL濃度為140 mM的過硫酸鉀水溶液加入到10 mL濃度為0.384 mg/mL的ABTS+溶液中混合，避光反應(yīng)12 ～ 16 h。

測定之前加入無水乙醇將ABTS+溶液稀釋至吸光值為0.700±0.02（734 nm）下。以無水乙醇為空白試劑將分光光度計(jì)調(diào)零。將3.9 mL的ABTS+溶液與0.1 mL的待測液溶液混合搖勻，在室溫下反應(yīng)6 min，在734 nm波長下測定吸光值（A樣品）。3.9 mL的ABTS+溶液與0.1 mL樣品提取劑為空白對照，測的吸光值（A空白）。以VC作為陽性對照。以待測樣品濃度為橫坐標(biāo)（X），抑制率為縱坐標(biāo)（Y）得待測樣品清除ABTS+自由基的關(guān)系曲線。計(jì)算得到待測樣品的半數(shù)抑制濃度（IC50值）。

1.7.3 FRAP法分析鐵離子還原能力 參照文獻(xiàn)[13]方法，配制相同濃度0.1 mg/mL的樣品溶液，各取0.3 mL加入2.7 mL工作液（0.3 mo1/L醋酸鹽緩沖液25 mL，10 mmol/L TPTZ溶液2.5 mL，20 mmo1/L FeCl3溶液2.5 mL），混勻后在37℃反應(yīng)10 min，于593 nm處測定A值。以70%乙醇溶液做空白對照。準(zhǔn)確量取6.08 mg硫酸亞鐵溶于適量的水中，加入18 mo1/L硫酸0.25 mL，再加水稀釋至50 mL，得0.8 mmol/L的硫酸亞鐵溶液，并置入小鐵釘。依次配制 400、200、100、50、25 μmol/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，以硫酸亞鐵濃度為橫坐標(biāo)（X），A值為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：

將樣品及對照品VC反應(yīng)后的A值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得相應(yīng)的硫酸亞鐵的濃度（μmol/L）定義為FRAP值。

1.8 酪氨酸酶活性抑制

1.8.1 酶活力的測定 底物多巴經(jīng)過酪氨酸酶催化產(chǎn)生多巴醌，多巴醌經(jīng)氧化生成黑色素，在475 nm波長處黑色素有最大吸收峰，其消光系數(shù)為ε=3 700（L·mol－1·cm－1)[14]。酶活力單位（U）定義為：以每分鐘黑色素在475 nm波長的吸光度（OD475）增加0.001為一個(gè)酶活力單位。

酶活力測定參考文獻(xiàn)[15]的方法并加以改進(jìn)：反應(yīng)總體系為200 μL，5 mM L-DOPA溶液20 μL置于試管中，加入pH6.8的磷酸鹽緩沖溶液140 μL，于37℃恒溫水浴鍋中保溫10 min，加入40 μL 250U/mL酪氨酸酶水溶液，并測定一定時(shí)間OD475的變化。

1.8.2 鵝毛竹葉提取物對酪氨酸酶抑制能力的測定 依照酶活力測定方法，以L-DOPA為底物，加入不同濃度的鵝毛竹葉乙酸乙酯相溶液40 μL使其終濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL，在37℃恒溫水浴鍋中各自保溫10 min，加入40 μL酪氨酸酶水溶液于37℃恒溫水浴鍋中各自保溫10 min后測定OD475，實(shí)驗(yàn)平行3次，取其平均值，以熊果苷為陽性對照，以磷酸緩沖溶液為空白對照，根據(jù)抑制物質(zhì)量濃度—酶抑制率回歸方程求得半抑制濃度（IC50）。同樣的方法計(jì)算醇提物、正丁醇相及水相的半抑制濃度。

1.8.3 鵝毛竹葉提取物對酪氨酸酶的抑制作用機(jī)理的測定 在上述鵝毛竹葉乙酸乙酯相不同濃度的酶活性測定體系中，底物多巴濃度5 mM固定不變，分別加入250 U/mL酪氨酸酶溶液0、10、20、30、40 μL，測定加入0、4、6、8、10 mg/mL提取物對酶活力的影響，通過作圖法判斷鵝毛竹葉乙酸乙酯相抑制酪氨酸酶活性的抑制機(jī)制（實(shí)驗(yàn)做3組平行，取其平均值）。

1.8.4 鵝毛竹葉提取物對酪氨酸酶的抑制作用類型和抑制常數(shù)的測定 在鵝毛竹葉乙酸乙酯相不同濃度的酶活性測定體系中，固定體系中酶的濃度不變，分別加入5 mM多巴溶液40、50、66.67、100、200 μL，使底物多巴終濃度的倒數(shù)為5、4、3、2、1 mM－1，測定加入0、1、2、3、4 mg/mL提取物時(shí)，酶活力的變化，抑制類型通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法判斷。抑制常數(shù)Ki和Kis，分別通過雙倒數(shù)圖中直線的斜率和縱軸截距對提取物濃度二次作圖求出[16]。

1.9 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果采用“SPSS 17.0”統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 鵝毛竹葉不同極相中有效成分的含量

鵝毛竹葉醇提物及不同極相中總酚、總黃酮和三萜含量的測定結(jié)果見表1。由表1可知，鵝毛竹葉醇提物的提取率為15.90%，乙酸乙酯相、正丁醇相和水相的提取比例約為 1：2：3。其中醇提物及不同極相中的總酚含量從高到低為乙酸乙酯相 ＞ 正丁醇相 ＞ 醇提物 ＞ 水相，其含量13.74% ～ 28.63%。提取物中總黃酮含量與總酚含量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R2= 0.876 5，總黃酮含量5.27% ～ 23.74%。各提取物中三萜的含量3.75% ～ 15.27%，其含量高低為乙酸乙酯相 ＞ 醇提物 ＞ 正丁醇相 ＞ 水相。

表1 醇提物及不同極相的得率和有效成分的含量（n=3）Table 1 Yield, contents of effective component in the methanol extract and different polarities from S. chinensis %

2.2 鵝毛竹葉不同極相萃取物抗氧化性能的比較

由表2可知，醇提物與不同極性部位對DPPH·和ABTS自由基的清除能力與鐵還原的能力趨勢基本一致。相比陽性對照，醇提物級不同極性部位的抗氧化能力均弱于VC的抗氧化能力，但醇提物與不同極性部位都具有一定的 DPPH自由基和ABTS自由基清除能力，且存在顯著性差異（P＜ 0.05），它們對DPPH自由基和ABTS自由基清除能力大小順序一樣，依次為VC＞乙酸乙酯相＞正丁醇相＞醇提物＞水相。同時(shí)，鵝毛竹葉醇取物及其不同極性部位均表現(xiàn)出不同程度的還原能力，其中乙酸乙酯相的還原力接近與VC的還原力，它們的還原力大小同樣為VC＞乙酸乙酯相＞正丁醇相＞醇提物＞水相。

表2 不同極相的抗氧化活性（n=3）Table 2 Antioxidant activities in different polarities from S. chinensis μg/mL

2.3 不同極相對酪氨酸酶的抑制作用

鵝毛竹葉醇提物及不同極相對酪氨酸酶活性的影響見圖 1。鵝毛竹葉各提取物對酪氨酸酶的抑制作用均低于熊果苷的抑制作用，但均顯示出了一定的酪氨酸酶抑制作用，并對酪氨酸酶活性的抑制作用隨著物質(zhì)的濃度增加而加強(qiáng)，其中乙酸乙酯相和正丁醇相對酪氨酸酶的抑制作用較為明顯，通過回歸方程計(jì)算得出兩者的半抑制濃度（IC50）分別為3.29 mg/mL、5.68 mg/mL，醇提物的半抑制濃度僅次于正丁醇相的半抑制濃度，其IC50為8.30 mg/mL，而水相的半抑制濃度則達(dá)到9.46 mg/mL，同樣的方法得到熊果苷的IC50為1.53 mg/mL。

圖1 抑制率與樣品濃度的關(guān)系Figure 1 Relationship between inhibitory effect and sample concentration

2.4 鵝毛竹葉提取物對酪氨酸酶的抑制作用機(jī)制

以酶活力對酶濃度作圖，如果酶活力的變化圖形是一組平行線，則加入的抑制劑對酶抑制作用是不可逆的過程，如果得到一組相交于原點(diǎn)的直線，則加入的抑制劑對酶的抑制作用是可逆的過程[17]。在底物濃度不變，改變酪氨酸酶濃度時(shí)，酪氨酸酶經(jīng)鵝毛竹葉乙酸乙酯相作用后的剩余酶活力與加入的酶量間的關(guān)系見圖 2，由圖2可知，隨著反應(yīng)體系中乙酸乙酯相的濃度增大，直線斜率逐漸下降，所有直線均通過原點(diǎn)，說明鵝毛竹葉乙酸乙酯相對酪氨酸酶的抑制作用是可逆過程，也即抑制作用是通過鵝毛竹葉乙酸乙酯相和酶結(jié)合有效地抑制了酶活力，從而降低了酶的催化效率，而不是通過減少有效酶量而降低酶活力[18]。

2.5 鵝毛竹葉提取物對酪氨酸酶的抑制作用類型和抑制常數(shù)

進(jìn)一步研究鵝毛竹葉乙酸乙酯相抑制酪氨酸酶活性的作用類型，在測定的體系中，酪氨酸酶的濃度固定不變，改變加入底物多巴的濃度，測定濃度為 0、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL的抑制劑對酶活力的影響，以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法判斷抑制劑的抑制類型，其測定結(jié)果見圖3。由圖3（a）可知，隨著抑制物濃度的增大，所有的直線均相交于縱軸的一點(diǎn)，Km隨著濃度的增大逐漸增大，Vmax則基本保持不變，所以判斷鵝毛竹葉乙酸乙酯相對酪氨酸酶的抑制作用屬于競爭性抑制，表明鵝毛竹葉提取物乙酸乙酯相僅能與游離酶（E）結(jié)合，不能與酶—底物復(fù)合物（ES）結(jié)合。同時(shí)，以圖 3（a）中各直線的斜率對抑制劑的濃度進(jìn)行二次作圖，得到圖3（b），由圖中直線計(jì)算出鵝毛竹葉乙酸乙酯相對酪氨酸酶的抑制常數(shù)Ki= 27.49 mg/mL。

圖2 鵝毛竹葉提取物乙酸乙酯相對酪氨酸酶的抑制機(jī)制Figure 2 Inhibitory mechanism of the ethylacetate extract from leaves of S. chinensis on tyrosinase

圖3 鵝毛竹葉乙酸乙酯相對酪氨酸酶抑制作用類型和抑制常數(shù)Figure 3 Lineweaver-Burk plots for inhibition of ethyl acetate extract from leaves of S. chinensis on tyrosinase

2.6 總酚、總黃酮和三萜含量與抗氧化活性及抑制酪氨酸酶活性的相關(guān)性

鵝毛竹葉醇提物及不同極性部位中有效成分含量與其抗氧化活性、抑制酪氨酸酶活性的相關(guān)性見表3。

由表3可知，鵝毛竹葉醇提物及不同極性部位的總黃酮含量與抗氧化活性存在很大的相關(guān)性，它們的抗氧化活性與總黃酮含量的相關(guān)系數(shù)都在90%以上，因此，可認(rèn)為黃酮是鵝毛竹葉提取物抗氧化的主要成分。其中總酚含量與ABTS自由基清除能力的相關(guān)性略高于總黃酮含量與ABTS自由基清除能力的相關(guān)性，而且提取物中總酚含量與酪氨酸酶抑制能力的相關(guān)性達(dá)到99%以上，這是因?yàn)轾Z毛竹葉提取物中不僅有黃酮，還存在酚酸類物質(zhì)，所以酚酸和黃酮是總酚清除ABTS自由基以及抑制酪氨酸酶活性的主要活性成分。同時(shí)表3中的數(shù)據(jù)顯示，酪氨酸酶抑制能力與抗氧化能力之間呈正相關(guān)，相關(guān)性在90%以上，因此可推斷鵝毛竹葉提取物抑制酪氨酸酶的能力與其抗氧化有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。

表3 鵝毛竹葉醇提物及不同極性部位總酚、總黃酮和三萜含量與抗氧化活性及酪氨酸酶抑制的相關(guān)性Table 3 The correlation between content of total phenols, total flavonoids, triterpenoid and the antioxidant activity, the tyrosinase inhibition in ethanol extract and its different polarities from leaves of S. chinensis

3 討論

天然植物的資源豐富，安全性高，目前從植物資源中提取分離酪氨酸酶抑制劑成為熱點(diǎn)[21]。傅國強(qiáng)等[22]通過對196味中藥對酪氨酸酶活性抑制作用的篩選發(fā)現(xiàn)，光果甘草、牡丹皮、蒼耳子、天麻等20味中藥對酪氨酸酶具有顯著抑制作用。Baurin等[23]以桑葉為對照，對隸屬38個(gè)屬67種熱帶植物抑制酪氨酸酶活性的作用進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)5種熱帶植物也具有抑制酪氨酸酶活性的作用，為研發(fā)熱帶植物酪氨酸酶抑制劑提供了一定的科學(xué)依據(jù)。曾祖平等[24]針對柿葉中對黑素細(xì)胞增殖及酪氨酸酶活性有明顯抑制作用的部位進(jìn)行篩選，研究發(fā)現(xiàn)，柿葉醇提取物低濃度時(shí)對酪氨酸酶的抑制作用強(qiáng)，萃取后所得各組分對酶的抑制作用低于萃取前的醇提物對酶的抑制作用，三氯甲烷組分與乙酸乙酯組分合并后對酶的抑制作用高于萃取前的醇提物，說明柿葉對酪氨酸酶的抑制可能是由不同成分共同作用的結(jié)果。本試驗(yàn)中，以次生代謝物豐富、生物活性廣泛的竹葉提取物為研究材料，研究其對酪氨酸酶活性的抑制作用及其機(jī)理，研究發(fā)現(xiàn)在醇提物及不同極性部位中，隨著提取物濃度的增加，抑制能力隨之增強(qiáng)，其中乙酸乙酯相對酪氨酸酶活性的抑制作用最強(qiáng)，其半抑制濃度為3.29 mg/mL，高于萃取前的醇提物對酶的抑制作用。在相關(guān)性分析中，總酚含量與酶抑制能力的相關(guān)性到達(dá)99%以上，可推測，總酚是鵝毛竹葉提取物中抑制酪氨酸酶活性的主要成分。在對乙酸乙酯相對酪氨酸酶抑制類型的研究中表明，乙酸乙酯相對酪氨酸酶的抑制表現(xiàn)為可逆的競爭性抑制，其抑制常數(shù)Ki = 27.49 mg/mL。

目前，國內(nèi)外普遍認(rèn)為酪氨酸酶抑制劑對該酶的抑制機(jī)理有4種途徑：一是絡(luò)合酪氨酸酶中的銅離子，使銅離子失去對氧的結(jié)合能力，降低酶活性；二是作為強(qiáng)抗氧化劑拮抗氧對酪氨酸酶的激活；三是通過清除氧自由基，削弱酪氨酸酶的供氧作用；四是作為酪氨酸酶的競爭性，抑制酶活性[25]。李娜等[26]從清除自由基和螯合金屬離子兩方面研究了紅花黃酮對酪氨酸酶的抑制及其機(jī)理，研究發(fā)現(xiàn)，紅花黃酮類化合物對DPPH自由基、羥基自由基和超氧自由基均有清除作用，對酪氨酸酶有顯著性。本試驗(yàn)通過測定鵝毛竹葉提取物清除DPPH自由基、ABTS自由基能力及鐵還原能力研究竹葉提取物對酪氨酸酶的抑制機(jī)理。研究發(fā)現(xiàn)，鵝毛竹葉提取物具有清除DPPH自由基、ABTS自由基的能力和鐵還原能力。相關(guān)性分析中，抑制酪氨酸酶活性的能力與抗氧化能力之間呈正相關(guān)，相關(guān)性在90%以上，因此推斷鵝毛竹葉醇提物及不同極性部位對酪氨酸酶的抑制作用可能是通過清除自由基，終止自由基鏈的引發(fā)，削弱酪氨酸酶反應(yīng)過程中的供氧而抑制酪氨酸酶催化活性；但是也存在鵝毛竹葉提取物中的抗氧化劑拮抗了氧氣對酪氨酸酶的激活而降低酪氨酸酶的催化活性的可能性，鵝毛竹葉提取物對酪氨酸酶的具體抑制作用機(jī)制以及具有酪氨酸酶活性的物質(zhì)還有待進(jìn)一步分析研究。而且本文僅對酪氨酸酶進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，尚有待進(jìn)一步對鵝毛竹葉提取物細(xì)分并進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，為鵝毛竹葉的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。同時(shí)，為了綜合開發(fā)利用我國豐富竹葉資源，也為竹葉活性成分在色素障礙性皮膚病的治療、化妝品行業(yè)、食品添加劑等領(lǐng)域的利用提供一定的參考。

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Antioxidant and Inhibitory Activities of Extracts from Leaves of Shibataea chinensis on Tyrosinase

ZHANG Lei1,2，WANG Shu3,4，NI Qin-xue3,4，XU Guang-zhi3,4，GAO Qian-xin3,4，ZHANG You-zuo3,4*
（1. Zhejiang University of Science & Technology, Hangzh ou 310 023, China; 2. Zhejiang P rovincial Key Lab for Chem & Bio P rocessing Technology of A gricultural Products, Hangzhou 31 0023, China; 3. College of A griculture and F ood Science, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China; 4. Key Lab for Quality Improvement of Agricultural Products of Zhejiang, Lin’an 311300, China）

The inhibitory effect on tyrosinase and anti-oxidant activity of methanol extract and its different polarities (ethyl acetate, n-butyl alcohol, water) from leaves of Shibataea chinensis was studied. The contents of total phenols, total flavonoids, and triterpenoids in the extracts were detected by Forint reduction assay reagent, aluminum nitrate-sodium nitrite colorimetry, and vanillin-acetic acid assay. The antioxidative and reducing activities of extracts from leaves of S. chinensis were assessed by DPPH, ABTS and FRAP. Tyrosinase activity was estimated by oxidation rate of L-dopa. The result showed that the contents of total phenols, total flavonoids and triterpenoids from leaves of S. chinensis were found the maximum in the ethylacetate, about 28.63%±0.19%, 23.74%±0.17% and 15.27%±0.67%, and had the best inhibitory effect on tyrosinase and antioxidant activity. Its 50% inhibiting concentration was estimated to be 3.29 mg/mL. In addition, positive correlation was existed between the total flavonoids content and the antioxidant ability to reducing power, DPPH· and ABTS for methanol extract and its polarities, with the correlation coefficient of0.947, 0.9001 and 0.9653. It can be concluded that the total flavonoids content is a main component for the antioxidant activity of extracts from leaves of S. chinensis. Meanwhile, positive correlation was existed between their total phenols content and the inhibitory effect on tyrosinase, with the correlation coefficient of 0.991, indicating that total phenols content is a main component for the inhibitory effect on tyrosinase. The ethylacetate extract from S. chinensis is the best and a reversible competitive inhibitor for the oxidation of L-dopa and the anti-oxidant activity is also the best.

Shibataea chinensis; bamboo leaves; antioxidant activity; tyrosinase; inhibition

S718.43

A

1001-3776（2014）05-0008-08

2014-05-17；

2014-07-01

浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計(jì)劃（2013R412042）；浙江農(nóng)林大學(xué)創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（201201006）

張蕾（1981－），女，浙江浦江人，助理研究員，博士生，從事藥用植物功效成分提取與應(yīng)用；*通訊作者。