多發(fā)性硬化患者外周血CD4及共刺激分子CD28表達(dá)變化

譚納宇，楊 樂，王瑩瑩，萬 超，于澤洋，何金婷＊，徐忠信＊

多發(fā)性硬化患者外周血CD4及共刺激分子CD28表達(dá)變化

譚納宇1，楊 樂2，王瑩瑩1，萬 超1，于澤洋1，何金婷1＊，徐忠信1＊

（1．吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林長春130033；2．吉林省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，吉林長春130021）

目的 探討CD4和CD28在多發(fā)性硬化患者中的表達(dá)變化。方法 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測29例多發(fā)性硬化患者外周血CD4＋、CD28＋、CD4＋CD28＋的表達(dá)變化，采用EDSS量表對MS患者進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評分。結(jié)果 復(fù)發(fā)期MS患者CD4＋表達(dá)明顯高于緩解期MS和對照組，緩解期MS患者外周CD4＋細(xì)胞明顯表達(dá)高于對照組；復(fù)發(fā)期MS患者CD28＋表達(dá)明顯低于緩解期，緩解期明顯低于對照組；CD4＋CD28＋三組比較無統(tǒng)計學(xué)差異；重度MS患者外周血CD4＋表達(dá)高于中度，重度MS患者外周血CD28＋表達(dá)低于中度，而CD4＋CD28＋表達(dá)二組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論 多發(fā)性硬化患者CD4＋表達(dá)水平升高，CD28＋表達(dá)水平降低，CD28＋可能促進(jìn)CD4＋T淋巴細(xì)胞活化。

多發(fā)性硬化T細(xì)胞CD4CD28

（Chin J Lab Diagn，2014：18：0210）

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是臨床較常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，但其確切發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。研究表明CD4、CD8T淋巴細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均參與 MS炎性反應(yīng)［1］，大量研究提出了體液免疫、病毒感染、遺傳傾向、環(huán)境因素及個體易感因素綜合作用的多因素病因?qū)W說。近年研究發(fā)現(xiàn)，血液中CD4＋T細(xì)胞亞群的大量誘導(dǎo)及其對病灶部位的主動入侵，均能加速誘發(fā)組織損傷，CD28是激發(fā)T細(xì)胞反應(yīng)的重要分子。本研究對MS患者CD4T淋巴細(xì)胞及CD28的表達(dá)進(jìn)行檢測，同時采用EDSS量表對MS患者進(jìn)行功能評分，觀察MS患者CD4、CD28表達(dá)與MS患者病情復(fù)發(fā)緩解的關(guān)系，以期對MS患者病情嚴(yán)重程度監(jiān)測起到一定的指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1．1 一般資料

全部病例來自吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科患者。MS患者均符合Poser診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］，所有患者均為臨床確診的復(fù)發(fā)緩解型MS，共計29例，其中男6例，女23例，年齡18－61歲，平均36．6± 10．5，病程5個月至11年，復(fù)發(fā)次數(shù)1－7次。

1．2 研究對象及分組

所有MS患者及對照組均無其他自身免疫病、組織損傷、腫瘤、遺傳變性疾病，其中MS復(fù)發(fā)組：19例，MS緩解組：10例，對照組：18例為同期健康體檢者。以上各組間性別及年齡分布無顯著差異性。

1．3 EDSS功能評分

多發(fā)性硬化傷殘功能采用EDSS評分（Kurtzke標(biāo)準(zhǔn)）［3］。據(jù)MS患者病損程度分類，中度（1－5分）13例，重度（5分以上）16例。

1．4 CD4＋、CD28＋及CD4＋CD28＋檢測

單克隆抗體分別為CD4－PE為藻紅蛋白熒光素標(biāo)記和CD28－FITC為異硫氰熒光素標(biāo)記，夠自法國Immunotech公司，檢測方法為流式細(xì)胞術(shù)（美國Beckman－Coulter ELITE型流式細(xì)胞儀）

血液樣本用EDTA抗凝管抽取，收集靜脈血3 ml，在測定管中加入全血100μl，避光30min、溶血10min裂解紅細(xì)胞、然后加入不同熒光素標(biāo)記的anti－CD4，CD28的抗體，室溫下混勻，離心（1 000 rpm，10min）、PBS 1．0ml（0．1MpH7．4）洗滌、離心（1 500rpm，5min）、棄上清、加0．6ml PBS（0．1MPH7．4），上機(jī)檢測分析。

1．5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16．0軟件包處理，計量資料以_x±s表示，多組之間均數(shù)比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2．1 患者外周血CD4＋、CD28＋、CD4＋CD28＋表達(dá)變化

復(fù)發(fā)期、緩解期、對照組CD4＋表達(dá)水平分別為50．62±8．42、37．91±7．45、30．68±7．29，CD8＋表達(dá)水平分別為42．22±6．29、49．38±7．52、54．79± 7．43，CD4＋CD28＋，20．34±5．63、22．46±5．87、23．15±6．59。結(jié)果表明，復(fù)發(fā)期MS患者CD4＋表達(dá)水平高于緩解期MS患者和對照組，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．05），緩解期CD4＋表達(dá)水平高于對照組。復(fù)發(fā)期CD28＋表達(dá)水平低于緩解期MS和對照組（P＜0．05），緩解期CD28＋表達(dá)水平亦低于對照組（P＜0．05），三組CD4＋CD28＋表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05），見圖1。

圖1 MS患者外周血CD4＋、CD28、CD4＋CD28＋表達(dá)變化（%）

2．2 不同病情嚴(yán)重程度患者外周血CD4＋、CD28＋、CD4＋CD28＋表達(dá)變化

外周血CD4＋、CD28＋、CD4＋CD28＋表達(dá)，EDSS中度分別為47．67±6．42 49．27±8．32 22．13 ±5．87，EDSS重度度分別為54．54±6．79、42．76± 7．64、24．24±6．56。結(jié)果表明，重度患者CD4＋表達(dá)水平高于中度（P＜0．05），重度患者CD28＋表達(dá)水平低于中度（P＜0．05），二組CD4＋CD28＋表達(dá)水平比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05），見圖2。

圖2 不同病損程度MS患者CD4＋、CD28＋、CD4＋CD28＋表達(dá)變化（%）

2．3 患者CD4＋和CD28＋表達(dá)相關(guān)性分析

相關(guān)分析顯示，多發(fā)性硬化患者CD4＋表達(dá)水平與CD28＋表達(dá)水平具有正相關(guān)性，r＝0．77（P＜0．01）。

3 討論

多發(fā)性硬化（MS）是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘病變?yōu)樘攸c，遺傳易感個體與環(huán)境因素作用發(fā)生的自身免疫性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，患有多發(fā)性硬化癥的患者腦和脊髓中出現(xiàn)持久的組織損傷可能是由于誤導(dǎo)的殺傷性T細(xì)胞失去控制所致。MS是以神經(jīng)纖維髓鞘損傷和軸突破壞、電脈沖傳導(dǎo)性減弱、分散投射為特點的炎性病變［4］。MS被認(rèn)為是人體的正常防御病原體機(jī)制的崩塌因而出現(xiàn)自我攻擊，由于T細(xì)胞識別來源于病原體，髓鞘或其它來源的的蛋白質(zhì)，需要其他細(xì)胞將目標(biāo)蛋白質(zhì)分解成稱為肽的小片段，然后在特定的分子包將肽段遞呈給T細(xì)胞［5］，并已確定參與MS的病理過程中遞呈髓鞘蛋白的T細(xì)胞即CD4＋T細(xì)胞在MS的髓鞘損傷中發(fā)揮了重要的作用，在人類MS在動物模型的實驗性自身免疫性腦炎中，CD4＋T細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中占有顯著的比例。在T淋巴細(xì)胞的激活過程中，如沒有共刺激信號存在，T細(xì)胞呈無反應(yīng)或免疫耐受，若共刺激信號表達(dá)狀態(tài)異常，可發(fā)生自身反應(yīng)性T細(xì)胞激活或自身免疫反應(yīng)［6］。CD28分子是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的能促使T細(xì)胞活化最重要的共刺激分子，屬于免疫球蛋白超家族成員，表達(dá)于靜止的CD4＋和CD8＋T細(xì)胞，與其配體結(jié)合后對免疫應(yīng)答的啟動、維持和下調(diào)中都起著非常重要的作用［7］。

本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測28例MS患者T淋巴細(xì)胞表面分子CD4＋、CD28＋、CD4＋CD28＋，結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)期MS患者CD4＋表達(dá)水平高于緩解期MS和對照組，緩解期CD4＋表達(dá)水平高于對照組，CD28＋表達(dá)水平復(fù)發(fā)期低于緩解期，緩解期低于對照組。EDSS是臨床應(yīng)用最普遍的多發(fā)性硬化的評估量表，也是臨床試驗中廣泛采用的評價指標(biāo)。EDSS評分以中樞神經(jīng)系統(tǒng)八個功能系統(tǒng)的評價為基礎(chǔ)，分級從正常（0分）到最嚴(yán)重缺損（5－6分）變化，此外，還有行動能力和日常生活限制的評定。本研究應(yīng)用EDSS量表對MS患者進(jìn)行傷殘評分，按評分將MS患者分為中、重度，對不同病損程度MS患者外周血CD4＋及CD28＋表達(dá)水平進(jìn)行了比較分析，結(jié)果顯示，重度MS患者外周血CD4＋表達(dá)高于中度，重度MS患者外周血CD28＋表達(dá)低于中度，相關(guān)分析顯示，CD4＋、CD28＋的表達(dá)可能與多發(fā)性硬化病情的嚴(yán)重程度有關(guān)。

目前關(guān)于多發(fā)性硬化治療的目的是控制疾病的嚴(yán)重程度或減少復(fù)發(fā)次數(shù)以延緩神經(jīng)功能損傷的進(jìn)展，本研究探討CD4＋和CD28＋等免疫細(xì)胞在MS中的作用，期待發(fā)現(xiàn)可能防止或控制疾病的治療靶標(biāo)或找到利用人體自身的保護(hù)機(jī)制的途徑，這可能會產(chǎn)生具有高度特異性的治療方法，可避免廣泛的免疫抑制如糖皮質(zhì)激素或氨甲喋呤等產(chǎn)生的副作用。

［1］Zhang X，Tao Y，Ahn M，Marcus KL，Differential Reconstitution of T Cell Subsets following Immunodepleting Treatment with Alemtuzumab（Anti－CD52Monoclonal Antibody）in Patients with Relapsing－Remitting Multiple Sclerosis［J］．J Immunol 2013，191（12）：5867．

［2］Cerosaletti K，Schneider A，Schwedhelm K，Multiple Autoimmune－Associated Variants Confer Decreased IL－2RSignaling in CD4（＋）CD25TCells of Type 1Diabetic and Multiple Sclerosis Patients．［J］．PLos One，2013，8（12）：83811．

［3］Trinschek B，Lussi F，Haas J，Wildemann B，Kinetics of IL－6production defines T effector cell responsiveness to regulatory T cells in multiple sclerosis［J］．PLos One 2013 14；8（10）：7634．

［4］Buntinx M，Ameloot M，Steels P，et al．Interferon－gamma－induced calcium influx in T lymphocytes of multiple sclerosis and rheumatoid arthritis patients：a complementary mechanismcelactivation［J］．Neuroimmunol，2005，124（1，2）：70．

［5］Leary SM，Thompson AJ，primary progressive mutiple scerosis：cur－－rent and future treatment options．CNS Drugs［J］．2005，19（5）：369．

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［7］Killestein J，Polman CH．Current trials in mutiple sclerosis：established evidence and future hopes［J］．Curropin Neurol，2005，18（3）：253．

Expression of CD4 and CD28 costimulatory molecules of Multiple sclerosis

TAN Na－yu，YANG Le，WANG Ying－ying，et al．
（Department of Neurology，China－Japan Union Hospital of Jilin University，Jilin130033，China）

Objective To investigate the expression of multiple sclerosis patients with CD4Tlymphocytes and CD28 costimulatory molecules．Methods Flow cytometry was used in 28patients with MS peripheral blood T lymphocytes CD4＋，CD28＋，CD4＋CD28＋were detected，and the application for MS patients with EDSS disability scale score．Results Relapse of MS patients with CD4＋remission of MS was higher than the control group，remission MS patients with peripheral CD4＋cells expressed higher；relapsed CD28＋peripheral blood of MS patients was lower than in remission，remission than the control group；CD4＋CD28＋three groups showed no significant differences；severe MS patients was higher than in peripheral blood CD4＋moderate，severe peripheral blood CD28＋MS patients was lower than moderate，and CD4＋CD28＋expression of the two groups showed no significant difference．Conclusion Patients with multiple sclerosis accompanied by increased expression of CD4＋with CD28＋expression of costimulatory molecules reduced costimulatory molecules CD28＋lymphocytes in abnormal activation plays an important role，CD28expression abnormalities may also be involved in its pathogenesis．

Multiple sclerosis；T lymphocytes；CD4；CD28

R744．5＋1

A

譚納宇，女，在讀碩士，主要從事臨床神經(jīng)病學(xué)。

2013－02－28）

1007－4287（2014）02－0210－03

＊通訊作者