Tet－on調(diào)控的人HOXB4慢病毒載體構(gòu)建

李秀英，白金萍，仲苓芝，李新娜，李文雪，李榮貴＊

Tet－on調(diào)控的人HOXB4慢病毒載體構(gòu)建

李秀英1，2，白金萍1，仲苓芝1，李新娜1，李文雪1，李榮貴1＊

（1．吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，吉林長(zhǎng)春130021；2．吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春130033）

目的 構(gòu)建Tet－on調(diào)控的人HOXB4慢病毒載體，為體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞并保持其干細(xì)胞特性提供實(shí)驗(yàn)材料基礎(chǔ)。方法 應(yīng)用PCR技術(shù)從質(zhì)粒TAT－HA－HOXB4－Full中擴(kuò)增編碼人HOXB4的cDNA，用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI分別酶切HOXB4基因片段和帶有Tet－on開(kāi)關(guān)的可調(diào)控慢病毒載體，經(jīng)T4DNA連接酶連接獲得慢病毒載體Teto－Fuw－h(huán)HOXB4。對(duì)構(gòu)建的HOXB4慢病毒載體進(jìn)行酶切片段凝膠電泳及DNA測(cè)序分析。結(jié)果 酶切片段電泳分析和DNA測(cè)序分析證明Tet－on調(diào)控的人HOXB4慢病毒載體構(gòu)建成功。結(jié)論 正確構(gòu)建了Tet－on調(diào)控的人HOXB4慢病毒載體，為后續(xù)的體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞及相關(guān)研究提供材料。

HOXB4；慢病毒載體，Tet－on

（Chin J Lab Diagn，2014：18：0175）

造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSCs）移植是治療血液系統(tǒng)疾病（如白血病、再生障礙性貧血等）、遺傳代謝性疾病、淋巴瘤和自身免疫性疾病的重要手段之一［1］。目前，用于移植治療的HSCs主要來(lái)源于骨髓和臍帶血，但由于實(shí)際可獲得的HSC數(shù)量有限，很難直接滿足臨床移植的需求。目前應(yīng)用的旨在獲得足量HSCs體外培養(yǎng)過(guò)程又極易導(dǎo)致HSCs向成熟血細(xì)胞分化而喪失其干細(xì)胞特性。因此，在體外培養(yǎng)過(guò)程中，保持HSCs自我增殖而防止其成熟分化是獲取足量HSCs來(lái)滿足臨床移植需求的關(guān)鍵。

人HOXB4基因在HSCs中高表達(dá)，但是隨著HSCs向成熟血細(xì)胞分化，其表達(dá)量逐漸降低［2］。研究表明，HOXB4表達(dá)可以促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向HSCs分化，并且可以防止造血干細(xì)胞向成熟血細(xì)胞分化［3，4］。這些研究結(jié)果表明：HOXB4在HSCs自我更新及多向分化選擇過(guò)程中起開(kāi)關(guān)作用，是決定人HSCs特定細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)錄因子。然而到目前為止，通過(guò)調(diào)控HOXB4基因表達(dá)來(lái)決定體外培養(yǎng)中HSCs命運(yùn)的研究卻很少報(bào)道。

慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)是最有效的將外源DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的方法之一，已被廣泛用于那些通常應(yīng)用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染難以成功的各類(lèi)細(xì)胞（其中包括HSC）的轉(zhuǎn)導(dǎo)。根據(jù)需要對(duì)外源基因在受體細(xì)胞的表達(dá)能夠進(jìn)行實(shí)時(shí)調(diào)控是研究者追求的最理想的目標(biāo)。Te－on是目前應(yīng)用最廣的基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，其特點(diǎn)是外源基因在未經(jīng)誘導(dǎo)條件下幾乎不表達(dá)，加入誘導(dǎo)劑（四環(huán)素或強(qiáng)力霉素）后其調(diào)控的基因表達(dá)很快達(dá)高水平，誘導(dǎo)劑本身在應(yīng)用的劑量對(duì)受體細(xì)胞無(wú)任何毒副作用。本研究應(yīng)用的載體骨架Teto－FUW為受tet調(diào)控的慢病毒載體，其優(yōu)點(diǎn)是：對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，且可根據(jù)需要調(diào)控基因表達(dá)。

本研究利用PCR、限制性酶切、DNA重組等分子生物學(xué)技術(shù)成功的構(gòu)建了Tet－on調(diào)控的人HOXB4慢病毒載體Teto－FUW－h(huán)HOXB4，為在體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞及相關(guān)研究提供了實(shí)驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1．1 材料

包含人HOXB4全長(zhǎng)編碼序列的質(zhì)粒HOXB4－HA－TAT－tag pET由美國(guó)由瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院祝捷教授惠贈(zèng)，慢病毒載體Teto－FUW－OSKM、宿主工具大腸桿菌DH5a；Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I和DL2000 Marker均購(gòu)自TaKaRa公司（大連，中國(guó)），PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自Axygen（硅谷，美國(guó)）。

1．2 PCR反應(yīng)

根據(jù)GenBank（NM＿024015）中人HOXB4cDNA序列設(shè)計(jì)引物并分別在上游引物起始密碼前及下游引物終止密碼后引入EcoR I酶切位點(diǎn)。引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列為：（上游引物5’－ACGTGAATTCATGGCTATGAGTTCTTTTTTGATCAAC－3’；下游引物：5’－ACGTGAATTCCTAGAGCGCGCGGGGGCCTC－3’）。PCR反應(yīng)在25μl體系內(nèi)進(jìn)行。由1xPCR buffer，1．5μM MgCl2，0．8μM dNTP，0．2μM引物，12．5UTaq酶和100ng模板DNA組成。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性2min；94℃變性45s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下分離目的條帶并應(yīng)用凝膠回收試劑盒按照廠家說(shuō)明書(shū)回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1．3 質(zhì)粒DNA的提取、酶切、連接及DH5α細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

1．3．1 質(zhì)粒DNA的提取 挑取菌液，接種于4 mL含氨芐（50μg／ml）LB液體培養(yǎng)基中，37℃、300rpm·min－1振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日，菌液離心、集菌、倒掉上清液。按照Axygen質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行1．5%瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定。

1．3．2 酶切及連接 用限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I酶分別對(duì)PCR擴(kuò)增的HOXB4基因片段、tet－on慢病毒載體及重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)在37℃水浴中進(jìn)行2小時(shí)后，將HOXB4編碼區(qū)DNA片段及慢病毒載體酶切產(chǎn)物進(jìn)行1．5%瓊脂糖凝膠電泳，然后用凝膠回收試劑盒回收純化酶切產(chǎn)物。將回收的酶切片段加入T4連接酶連接，16℃過(guò)夜連接。

1．3．3 DH5α細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 取一支E．coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，向其內(nèi)加入連接產(chǎn)物，混勻后冰中放置30min，42℃熱擊60s，冰浴2－3min，再向感受態(tài)細(xì)胞中加入900μl LB培養(yǎng)基，37℃溫和振蕩細(xì)胞60 min后，6 000rpm／min離心45s，棄掉900μl培養(yǎng)基后混勻細(xì)胞，取100μl涂布于含氨芐（50μg／ml）的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，觀察菌落生長(zhǎng)情況。

1．4 質(zhì)粒DNA測(cè)序分析

將重組質(zhì)粒送上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。引物為通用引物CMV，將測(cè)序結(jié)果與Gen－Bank中的HOXB4基因序列進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果

2．1 獲取編碼人HOXB4全長(zhǎng)cDNA

為載體構(gòu)建的方便，分別在人HOXB4編碼區(qū)兩端引入EcoRI酶切位點(diǎn)。這一目的是通過(guò)設(shè)計(jì)特定引物并對(duì)HOXB4編碼區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增來(lái)實(shí)現(xiàn)的。圖1展示的是PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖中清晰可見(jiàn)單一的PCR產(chǎn)物，其分子量約為750bp，與人HOXB4編碼區(qū)的長(zhǎng)度相符，表明成功地獲得了載體構(gòu)建所需的人HOXB4編碼區(qū)的cDNA片段。

圖1 HOXB4基因瓊脂糖凝膠電泳圖

2．2 獲取陽(yáng)性克隆

為減少獲取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化細(xì)胞克隆篩查的工作量，本研究直接以菌體作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，圖2展示的是兩個(gè)陽(yáng)性細(xì)菌克隆PCR產(chǎn)物的電泳圖。圖3是從兩個(gè)陽(yáng)性克隆提取的質(zhì)粒DNA經(jīng)EcoRⅠ酶切后的電泳圖。圖中清晰可見(jiàn)兩條酶切片段。其分子量大小分別與插入片段（750bp）及空載（8 300 bp）相符，表明HOXB4編碼區(qū)cDNA片段已經(jīng)成功插入空載體。

圖2 重組質(zhì)粒陽(yáng)性克隆PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳

圖3 HOXB4重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ酶切凝膠電泳圖

2．3 DNA測(cè)序分析確證tet－on調(diào)控的人HOXB4慢病毒載體構(gòu)建成功

由于采用同一限制性?xún)?nèi)切酶（EcoRI）對(duì)慢病毒載體及HOXB4編碼DNA片段進(jìn)行酶切，插入成分的兩端均以EcoRI粘性末端與載體堿基互補(bǔ)鏈接，這就使得在連接過(guò)程中存在反向連接的可能。另外由于Taq DNA聚合酶的低保真性，在其催化的PCR反應(yīng)中也會(huì)偶發(fā)堿基配對(duì)錯(cuò)誤。為排除反向連接及PCR反應(yīng)中偶發(fā)的堿基配對(duì)錯(cuò)誤的可能，確定構(gòu)建載體的正確性，對(duì)Teto－Fuw－h(huán)HOXB4進(jìn)行了DNA測(cè)序分析。其測(cè)序結(jié)果與GenBank關(guān)于人HOXB4cDNA序列完全一致（如圖4所示）。根據(jù)測(cè)序分析所用引物與HOXB4插入成分的比鄰關(guān)系證明插入方向的正確性。這一結(jié)果表明編碼人HOXB4全長(zhǎng)cDNA）已成功地按設(shè)計(jì)要求插入表達(dá)載體中，即成功地完成了Tet－on調(diào)控的人HOXB4慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建。

3 討論

慢病毒表達(dá)載體Teto－FUW－h(huán)HOXB4具有可調(diào)控目的基因表達(dá)和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高等優(yōu)點(diǎn)，其轉(zhuǎn)導(dǎo)HSCs后，可以在體外大量擴(kuò)增HSCs的同時(shí)防止其分化，可解決臨床應(yīng)用中HSCs數(shù)量不足的問(wèn)題。

目前應(yīng)用的將外源DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的載體有病毒載體和非病毒載體，非病毒載體因轉(zhuǎn)染HSCs效率極低而無(wú)法應(yīng)用。病毒載體又包括腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體。原始HSCs細(xì)胞本身缺乏腺病毒受體，因此腺病毒載體不能直接使目的基因?qū)際SCs細(xì)胞內(nèi)。與逆轉(zhuǎn)錄病毒相比，慢病毒載體具有更廣的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞范圍，因而有更廣泛的應(yīng)用價(jià)值，更容易獲得的各種來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞。故本研究選擇慢病毒載體作為載體的骨架。

本研究采用的Tet－on系統(tǒng)是一個(gè)比較成熟的真核生物外源基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，具有高效、無(wú)毒、開(kāi)關(guān)較嚴(yán)密等優(yōu)點(diǎn)。Teto－FUW慢病毒載體的結(jié)構(gòu)包括FUW慢病毒骨架、強(qiáng)力霉素（四環(huán)素相似物）操縱基因和Tet－on開(kāi)關(guān)。感染細(xì)胞后可以通過(guò)強(qiáng)力霉素DOX來(lái)調(diào)控目的基因表達(dá)，調(diào)控后可做自身對(duì)照進(jìn)而避免插入位置不同所引起的表達(dá)差異。

HSCs在體外擴(kuò)增過(guò)程中會(huì)難以避免地發(fā)生分化，并且擴(kuò)增后造血細(xì)胞的自我更新能力和重建造血能力均有所降低［6］。研究表明，如果HOXB4在臍血CD34＋細(xì)胞中高表達(dá)，可以使其在體內(nèi)獲得競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)，并且不影響CD34＋細(xì)胞向成熟血細(xì)胞分化的功能［7］。還有研究表明，用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染小鼠CD34＋細(xì)胞，高表達(dá)HOXB4的CD34＋細(xì)胞在體外培養(yǎng)兩周后擴(kuò)增出約40倍的具有造血功能的HSCs，擴(kuò)增出的造血干細(xì)胞向成熟血細(xì)胞分化能力未受到影響［3］。正是由于HOXB4的表達(dá)與維持HSC自我更新等干細(xì)胞特性相關(guān)，故本研究構(gòu)建了Tet－on調(diào)控的人HOXB4慢病毒載體Teto－FUW－h(huán)HOXB4。體外轉(zhuǎn)染Teto－FUW－h(huán)HOXB4可以大量擴(kuò)增HSCs，且可通過(guò)DOX來(lái)調(diào)控HOXB4的表達(dá)。

骨髓和臍血是HSCs的主要來(lái)源。骨髓造血干細(xì)胞獲得具有侵入性，而臍血干細(xì)胞中HSCs數(shù)量有限，故HSCs來(lái)源不足限制了其臨床應(yīng)用。在體外，如果采用慢病毒載體Teto－FUW－h(huán)HOXB4感染HSCs，使其在體外大量擴(kuò)增不分化，將緩解臨床中HSCs不足的問(wèn)題。

圖4 測(cè)序結(jié)果與GenBank序列blast結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用PCR，DNA重組等分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建出安全、穩(wěn)定、高表達(dá)的慢病毒載體，經(jīng)酶切和DNA測(cè)序鑒定目的基因HOXB4正確插入慢病毒載體內(nèi)，為后續(xù)體外擴(kuò)增HSCs提供實(shí)驗(yàn)材料。

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The construction of Tet－on regulating lentiviral vector Containing Human Gene HOXB4

LI Xiu－ying1，2，BAI Jin－ping1，ZHONG Ling－zhi1，et al．
（1．Department of Pathology，School of Basic Medical Sciences，Jilin University，Changchun130021，China；2．Central laboratory，China－Japan union hospital，Jilin University，Changchun130033，China）

Objective The recombined lentiviral vector which containing Tet－on and Human HOXB4was constructed in order to provide the material basis for proliferating of hematopoietic stem cells and maintaining properties of stem cells in vitro．Methods Polymerase chain reaction（PCR）was used to amplify HOXB4gene from the plasmid TATHA－HOXB4－Full．Both HOXB4gene and the lentiviral vector containing Tet－on were digested by EcoRI，recovered，and ligated through T4DNA ligase to obtain Teto－Fuw－h(huán)HOXB4．The recombinant lentiviral vector was checked by restriction enzyme digestion and DNA sequencing．Results Both restriction enzyme digestion and DNA sequencing demonstrated that the HOXB4gene was inserted into the lentiviral vector correctly．Conclusion The Teto－Fuw－h(huán)HOXB4 lentiviral vector is constructed，and provided the material basis for proliferating of hematopoietic stem cells in vitro．

HOXB4；Lentiviral vector；Tet－on

Q5

A

李秀英（1986－），女，在讀醫(yī)學(xué)博士。

2013－10－18）

1007－4287（2014）02－0175－04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21277057）

＊通訊作者