罕見α-地中海貧血的新生兒篩查與診斷

唐海深江陵陸林苑熊怡李東至

（1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山市博愛(ài)醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，廣東中山 528400；2.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心產(chǎn)前診斷中心，廣東廣州 510623）

罕見α-地中海貧血的新生兒篩查與診斷

唐海深1江陵1陸林苑1熊怡1李東至2

（1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山市博愛(ài)醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，廣東中山 528400；2.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心產(chǎn)前診斷中心，廣東廣州 510623）

目的探討罕見α-地中海貧血的新生兒篩查與診斷。方法應(yīng)用全自動(dòng)毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)6525例新生兒臍血進(jìn)行血紅蛋白定量分析，有Hb Bart’s區(qū)帶的樣本進(jìn)行常規(guī)基因診斷（gap-PCR和PCR-RDB），對(duì)于未檢出異常的樣本，用多重PCR技術(shù)檢測(cè)4種罕見α-基因缺失（--THAI、--FIL、--MED、-（α）20.5），用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法檢測(cè)罕見非缺失型α-地貧。結(jié)果6525例新生兒臍血樣本中，檢出Hb Bart’s陽(yáng)性樣本377例，其中基因確診375例：包括14種基因型、383個(gè)α-地貧等位基因；發(fā)現(xiàn)罕見α-地貧7例，包括2例--THAI／αα及5例罕見非缺失型α-地貧；發(fā)現(xiàn)1例α2-基因突變至與Hb Bart’s區(qū)帶峰同區(qū)域的異常血紅蛋白（Hb J-Wenchang-Wuming）。結(jié)論毛細(xì)管電泳技術(shù)定量分析血紅蛋白，準(zhǔn)確、高效，應(yīng)作為α-地貧高發(fā)地區(qū)的新生兒疾病篩查常規(guī)項(xiàng)目；在α-地貧高發(fā)地區(qū)應(yīng)注意罕見α-地貧的篩查與診斷，防止漏診導(dǎo)致重型地貧兒出生。

α-地中海貧血；罕見；Hb Bart’s；基因

α-地中海貧血（α-thalassemia，α-地貧）是人類最常見且危害最大的單其因遺傳病之一，它是由于α-珠蛋白基因缺失或非缺失突變使α-珠蛋白鏈的合成受到部分或完全抑制而引起的遺傳性溶血性貧血。正常人有4個(gè)α基因，若4個(gè)α-基因都缺失，則完全沒(méi)有α-珠蛋白鏈的合成，臨床上稱為血紅蛋白Bart’s胎兒水腫綜合征，胎兒一般在妊娠23～38周或出生后數(shù)小時(shí)死亡。另外，一些非缺失型Hb H病和非缺失型α-地貧純合子患兒貧血嚴(yán)重，甚至需要輸血治療。因此在α-地貧高危地區(qū)篩查--／αα基因和非缺失型α-地貧基因攜帶者尤為必要，是識(shí)別高危人群，預(yù)防重型地貧患兒出生的重要手段。目前各分子實(shí)驗(yàn)室常規(guī)應(yīng)用gap-PCR技術(shù)檢測(cè)3種常見缺失型α-地貧基因（--SEA、-α3.7、-α4.2），采用反向點(diǎn)雜交（RDB）技術(shù)檢測(cè)3種常見非缺失型α-地貧基因（αCSα、αQSα及αWSα），但仍可能漏診罕見的α-地貧，導(dǎo)致重型地貧兒的出生。本文探討罕見α-地貧的新生兒篩查與診斷。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 2010年5月至2011年7月在廣州市婦女兒童醫(yī)療中心產(chǎn)科分娩的6525例新生兒。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 新生兒分娩斷臍后，從胎盤端臍帶抽吸2 ml臍帶血，EDTA-K2抗凝，用于血紅蛋白電泳及地貧基因檢測(cè)。

1.2.2 毛細(xì)管電泳Hb Bart’s定量 臍血樣品先3000轉(zhuǎn)離心3分鐘，取18μl血細(xì)胞溶于90μl的溶血素中充分混勻后上機(jī)檢測(cè)。采用法國(guó)Sebia公司Capillarys 2全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀及配套試劑，在9.8 k V電壓、p H9.4的堿性緩沖液條件下，在石英毛細(xì)管內(nèi)進(jìn)行血紅蛋白電泳，用415 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各種血紅蛋白的百分比，從而定量Hb Bart’s。電泳圖譜分成15個(gè)區(qū)：不同的血紅蛋白峰出現(xiàn)在特定的區(qū)域內(nèi)：Hb A2＝Z3，Hb F＝Z7，Hb A＝Z9，Hb Bart＇s＝Z12，Hb H＝Z15［1，2］。

1.2.3 常規(guī)基因診斷 收集Hb Bart’s陽(yáng)性樣本并編號(hào)，用富士quick gene-mini80DNA提取儀，按DNA提取試劑盒使用說(shuō)明，提取新生兒臍血中白細(xì)胞的全基因組DNA。采用gap-PCR技術(shù)檢測(cè)3種常見缺失型α-地貧基因（--SEA、-α3.7、-α4.2）［3］；若gap-PCR檢測(cè)陰性，用反向點(diǎn)雜交（RDB）技術(shù)檢測(cè)3種非缺失型地貧基因（Hb CS、Hb QS和Hb WS）［4］。

1.2.4 罕見α-地貧基因檢測(cè)

1.2.4.1 4種罕見的缺失型α-地貧基因檢測(cè) 對(duì)于gap-PCR及PCR-RDB方法均未檢出異常的Hb Bart’s陽(yáng)性樣本，參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物（詳見表1）［5］，用一種快速可靠的多重PCR檢測(cè)4種中國(guó)人群罕見的缺失型α-地貧基因（--THAI、--FIL、--MED、-（α）20.5）。PCR反應(yīng)總體積為10μl，包括：5μl 2×GC buffer I、250μM d NTP、正反向引物各0.16μM、Taq DNA聚合酶0.5U、15～25 ng基因組DNA模板。PCR反應(yīng)條件：96℃預(yù)變性15分鐘；隨后98℃變性45秒，60℃退火90秒，72℃延伸135秒，共30個(gè)循環(huán)；然后72℃延伸5分鐘；最后4℃保存。隨后配置2%瓊脂糖凝膠板，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳并分析結(jié)果。

表1 檢測(cè)4種罕見缺失型α-地貧基因（--THAI、--FIL、--MED、-（α）20.5）的引物序列

1.2.4.2 罕見非缺失型α-地貧基因檢測(cè) 挑出通過(guò)以上方法仍未知基因型的Hb Bart’s陽(yáng)性樣本。從UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／genome.ucsc.edu）中獲取α-珠蛋白基因（α1-和α2-基因）的DNA序列。應(yīng)用LightScanner Primer Design軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，分別擴(kuò)增α1-和α2-珠蛋白基因（包含3個(gè)外顯子及部分上游和下游序列），引物序列詳見表2，引物委托華大基因合成。PCR擴(kuò)增：α1-和α2-基因的PCR反應(yīng)體系相同，總體積為50μl（包括：25μl 2×GC buffer I、750μM d NTP、正反向引物各6.4p M、Taq DNA聚合酶2.0U、100ng基因組DNA模板）。擴(kuò)增α1-基因的PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5分鐘；隨后95℃變性40秒，62.5℃退火40秒，72℃延伸100秒，共35個(gè)循環(huán)；然后72℃延伸3分鐘；最后4℃保存。擴(kuò)增α2-基因的PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5分鐘；隨后95℃變性40秒，65℃退火40秒，72℃延伸100秒，共35個(gè)循環(huán)；然后72℃延伸3分鐘；最后4℃保存。PCR擴(kuò)增完成后，先取2～3μl產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，確定成功擴(kuò)增并獲得特異性片段后，將剩余PCR產(chǎn)物送華大基因用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法檢測(cè)α-基因（α1-和α2-基因）全長(zhǎng)。用chromas及clustalx軟件分析DNA測(cè)序結(jié)果。

表2 α-珠蛋白基因全長(zhǎng)測(cè)序所用的引物

1.2.5 統(tǒng)計(jì) 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié) 果

2.1 Hb Bart’s陽(yáng)性率及α-地貧的人群攜帶率在6525例新生兒臍帶血樣本中，檢出Hb Bart’s陽(yáng)性樣本377例（Hb Bart’s含量為0.1%～22.5%），陽(yáng)性檢出率為5.78%。377例Hb Bart’s陽(yáng)性樣本中，共檢出14種α-地貧基因型375例，α-地貧的人群攜帶率為5.75%（375／6525）。375例確診的α-地貧攜帶者中包括雙重雜合子8例，即α-地貧等位基因?yàn)?83個(gè)，α-地貧基因攜帶率為5.87%（383／6525）。

2.2 Hb Bart’s含量與常見α-地貧基因型的關(guān)系α＋-地貧（1個(gè)α-基因缺陷）的Hb Bart’s的含量為0.55%±0.29%，其中-α3.7／αα、-α4.2／αα、αCSα／αα、αQSα／αα的Hb Bart’s含量分別為0.39%±0.21%（0.10%～0.90%）、0.50±0.16（0.20～0.90）、1.59%±0.32%（1.00%～2.30%）、0.48%± 0.18%（0.20%～0.70%）；α0-地貧（2個(gè)α-基因缺陷）的Hb Bart’s的含量為3.54%±0.79%（1.0～8.6）；Hb H?。?個(gè)α-基因缺陷）的Hb Bart’s的含量為20.27%±1.72%（17.5～22.5）。

2.3 罕見α-地貧基因型及Hb Bart’s含量 全部377例Hb Bart’s陽(yáng)性樣本經(jīng)gap-PCR及RDB技術(shù)檢測(cè)以后，檢出368例常見α-地貧基因型，剩余9例樣本未檢出異常，另外有1例檢測(cè)基因型為-α4.2／αα的樣本Hb Bart’s含量為4.6%。將上述10例樣本全部挑出，用多重PCR檢測(cè)4種中國(guó)人群罕見的缺失型α-地貧基因（--THAI，--FIL，--MED，-（α）20.5），檢出2例--THAI／αα。對(duì)于剩余8例樣本用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法檢測(cè)α1-和α2-珠蛋白基因的全長(zhǎng)，共檢出5例4種罕見α-基因突變：［α1CD62 Val→Ala，GTG＞GCG］、［α2CD8（-C）］、［α1CD117／CD118（＋ATC）］、［α2CD31 Arg→Lys，AGG＞AAG］。Hb Bart’s含量4.6%通過(guò)gap-PCR、PCR-RDB及多重PCR技術(shù)檢測(cè)基因型為-α4.2／αα的樣本，進(jìn)行了α-基因全長(zhǎng)測(cè)序，檢出α2-基因突變（α2CD11 AAG＞CAG）至與Hb Bart’s區(qū)帶峰同區(qū)域的異常血紅蛋白（HB J-Wenchang-Wuming），詳見表3。

表3 罕見α-地貧基因型及其Hb Bart’s含量

2.4 α-地貧等位基因的組成 在383個(gè)α-地貧等位基因中，包括東南亞缺失型（--SEA）263例、-α3.769例、-α4.222例、αCSα12例、αQSα10例，罕見α-地貧7例，詳見表4。

表4 383個(gè)α-地貧等位基因的組成

3 討 論

由于人類珠蛋白基因的表達(dá)具有時(shí)空順序性，人在不同發(fā)育時(shí)期血紅蛋白組成不同，成人期血紅蛋白組成為：Hb A（α2β2）：96.5%～97.5%，Hb A2（α2δ2）：2.5%～3.5%，HbF（α2γ2）：0～1.0%；正常新生兒的血紅蛋白組成大約為：Hb F（α2γ2）：70%～80%，Hb A（α2β2）：20%～30%。若α-珠蛋白鏈減少或缺乏會(huì)導(dǎo)致γ-珠蛋白鏈的相對(duì)增多，未與α-鏈結(jié)合的γ-鏈聚合成Hb Bart’s（γ4）。自1958年Ager等發(fā)現(xiàn)臍血中存在Hb Bart’s以來(lái)，此成分與α-珠蛋白基因缺陷間的關(guān)系引起了許多學(xué)者的關(guān)注。由于Hb Bart’s于出生3～6個(gè)月后即消失，理論上α-地貧的篩查最適合于新生兒期進(jìn)行。

本研究應(yīng)用法國(guó)Sebia公司Capillarys 2全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀對(duì)新生兒臍血進(jìn)行血紅蛋白電泳Hb Bart’s定量，377例Hb Bart’s陽(yáng)性樣本中（Hb Bart’s含量為0.1%～22.5%），有375例經(jīng)基因分析確診為α-地貧。經(jīng)分析Hb Bart’s的含量隨著α-基因缺陷（缺失或突變）個(gè)數(shù)的增加而升高：Hb H病的Hb Bart’s含量均大于10%；α0-地貧的Hb Bart’s的含量均大于1%且小于10%；α＋-地貧中，αCSα／αα的Hb Bart’s含量均大于1%，其他類型的α＋-地貧攜帶者Hb Bart’s含量均小于1%。因此，以臍血Hb Bart’s陽(yáng)性為指標(biāo)，對(duì)新生兒進(jìn)行α-地貧篩查，靈敏度高；同時(shí)，全自動(dòng)毛細(xì)管電泳技術(shù)分離定量Hb Bart’s具有簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，在α-地貧高發(fā)地區(qū)，該技術(shù)應(yīng)常規(guī)應(yīng)用于新生兒α-地貧篩查，以減少出生缺陷，提高人口素質(zhì)。

2010年Munkongdee T等［1］對(duì)587例泰國(guó)新生兒臍血進(jìn)行毛細(xì)管電泳電泳Hb Bart’s定量篩查α-地貧。研究顯示，缺失1、2、3個(gè)α-基因的α-地貧攜帶者，其臍血Hb Bart’s含量分別為0.5%± 0.2%、4.6%±0.5%、20.1%；該研究還顯示，以Hb Bart’s含量0.2%為界，區(qū)分正常人與α＋-地貧攜帶者的效率最高。本研究結(jié)果中Hb Bart’s的含量與基因缺陷個(gè)數(shù)的關(guān)系與Munkongdee T的研究相符，但是，本研究以Hb Bart’s含量0.1%為界區(qū)分正常人與α-地貧攜帶者，Hb Bart’s陽(yáng)性樣本377例，即有375例經(jīng)基因分析確診為α-地貧。2例Hb Bart’s陽(yáng)性的樣品未知基因型（Hb Bart’s含量分別為0.60%、0.30%），還可能存在-α3.7及-α4.2以外的其他罕見缺失型α＋-地貧未檢測(cè)到［9］，或存在直接測(cè)序法檢測(cè)α1-和α2-基因全長(zhǎng)無(wú)法檢測(cè)到的，影響α-基因表達(dá)的上游突變所致的非缺失型α＋-地貧或Z12區(qū)段異常血紅蛋白。此外，其中4例Hb Bart’s含量為0.1%樣本基因檢測(cè)均為-α3.7／αα。因此，新生兒臍血毛細(xì)管電泳Hb Bart’s含量0.1%應(yīng)作為區(qū)分正常人與α-地貧攜帶者的指標(biāo)。

本研究檢出的383個(gè)α-地貧等位基因中，3種常見的缺失型α-地貧（--SEA、-α3.7、-α4.2）共354例，3種常見的非缺失型α-地貧（αCSα、αQSα、αWSα）共22例。用多重PCR檢出2例--THAI／αα。通過(guò)用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法檢測(cè)α1-和α2-珠蛋白基因的全長(zhǎng)，共檢出5例4種罕見非缺失型α-地貧?？梢姀V州地區(qū)罕見α-地貧（包括罕見非缺失型α-地貧與4種罕見缺失型）的發(fā)病率為0.1%（7／6525）。聯(lián)合應(yīng)用gap-PCR技術(shù)和反向點(diǎn)雜交技術(shù)能檢測(cè)出約98%（376／383）的α-地貧，仍有2%（7／383）左右的罕見α-地貧漏診，因此日常臨床應(yīng)注意罕見α-地貧的篩查與診斷，防止重型地貧兒的出生。

在研究進(jìn)行過(guò)程中，1例血紅蛋白電泳顯示Hb Bart’s區(qū)帶峰的血紅蛋白含量為4.6%的樣本通過(guò)gap-PCR、PCR-RDB及多重PCR技術(shù)檢測(cè)基因型為-α4.2／αα，回顧查看其父母的血常規(guī)：雙方Hb、MCV、MCH均在正常范圍。隨后便對(duì)此例樣本進(jìn)行了α-基因全長(zhǎng)測(cè)序，發(fā)現(xiàn)α2-基因突變（CD11 Lys→Gln，AAG＞CAG），導(dǎo)致產(chǎn)生異常血紅蛋白（HB J-Wenchang-Wuming），此血紅蛋白在毛細(xì)管電泳時(shí)與Hb Bart’s區(qū)帶峰區(qū)域相同?？梢?，臍血Hb Bart’s是新生兒α-地貧篩查的敏感指標(biāo)，但臨床上應(yīng)將血常規(guī)、血紅蛋白電泳與基因診斷相結(jié)合，同時(shí)應(yīng)注意Hb Bart’s區(qū)帶峰同區(qū)域的異常血紅蛋白，以降低假陽(yáng)性帶來(lái)的不良影響。

［1］Munkongdee T，Pichanun D，Butthep P，et al.Quantitative analysis of Hb Bart＇s in cord blood by capillary electrophoresis system［J］.Ann Hematol，2011，90（7）：741-746.

［2］李志玖，鄭芳，燕平，等.跨越斷裂位點(diǎn)PCR檢測(cè)α-地中海貧血基因缺失［J］.鄖陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，28（5）：451-452，456.

［3］郭廣洲，陳延娥，廖生贇，等.應(yīng)用反向點(diǎn)雜交法檢測(cè)α-地中海貧血點(diǎn)突變［J］.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2008（8）：785-787.

［4］Tan AS，Quah TC，Low PS，et al.Arapidand reliable 7-deletion multiplex polymerase chain reaction assay for alphathalassemia［J］.Blood，2001，98（1）：250-251.

［5］Xu XM，Zhou YQ，Luo GX，et al.The prevalence and spectrum of alpha and beta thalassaemia in Guangdong province：implications for the future health burden and population screening［J］.J Clin Pathol，2004，57（5）：517-522.

［6］Liao C，Li J，Li DZ.Fetal anemia and hydrops associated with homozygosity for hemoglobin Quong Sze［J］.Prenat Diagn， 2008，28（9）：862-864.

［7］Li DZ，Liao C，Li J，et al.Hemoglobin H hydrops fetalis syndrome resulting from the association of the--SEAdeletion and the alphaQuong Szealpha mutation in a Chinese woman［J］.Eur J Haematol，2005，75（3）：259-261.

［8］張俊武，龍桂芳.血紅蛋白與血紅蛋白?。跰］.南寧：廣西科學(xué)技術(shù)出版社，2003：212-215.

編輯：鄒剛

ObjectiveTo explore the methods and significance for neonatal screening and diagnosis about rareα-thalassemia.MethodAutomatic capillary electrophoresis（CE）was used to determinate Hb Bart’s amount in cord blood of 6525 newborns.Samples with the presence of Hb Bart’s were confirmed by routine molecular analysis（gap-PCR and PCR-RDB）.For samples of unknown genotype after gap-PCR and PCR-RDB，use a Multiplex PCR to detect four kinds of deletionalα-thalassemia（--THAI，--FIL，--MED，-（α）20.5），then do gene sequencing for the wholeα1-globin gene andα2-globin gene.ResultsTotally，377 samples were found positive for Hb Bart’s，and 375 samples were confirmed by DNA testing，including 14 genotypes with 383α-thalassemia alleles.7 rareα-thalassemia genes were detected，including 2--THAI／αα and 5 rare nondeletion type ofα-thalassemia.At the same time，1 sample with Hb J-Wenchang-Wuming，witch was appear at the same position with Hb Bart’s，was detected..ConclusionsTo screen forα-thalassemia，CE was proved to be an effective and accurate method.To prevent birth defects about hydrops fetalis or babies with transfusion-dependentα-thalassemia，rareα-thalassemia genotypes should be taken for suspected cases in high prevalence areas.

α-thalassemia；rare；Hb Bart’s；gene

R714.55

A

2013-12-05）