載順鉑聚乳酸靜電紡絲膜對口腔鱗癌細(xì)胞的殺傷作用研究

周麗佳，楊 洲，張士博，郝秀峰＊，張澤兵＊

載順鉑聚乳酸靜電紡絲膜對口腔鱗癌細(xì)胞的殺傷作用研究

周麗佳1，楊 洲2，張士博1，郝秀峰2＊，張澤兵1＊

（1．吉林大學(xué)口腔醫(yī)院，吉林長春130021；2．吉林大學(xué)化學(xué)院，吉林長春130012）

目的 探討載順鉑聚乳酸靜電紡絲膜對口腔鱗癌CAL－27細(xì)胞的殺傷作用。方法 利用靜電紡絲技術(shù)將順鉑（DDP）、聚乳酸（PLA）混合溶液制成載順鉑聚乳酸靜電紡絲膜（DDP／PLA膜）。通過掃描電鏡（SEM）觀察DDP／PLA膜表觀形態(tài)，紫外分光光度分析法測定PLA膜的降解速率，MTT法觀察細(xì)胞的增殖活性。實驗分為空白對照組，DDP組，PLA膜組，DDP／PLA膜組。結(jié)果 SEM可以觀察到納米纖維表面光滑、直徑均勻；降解速率顯示聚乳酸靜電紡絲膜在第一天降解50%左右，以后降解緩慢，在第13天降解趨于完畢；細(xì)胞增殖活性結(jié)果顯示：不含藥物的純膜對細(xì)胞基本無影響，不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）；DDP組、DDP／PLA組抑制細(xì)胞增殖活性，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．05）；實驗前3天DDP組作用效果好于DDP／PLA膜組，3天后DDP／PLA膜組作用效果優(yōu)于DDP組，與DDP組相比，相同劑量的DDP／PLA組對細(xì)胞的殺傷作用時間延長。結(jié)論 DDP／PLA膜可以殺傷口腔鱗癌CAL－27細(xì)胞，3天后的作用效果優(yōu)于DDP組；DDP／PLA膜具有緩釋作用，作用時間較DDP組長。

靜電紡絲；聚乳酸；順鉑；CAL－27細(xì)胞

（Chin J Lab Diagn，2014：18：0179）

口腔癌是第6大常見腫瘤，5年生存率約為60%［1］?；熓强谇话┲委煹某Ｓ梅椒ǎ谇话┑恼w化療效果不佳，晚期的效果更差［2］。多數(shù)的化療藥物在體內(nèi)有吸收不規(guī)則、半衰期短、毒副作用明顯等缺點［3］。通過改善化療藥物的給藥途徑，可達(dá)到增效減毒的作用，為此，我們將生物相容性和降解性良好的聚乳酸（PLA）與化療藥物順鉑混合一起，制備成載順鉑聚乳酸靜電紡絲膜，觀察其對口腔癌細(xì)胞的殺傷作用，從而達(dá)到局部化療、持續(xù)給藥、降低全身毒副反應(yīng)的目的。

1 材料與方法

1．1 細(xì)胞﹑主要試劑及儀器

采用高壓靜電紡絲技術(shù)制備DDP／PLA納米纖維藥膜，高壓靜電直流電源（東文高壓電源（天津）有限公司，型號：DW－P303－1ACF0），注射泵（保定申辰泵業(yè)有限公司，型號：SPLab02）。掃描電鏡（型號：SU8020，廠家：HITACHI）?？谇话〤AL－27細(xì)胞為上海九院陳萬濤教授惠贈，培養(yǎng)液為含有10%小牛血清的RPMI－1640（含100U·ml－1青霉素和含100mg·L－1的鏈霉素）。DDP購置于齊魯有限公司。用培養(yǎng)液配置成100mg·L－1儲備液，于－20℃下保存，使用前稀釋成所需濃度。噻唑藍(lán)（MTT，Sigma公司）。

1．2 SEM觀察納米纖維膜形貌將PLA膜、DDP／PLA膜分別裁剪成5mm×5mm大小送檢觀測，電壓10kV。

1．3 紫外分光光度計測定PLA膜降解速率

本實驗采用PLA包裹白蛋白（BSA）檢測聚乳酸的降解速率，了解藥物的體外釋放情況。先通過設(shè)置已知系列濃度的BSA標(biāo)準(zhǔn)品，由紫外分光光度計測出白蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，再由微量電子天平精確稱取BSA／PLA膜100mg，其中含有BSA 32．5mg。將樣品浸泡于裝有100ml的PBS（pH＝7．4）緩沖液的小燒杯中，符合漏槽條件，密封后再將此燒杯放于（37℃）的水平恒溫振蕩器內(nèi)進(jìn)行動態(tài)透析，分別于10min、30min、1h、2h、3h、4h、8h、24 h、3d、4d、5d、7d取釋放液10ml，取樣至釋放完全，并迅速補充空白PBS緩沖液10ml，維持原體積不變。用紫外－可見光分光光度計于波長280nm處測定所取透析液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線計算不同時間載BSA／PLA膜釋放的量，再計算累計釋放量并繪制體外釋放曲線。

1．4 細(xì)胞培養(yǎng)

口腔癌CAL－27細(xì)胞在含有10%小牛血清的中RPMI－1640培養(yǎng)液（含100U·ml－1青霉素和含100mg·L－1的鏈霉素），于37℃﹑5%CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。每2d換液傳代1次，使其保持對數(shù)生長狀態(tài)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1．5 MTT法檢測空白膜的生物毒性

實驗分為對照組﹑PLA膜組。對照組加入200μl的培養(yǎng)液；PLA膜組加入PLA膜。取對數(shù)生長期的CAL－27細(xì)胞，按每孔1×104個細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入200μl細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24h后棄去上清液，按照設(shè)置的3組每孔加入200μl溶液，每組設(shè)3個復(fù)孔，置37℃、5%CO2孵箱中，培養(yǎng)12h后每孔加入20μl MTT（5mg· L－1）溶液，培養(yǎng)4h。棄上清，每孔加入150μl DMSO，室溫下恒溫水浴箱內(nèi)振蕩10min，于酶標(biāo)儀檢測各孔在波長490nm處的A值，計算細(xì)胞生存率。

1．6 MTT法檢測加入DDP藥和DDP／PLA膜后細(xì)胞增殖活性

實驗分為對照組﹑DDP藥組﹑DDP／PLA膜組。對照組加入200μl的培養(yǎng)液；DDP藥組加入濃度為5mg·L－1的DDP溶液；DDP／PLA膜組加入含有1μg藥量的DDP／PLA膜。取對數(shù)生長期的CAL－27細(xì)胞，按每孔6×103個細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入200μl細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24h后棄去上清液，按照設(shè)置的3組每孔加入200μl溶液，每組設(shè)3個復(fù)孔，置37℃﹑5%CO2孵箱中，培養(yǎng)12h后每孔加入20μl MTT（5mg·L－1）溶液，培養(yǎng)4h。棄上清，每孔加入150μl DMSO，室溫下恒溫水浴箱內(nèi)振蕩10min，于酶標(biāo)儀檢測各孔在波長490nm處的A值，計算細(xì)胞生存率。細(xì)胞生存率＝實驗組A值／對照組A值×100%。

1．7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS17．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，組內(nèi)比較采用t檢驗，細(xì)胞生存率以百分率表示。

2 結(jié)果

2．1 PLA膜及DDP／PLA膜的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

通過SEM觀察PLA膜（圖1a）及DDP／PLA膜（圖1b）中納米纖維形貌，可見納米纖維連續(xù)，表面光滑，無結(jié)晶，直徑較均勻。

2．2 體外釋放測定聚乳酸降解速度

藥膜在PBS溶液中釋放均勻緩慢（圖2）。在本實驗中，第24h時BSA累積釋放量約為50%，以后逐漸緩慢釋放，第13d時BSA累積釋放量約為94%。根據(jù)圖中累積釋放曲線可以看出BSA的釋放量隨著時間的延長而增加。BSA的累積釋放量與時間呈依賴關(guān)系。

2．3 MTT法驗證空白膜毒性

空白膜組細(xì)胞生存率為98．9%，與對照組相比，無明顯差別，P＝0．879（P＜0．05），其生存率如圖3。

2．4 MTT法檢測加入DDP藥和DDP／PLA膜后細(xì)胞增殖活性

DDP／PLA組、DDP組對細(xì)胞生存率的影響如圖4所示。第1天，DDP／PLA組的細(xì)胞生存率與對照組相比無明顯變化，而DDP組的細(xì)胞生存率低于對照組，P＝0．043（P＜0．05），有統(tǒng)計學(xué)差異；第2天，DDP／PLA組細(xì)胞生存率開始下降，與對照組相比P＝0．033（P＜0．05），有統(tǒng)計學(xué)差異，但細(xì)胞生存率仍高于DDP組；第3－7天，DDP／PLA組的細(xì)胞生存率均低于DDP組，且兩組間P＜0．01。

圖1 a．掃描電鏡觀察純PLA膜中納米纖維形圖1b．掃描電鏡觀察DDP／PLA膜中納米纖維形貌

圖2 BSA／PLA累積釋放率曲線。

圖3 對照組和空白膜組細(xì)胞生存率比較

圖4 DDP／PLA膜組與DDP藥組細(xì)胞生存率的變化

3 討論

由于納米材料在藥物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中的特點，已經(jīng)被廣泛研究，目前已有多種形式，如納米微球、脂質(zhì)體、碳納米管、靜電紡絲等。靜電紡絲技術(shù)是目前制備超細(xì)纖維最重要的方法之一，已在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域用來制作藥物傳輸與緩控釋放的載體及創(chuàng)傷敷料等［4］，靜電紡絲的最重要醫(yī)療應(yīng)用之一是用作藥物控釋載體。雖然在此方面的研究有限，它已經(jīng)吸引了越來越多的關(guān)注［5］．聚乳酸（PLA）的生物相容及可降解性良好，作為人工合成醫(yī)用高分子的典型代表，已在臨床上獲得廣泛應(yīng)用［6］?？刂评w維表面空隙的形狀及尺寸使纖維具有許多潛在應(yīng)用，如催化反應(yīng)，過濾，吸收，太陽能電池，燃料電池，電池等，然而，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，在組織工程和藥物轉(zhuǎn)運中纖維的使用也變得越來越顯著［7］。與其他藥物制劑相比，載藥靜電紡絲纖維具有較高的藥物包封率和更好的穩(wěn)定性吸引了極大的關(guān)注，由于其表面積與體積比高，使其具有很好的藥物療效［8］；同時在藥物轉(zhuǎn)運方面具有很多優(yōu)點，尤其對特定區(qū)域或者低劑量形式的感染和抗癌藥物的轉(zhuǎn)運［9］。Antoniya Toncheva等用L－丙交脂－co－D（coPLA）和coPLA／聚乙二醇（PEG）制作載有氟喹諾酮諾酮類（鹽酸環(huán)丙沙星，左氧氟沙星半水合物（左旋）或莫西沙星鹽酸鹽（莫西））的靜電紡絲，通過紅外光譜及熒光顯微鏡證實抗生素已被載入到纖維中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗生素的釋放速率與抗生素自身特性無關(guān)，而與載抗生素的纖維復(fù)合物有關(guān)。在聚乙二醇的存在下，在最初的兩個小時藥物釋放加快，通過金黃色葡萄球菌微生物實驗證實coPLA／環(huán)丙沙星，coPLA／PEG／環(huán)丙沙星，coPLA／左旋，coPLA／PEG／左旋，coPLA／莫西，coPLA／PEG／莫西靜電紡絲纖維抑制細(xì)菌生長。并且靜電紡絲纖維內(nèi)抗生素的存在使細(xì)菌粘附力大大降低［10］。Zheng等用納米羥基磷灰石（n－HA）作為載體包裹阿霉素制備成載有阿霉素的納米羥基磷灰石顆粒，然后將載有載有阿霉素的納米羥基磷灰石顆?；烊刖廴樗幔u基乙酸中溶解，并制備成載阿霉素羥基磷灰石顆粒的聚乳酸羥基乙酸靜電紡絲。結(jié)果顯示，制備的載阿霉素羥基磷灰石的聚乳酸－羥基乙酸靜電紡絲具有均勻而連續(xù)的纖維形態(tài)。有效減小了突釋效果，從納米纖維中釋放的阿霉素對KB細(xì)胞的生長具有抑制作用［11］。Liu等將聚乙二醇－左旋聚乳酸靜電紡絲作為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素布雷菲德菌素A（BFA）的控釋系統(tǒng)，通過MTT法檢測其對HepG2的殺傷作用。結(jié)果表明，載有BFA的聚乙二醇－左旋聚乳酸靜電纖維對BFA具有控釋效果并適用于術(shù)后癌癥的化療［12］?？谇话┎∽兾恢帽頊\，可以采用間質(zhì)化療的方式將靜電紡絲膜植入病變部位，能顯著增加手術(shù)區(qū)域藥物濃度，而血漿中藥物濃度無明顯增加；在降低患者全身毒副反應(yīng)的同時，有效的提高患者術(shù)后生存率，降低復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的可能性［13］。

本研究結(jié)果顯示，PLA納米纖維表面光滑，直徑較均勻。藥物24h釋放約50%，出現(xiàn)突釋，而后釋放緩慢，在第13天藥物累積釋放率約為94%，說明PLA降解趨于完全。DDP／PLA膜與DDP藥對口腔鱗癌CAL－27細(xì)胞株的體外殺傷實驗表明，二者都具有時間依賴性，DDP藥的殺傷效應(yīng)時間主要在1－3d，此后逐漸進(jìn)入平臺期，即3天時DDP藥的殺傷作用已達(dá)到最大；而DDP／PLA組在48h之內(nèi)，由于藥物累計釋放率不足，所以細(xì)胞殺傷作用明顯低于DDP藥；但48h之后，隨著藥物的不斷釋放，其細(xì)胞殺傷作用逐漸高于DDP藥。這一結(jié)果表明，作為一種緩釋劑，隨著時間的延長，順鉑不斷從靜電紡絲中釋放并維持在較高濃度，從而延長了順鉑的有效作用。順鉑在具有抗癌作用的同時，它對機體的消化系統(tǒng)、骨髓、腎臟以及內(nèi)耳等產(chǎn)生毒性損傷，其中以對腎臟及內(nèi)耳的毒副作用最為嚴(yán)重。由于順鉑是以濃度決定療效的抗腫瘤藥物，短時間內(nèi)所給藥物濃度越高，療效也就越好，而大劑量使用順鉑無疑會增加其副作用［14］；并且由于其半衰期短，在體內(nèi)不斷被分解代謝，很難維持其有效的濃度。本研究結(jié)果表明，DDP／PLA膜具有緩釋作用，可以在較長時間內(nèi)維持藥物濃度，保持對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，降低毒副作用，延長化療藥物的作用時間。綜上所述，DDP／PLA膜具有較好的優(yōu)越性，能提高局部藥物濃度，為口腔癌的化療提供了一個新的思路，具有很好的臨床應(yīng)用價值。

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Polylactic acid containing cisplatin electrostatic spinning membrane for cytotoxicity study of oral squamous cell carcinoma cell in vitro

ZHOU Li－jia1，YANG Zhou2，ZHANG Shi－bo1，et al．
（1．Stomatology Hospital，Jilin University，Changchun130021，China；2．School of Chemistry，Jilin University，Changchun130012，China）

Objective To investigate cisplatin containing polylactic acid electrospun membranes for cytotoxicity study oral cancer CAL－27cells in vitro．Methods Making cisplatin（DDP）and PLA mix together to fabricate polylactic acid containing cisplatin nanofibers（DDP／PLA）membrane by electrospinning method．The micro morphology was observed by scanning electron microscope（SEM），the degradation rate of PLA membrane by UV spectrophotometric，the proliferation activity of CAL－27cells was observed by tetrazolium bromide（MTT）colorimetry，The CAL－27cells were divided into conntrol group，DDP group，PLA membrane group，DDP／PLA membrane group．Results Nanofibers was smooth and uniform diameter through SEM；On the first day，the degradation rate of PLA membrane was about 50%，after the degradation rate was slow and degradation tends to completely In the thirteenth day．The MTT result showed that the cell proliferation in PLA membrane group was no significant impact（P＜0．05），DDP group and DDP／PLA group could inhibit cell proliferation，which was statistic significance（P＜0．05）．Three days of beginning of the experiment，the effect of cell killing treat with DDP was better than DDP／PLA group．three days later，the effect of cell killing treat with DDP membrane was better than DDP group．Campared with the DDP group，the same dose of DDP／PLA group on cell killing effect was longer．Conclusion DDP／PLA membrane could kill cells in oral squamous cell carcinoma CAL－27，three days later，the effect of cell killing treat with DDP membrane was better than DDP group；DDP／PLA nanofibers membrane owns good controlled release effect and has better effect than DDP group．

Electrospinning；PLA；DDP；CAL－27

R730．53

A

周麗佳（1989－），女，黑龍江省綏化市人，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事口腔腫瘤病理學(xué)的研究。

2013－08－15）

1007－4287（2014）02－0179－04

吉林省科技發(fā)展計劃項目（201105101）

＊通訊作者