人β-NGF基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞對帕金森病大鼠行為學(xué)的影響*

畢 涌， 洪 娟， 林曉濱， 李曉莉， 魏 鵬， 施鎮(zhèn)江， 黃桂琴， 王廷華， 張 旭△

(溫州醫(yī)科大學(xué)1神經(jīng)生物學(xué)重點學(xué)科，2附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，3附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，浙江溫州 325000;4昆明醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所，云南昆明 650031)

人β-NGF基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞對帕金森病大鼠行為學(xué)的影響*

畢 涌1，2， 洪 娟3， 林曉濱2， 李曉莉2， 魏 鵬4， 施鎮(zhèn)江4， 黃桂琴4， 王廷華4， 張 旭1，2△

(溫州醫(yī)科大學(xué)1神經(jīng)生物學(xué)重點學(xué)科，2附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，3附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，浙江溫州 325000;4昆明醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所，云南昆明 650031)

目的：探討腦內(nèi)移植人β-神經(jīng)生長因子(β-NGF)基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)對帕金森病(PD)模型大鼠行為學(xué)的影響。方法：將成功制備的PD大鼠模型按隨機數(shù)字法分為β-NGF基因修飾的MSCs移植組(β-NGF-MSCs組)、MSCs移植組(MSCs組)、DMEM/F12培養(yǎng)液紋狀體內(nèi)注射組(DMEM/F12組)和非移植組(PD模型組)。細胞移植后，動態(tài)觀察PD模型大鼠行為學(xué)變化及腦組織形態(tài)學(xué)的變化。結(jié)果：β-NGF基因修飾的MSCs腦內(nèi)移植能有效改善PD模型大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)。細胞移植術(shù)后第2周、第4周和第6周，β-NGF-MSCs組在阿樸嗎啡誘發(fā)下30 min內(nèi)的平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)均明顯低于MSCs組和PD模型組(P＜0.05)。DMEM/F12組和PD模型組的旋轉(zhuǎn)行為手術(shù)前后比較無明顯變化(P＞0.05)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，移植細胞在PD模型大鼠腦內(nèi)均能存活，并能夠與宿主組織產(chǎn)生整合，具有良好的組織相容性;宿主的腦組織結(jié)構(gòu)無破壞，無膠質(zhì)瘢痕形成。PD模型大鼠紋狀體內(nèi)移植β-NGF基因修飾的MSCs后，可持續(xù)穩(wěn)定表達β-NGF，其對PD模型大鼠旋轉(zhuǎn)行為的改善明顯優(yōu)于單純應(yīng)用MSCs移植治療。結(jié)論：β-NGF基因修飾的MSCs腦內(nèi)移植能明顯改善PD模型大鼠行為學(xué)癥狀，具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

帕金森病;神經(jīng)生長因子;骨髓間充質(zhì)干細胞;基因治療

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷在帕金森病(Parkinson disease，PD)的進展過程中持續(xù)不斷地發(fā)生，對PD的治療關(guān)鍵在于防止病情進展、修復(fù)和延緩多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元的損害，細胞和基因治療是實現(xiàn)這一目標的最佳途徑之一［1-2］。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，MSCs)具有免疫原性弱、體外基因轉(zhuǎn)染率高、能穩(wěn)定高效表達外源基因等優(yōu)點，是作為細胞和基因治療種子細胞的理想選擇［3］。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠的MSCs能穩(wěn)定表達GFP，是MSCs研究中良好的示蹤工具［4］。

神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)是一類對神經(jīng)元存活、生長發(fā)育和損傷修復(fù)有重要作用的多肽小分子蛋白質(zhì)，并且參與維系神經(jīng)、免疫和內(nèi)分泌系統(tǒng)之間的平衡［2，5］。然而，由于其受體分布廣泛，半衰期短，不能有效通過血腦屏障，在腦內(nèi)很快降解，需要持續(xù)給藥維持效果，使其在臨床的應(yīng)用受到明顯限制［6］。近來，將神經(jīng)營養(yǎng)因子基因修飾的干細胞用于移植治療的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，為NGF臨床治療提供了可能［7-9］。β亞單位是NGF完整的生物活性單位，分子量較小，相對于完整的NGF分子更易于透過血腦屏障。因此，本研究將重組β-NGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的MSCs，再進行腦內(nèi)移植治療PD模型大鼠，觀察其行為學(xué)及腦組織形態(tài)學(xué)的變化，為PD的基因治療探索一種新的方法。

材料和方法

1 動物和試劑

GFP轉(zhuǎn)基因小鼠和pcDNA3-β-NGF質(zhì)粒重組體由昆明醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所提供。DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自Gibco;胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自HyClone。G418和β-NGF抗體購自Sigma;脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自Gibco;二步法免疫組化試劑盒購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

2 GFP轉(zhuǎn)基因小鼠MSCs的體外培養(yǎng)和生物學(xué)鑒定

獲取GFP轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓，分離MSCs進行原代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)后，CD44、CD54和CD45抗體分別對原代培養(yǎng)3 d及傳代培養(yǎng)至第5代的MSCs進行免疫細胞化學(xué)染色鑒定［10］。

3 方法

3.1 重組β-NGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GFP轉(zhuǎn)基因小鼠MSCs用脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000將重組質(zhì)粒 pcDNA3-β-NGF轉(zhuǎn)染到 GFP轉(zhuǎn)基因小鼠 MSCs，通過GF418進行篩選，以β-NGF抗體進行免疫細胞化學(xué)染色檢測β-NGF的表達。先用4%多聚甲醛固定細胞20 min，再用0.01 mol/L PBS液洗去固定液，DAB顯色后光鏡下觀察。其中I抗稀釋度為1∶1 000，陰性對照組以0.01 mol/L PBS液代替I抗。

3.2 β-NGF基因修飾MSCs表達產(chǎn)物的生物學(xué)活性鑒定 將新生小鼠海馬神經(jīng)元按1×106個細胞密度接種在涂有多聚賴氨酸的35 mm培養(yǎng)皿中，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)。2 d后將已收集備用的各組轉(zhuǎn)染細胞上清液與含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液按1∶1的比例分別加入新生小鼠海馬神經(jīng)細胞培養(yǎng)皿中，觀察各組細胞生長情況。

3.3 PD大鼠模型的制備 通過隨機數(shù)表將68只SD大鼠(2～3個月齡，180～230 g，雌雄不限)隨機分為2組，其中6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA;Sigma)實驗組62只，對照組6只。參照大鼠立體定位圖譜，采用單側(cè)紋狀體內(nèi)兩點注射6-OHDA法制作PD大鼠模型，對照組6只注射生理鹽水。分別在術(shù)后1、2、4、6、8和10周于頸部皮下注射0.1%阿樸嗎啡(apomorphine，APO;Sigma，1 mL/kg)，誘發(fā)大鼠向健側(cè)的單向旋轉(zhuǎn)行為，PD模型旋轉(zhuǎn)檢測儀記錄動物向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)情況，旋轉(zhuǎn)360°為1次，每次記錄30 min。一般認為，平均旋轉(zhuǎn)次數(shù)≥7 turns/min為成功的PD大鼠模型。

3.4 PD模型大鼠腦內(nèi)的細胞移植 47只成功復(fù)制PD模型的大鼠按隨機數(shù)表分為4組:重組β-NGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MSCs移植組(β-NGF-MSCs組)和MSCs移植組(MSCs組)，每組17只;DMEM/F12培養(yǎng)液紋狀體內(nèi)注射組(DMEM/F12組)7只;非移植組(PD模型組)6只。向β-NGF-MSCs組和MSCs組的大鼠右側(cè)紋狀體分別注入5 μL細胞懸液，每點植入的MSCs細胞數(shù)約5×105個。DMEM/F12組以等體積DMEM/F12培養(yǎng)液代替細胞同法注入右側(cè)紋狀體，PD模型組麻醉后不作任何移植處理。

3.5 移植后的行為學(xué)檢測 移植后的1、2、4和6周，各組動物均予頸部皮下注射0.1%阿樸嗎啡1 mL/kg，誘發(fā)大鼠向健側(cè)的單向旋轉(zhuǎn)行為。阿樸嗎啡注射后30 min開始計數(shù)旋轉(zhuǎn)行為，旋轉(zhuǎn)360°為1次，并對統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行分析。

3.6 移植細胞的熒光及免疫組織化學(xué)染色觀察

利用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)及移植細胞自身能發(fā)出熒光的特點于術(shù)后不同時段觀察移植細胞在 β-NGF-MSCs組動物腦內(nèi)存活及表達β-NGF的情況。每次從每組動物中隨機選出2只大鼠，分別于移植后的1 d、2周、4周及6周在腹腔麻醉下灌注，取紋狀體和黑質(zhì)部分腦片進行觀察。用4%多聚甲醛灌注固定，取腦后將其置于同樣固定液中固定6 h，然后移入含20%蔗糖的溶液內(nèi)，-20℃恒溫連續(xù)冠狀切片，片厚20 μm。將細胞移植組切片置于熒光顯微鏡下觀察并予以攝片記錄。GFP轉(zhuǎn)基因小鼠MSCs自身可發(fā)出熒光，觀察到的熒光細胞即是植入后存活的細胞。于移植后4周及6周取移植區(qū)腦組織切片進行β-NGF免疫組化染色，DAB顯色后熒光顯微鏡下觀察β-NGF陽性細胞的組織分布。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 PD模型大鼠行為學(xué)評價

實驗組62只SD大鼠中共47只成為PD大鼠模型，成功率75.8%，主要表現(xiàn)為運動遲緩、少動、豎毛、躬身、尾僵、頭偏斜、嗅探等;術(shù)后1周可觀察到偶發(fā)的旋轉(zhuǎn)行為，但不超過3 turns/min。術(shù)后4周共有47只大鼠出現(xiàn)穩(wěn)定的超過7 turns/min的旋轉(zhuǎn)行為，3只未出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為，10只旋轉(zhuǎn)行為＜7 turns/ min，2只術(shù)后死亡。對照組術(shù)后一直未誘發(fā)出旋轉(zhuǎn)行為。

2 β-NGF在GFP轉(zhuǎn)基因小鼠MSCs中的表達

G418篩選的重組β-NGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的陽性克隆細胞經(jīng)DAB顯色后，在光鏡下觀察均呈棕色的陽性反應(yīng)，其余細胞未見陽性反應(yīng)，見圖1A、B。重組β-NGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MSCs上清液與新生小鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)3 d后，在倒置相差顯微鏡下觀察顯示細胞存活良好，胞體長出明顯的突起;pcDNA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MSCs組及其它各組上清液與新生小鼠海馬神經(jīng)元共培養(yǎng)后，神經(jīng)元胞體呈圓形，沒有明顯的突起，見圖1C、D。這表明重組β-NGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MSCs培養(yǎng)上清液中的產(chǎn)物可促進新生小鼠海馬神經(jīng)元的突起生長，具有明顯的生物學(xué)活性。

Figure 1.Biological characteristics of MSCs modified by human β-nerve growth factor(β-NGF)gene.A:immunopositive expression of β-NGF in genetically modified MSCs;B:negative expression of β-NGF in MSCs without genetic modification;C:neonatal mouse hippocampal neurons cultured with the cultural supernatant of MSCs transfected with pcDNA3-β-NGF;D:neonatal mouse hippocampal neurons cultured with the cultural supernatant of MSCs transfected with pcDNA3.Scale bar=100 μm.圖1 重組β-NGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MSCs的生物學(xué)活性鑒定

3 移植細胞在腦內(nèi)的分布與存活

β-NGF-MSCs組大鼠于移植點及鄰近部位均可觀察到熒光細胞，并可看到針道周圍組織內(nèi)有明顯的細胞遷移。移植后4周可見針道已大部分愈合，針道周圍及充填的組織內(nèi)均可見大量的熒光細胞。移植后6周見針道完全愈合，移植點及周圍組織仍可見熒光細胞，未見明顯膠質(zhì)瘢痕形成，表明外源性MSCs能在PD大鼠紋狀體內(nèi)存活并與周圍組織建立良好的整合，見圖2。

Figure 2.The distribution and survival of β-NGF gene-modified MSCs 1 day(A)，1 week(B)，4 weeks(C)and 6 weeks(D)after transplantation.Scale bar=100 μm.圖2 重組β-NGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MSCs移植后在PD大鼠腦內(nèi)的分布和存活

4 腦內(nèi)移植細胞β-NGF的表達

β-NGF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，在重組β-NGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MSCs移植側(cè)黑質(zhì)紋狀體區(qū)域內(nèi)有明顯呈彌漫分布的藍黑色陽性染色，可見較多 β-NGF免疫陽性細胞圍繞移植注射位置周圍，分布在移植側(cè)紋狀體內(nèi)，見圖3。離移植位置越近，陽性細胞密度越高，較遠位置則比較稀疏，與移植干細胞的遷移規(guī)律相吻合。在移植后4周及6周均可見β-NGF染色陽性的熒光細胞，表明重組β-NGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MSCs在PD模型大鼠紋狀體內(nèi)存活并持續(xù)表達β-NGF，見圖3B、D。

Figure 3.Immunohistochemical staining of β-NGF in PD rat brain tissues after transplantation of β-NGF gene-modified MSCs.A，B: 4 weeks after transplantation;C，D:6 weeks after transplantation.A，C:fluorescence microscopy;B，D:bright-field microscopy.Scale bar=100 μm.圖3 重組β-NGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MSCs在PD大鼠腦內(nèi)移植后β-NGF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

5 表達β-NGF的MSCs移植對PD模型動物行為學(xué)的影響

β-NGF-MSCs組和MSCs組在移植后2周，活躍程度、范圍和自主覓食能力均較DMEM/F12組和PD模型組增加，移植后4周達到最佳狀態(tài)。移植的2組PD大鼠在APO誘發(fā)后出現(xiàn)恒定左向旋轉(zhuǎn)，移植術(shù)前平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);而術(shù)后4周及6周，2組的平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)較DMEM/F12組和PD模型組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。β-NGF-MSCs組和MSCs組間比較，平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。DMEM/F12組和PD模型組的旋轉(zhuǎn)行為手術(shù)前后比較無明顯變化(P＞0.05)，見表1。

表1 阿樸嗎啡誘發(fā)各組大鼠旋轉(zhuǎn)行為的實驗結(jié)果Table 1.The results of apomorphine-induced rotation(turns/min.Mean±SD)

討論

治療PD的關(guān)鍵是防止病情進展，修復(fù)已損害的DA能神經(jīng)元，延緩不可逆損害的發(fā)生。目前臨床以左旋多巴進行遞質(zhì)替代治療，只能部分改善帕金森病的早期癥狀，不能阻止DA能神經(jīng)元的持續(xù)變性。新興的基因治療和干細胞移植方法在臨床前動物實驗中顯示出良好的治療效果，已進行的少數(shù)臨床實驗也顯示一定的療效，這為PD的治療帶來新的希望［1-3］。

NGF主要由α、β和γ亞單位組成，不僅對神經(jīng)細胞的生長、發(fā)育、分化起著重要的調(diào)節(jié)作用，還能提高損傷部位的神經(jīng)遞質(zhì)酶活性，對PD、老年性癡呆、脊髓損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有治療作用［2］。汪軍兵等［11］研究顯示，NGF可通過抑制c-Jun氨基端激酶通路的活化，拮抗6-羥基多巴胺所誘導(dǎo)的PD模型大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞的凋亡。然而，NGF不能有效通過血腦屏障，在腦內(nèi)很快降解，需要持續(xù)給藥維持效果，且由于人體廣泛存在NGF受體，易出現(xiàn)明顯副作用［6］。因此，選擇合適的給藥方式向靶部位持續(xù)給藥顯得十分重要。將細胞替代治療和NGF的神經(jīng)營養(yǎng)能力聯(lián)合應(yīng)用可能是比較理想的給藥方式。

研究顯示，MSCs腦內(nèi)移植可與損傷的細胞融合，替代受損細胞重建神經(jīng)功能區(qū)和傳導(dǎo)通路，減輕PD大鼠模型的運動功能障礙，緩解和逆轉(zhuǎn)病情［1，3］。β亞單位是NGF完整的生物活性單位，不僅對神經(jīng)細胞分化和生長具有有效的神經(jīng)營養(yǎng)作用，還可誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)元分化和生長［7］。因此，將重組β-NGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MSCs移植治療PD，不僅可持續(xù)表達β-NGF發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)作用，還有助于增加移植細胞的存活率，提高移植的效率，可能對PD的治療更加有益。

GFP轉(zhuǎn)基因小鼠MSCs表達綠色熒光蛋白，較好地解決了細胞標記問題，便于觀察生物學(xué)變化。本研究顯示，重組β-NGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的GFP轉(zhuǎn)基因小鼠MSCs培養(yǎng)上清液中的產(chǎn)物可促進新生小鼠海馬神經(jīng)元的突起生長，具有明顯的生物學(xué)活性，其效果優(yōu)于單獨使用MSCs對神經(jīng)元的生長作用。丁潔等［7］的研究顯示，NGF轉(zhuǎn)染MSCs不僅可高效表達目的蛋白，還可促進MSCs向神經(jīng)元方向分化。由此可見，β-NGF轉(zhuǎn)染MSCs后移植治療 PD可能具有協(xié)同作用。

本研究中，在移植后2周，動物行為學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)β-NGF-MSCs組和MSCs組的平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)比PD模型組明顯降低，說明MSCs的移植可在短時間內(nèi)緩解PD癥狀，與黃月等［8］的研究一致。移植后4和6周的研究結(jié)果顯示，β-NGF-MSCs組和MSCs組的平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)較PD對照組明顯減少，說明MSCs能夠長期改善PD癥狀;2組間比較結(jié)果顯示重組質(zhì)粒β-NGF轉(zhuǎn)染MSCs移植治療PD的作用優(yōu)于單獨應(yīng)用MSCs移植治療，提示β-NGF轉(zhuǎn)染MSCs后移植治療可協(xié)同改善PD臨床癥狀。

Blandini等［12］的研究顯示，MSCs腦內(nèi)移植后可與損傷細胞融合，替代受損細胞，重建DA能神經(jīng)元功能區(qū)。Cova等［13］和Kim等［14］研究發(fā)現(xiàn)MSCs還可通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子和抗炎等機制對DA能神經(jīng)元產(chǎn)生保護作用。另一些研究則發(fā)現(xiàn)VEGF和GDNF基因修飾的MSCs移植治療PD的效果優(yōu)于單純應(yīng)用 MSCs治療［15-16］。因此，MSCs具有作為PD細胞和基因治療種子細胞的獨特優(yōu)勢，移植的MSCs可在體內(nèi)分化為神經(jīng)細胞，分泌具有免疫調(diào)節(jié)功能的因子，使變性的DA能神經(jīng)元得到一定程度的再生和修復(fù)。

Isao等［17］的研究表明，表達 β-NGF的細胞在PD模型鼠腦內(nèi)的移植能夠提供良好的治療效果。本研究結(jié)果顯示，不僅外源性的MSCs能在PD大鼠紋狀體內(nèi)存活并與周圍組織建立良好的整合，而且重組β-NGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MSCs在PD模型大鼠紋狀體內(nèi)存活并持續(xù)表達β-NGF，兩者共同的保護作用改善了PD模型大鼠的癥狀。這可能是因為β-NGF轉(zhuǎn)染MSCs后能夠持續(xù)、穩(wěn)定表達，并對DA能神經(jīng)元產(chǎn)生營養(yǎng)、支持和保護作用，同時也可能使一些具有分化潛能的前體細胞在β-NGF和MSCs分泌的細胞因子的共同作用下誘導(dǎo)、分化成新的 DA能神經(jīng)元。

近來，流行病學(xué)和遺傳學(xué)研究顯示炎癥在PD的病理機制中具有重要作用，臨床前動物實驗也證實:炎癥可能是引起多種病理機制級聯(lián)反應(yīng)最終導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元變性缺失的主要因素［18-19］。研究顯示，NGF可調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境，通過下調(diào)浸潤T淋巴細胞IFN-γ分泌和促進神經(jīng)膠質(zhì)細胞中IL-10的表達，誘導(dǎo)抗炎作用［5］。這也可能與β-NGF轉(zhuǎn)染MSCs后移植治療可改善PD臨床癥狀的作用相關(guān)，未來可對此作進一步深入研究。

本研究結(jié)果顯示，重組β-NGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MSCs移植治療后，PD模型動物的行為學(xué)得到顯著改善，同時移植的細胞6周后在紋狀體內(nèi)仍然存活并表達β-NGF蛋白，為今后從轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用NGF治療PD提供了重要的實驗依據(jù)。應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在PD腦內(nèi)持續(xù)表達β-NGF來治療PD是一種重要的轉(zhuǎn)基因細胞移植治療策略，通過這種嶄新的治療方法可以有效控制PD的病理進程，改善患者的臨床癥狀，恢復(fù)受損腦區(qū)的功能，從而更徹底地解除患者的痛苦。

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Effect of human β-NGF gene-modified bone marrow-derived mesenchymal stem cells on rotational behavior of rats with Parkinson disease

BI Yong1，2，HONG Juan3，LIN Xiao-bin2，LI Xiao-li2，WEI Peng4，SHI Zhen-jiang4，HUANG Gui-qin4，WANG Ting-hua4，ZHANG Xu1，2
(1Department of Neurobiology，2Department of Neurology，The First Affiliated Hospital，3Department of Otolaryngology，The First Affiliated Hospital，Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China;4Institute of Neuroscience，Kunming Medical College，Kunming 650031，China.E-mail:drzhangxu@live.cn)

AIM:To investigate the effect of human β-nerve growth factor(β-NGF)gene-modified bone marrow-derived mesenchymal stem cells(MSCs)transplantation on the rotational behavior improvement in a rat model of Parkinson disease(PD).METHODS:The rat model of PD was established successfully and the animals were divided into 4 groups:β-NGF-MSCs group(transplanted with 5×105β-NGF-engineered MSCs)，MSCs group(transplanted with 5×105MSCs)，DMEM/F12 group(5 μL transplantation medium was injected in the right striatum of the rats)and PD model group(without transplantation).The rotational scores were assessed 2 weeks，4 weeks and 6 weeks after transplantation.At different time points after transplantation，the rats were tested for apomorphine(APO)-induced rotational behavior and the brains of the PD model rats were examined by fluorescence microscopy and immunohistochemical staining.RESULTS:Transplantation of human β-NGF gene-modified MSCs effectively improved the behavioral performance in the rats.At the 2nd，4th and 6th weeks after cell transplantation，the rotational frequencies after injection of APO decreased significantly in β-NGF-MSCs group compared with MSCs group and PD group(P＜0.05).Both β-NGF gene-modified MSCs and MSCs survived in the brains of PD model rats，had good compatibility with the host cells，and showed no signs of destroying thehost and the glial cicatrisation.The β-NGF gene-modified MSCs expressed β-NGF stablely in the brains of PD model rats，and showed obvious improvement of the rotational behavior in the PD model rats induced by APO compared with MSCs group.CONCLUSION:The behavior of the rats with PD is significantly improved by transplanting β-NGF-modified MSCs in right striatum，and β-NGF gene therapy has potential clinical value.

Parkinson disease;Nerve growth factor;Bone marrow-derived mesenchymal stem cells;Gene therapy

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.016

1000-4718(2014)03-0473-06

2013-08-20

2014-01-14

浙江省高?！笆濉鄙窠?jīng)生物學(xué)重點學(xué)科(No.204-071006);浙江省自然科學(xué)基金資助項目(No.Y2101091);

溫州市科技計劃項目(No.Y20100275;No.Y20130223)

△通訊作者Tel:0577-55579371;E-mail:drzhangxu@live.cn