高效毛細(xì)管電泳測(cè)定藥品和人體血清中的氫溴酸加蘭他敏

高慧君，劉荔貞，白云峰，郭芳芳，馮 鋒,3?

（1.山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山西太原030006；2.山西師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山西臨汾041004；3.山西大同大學(xué)有機(jī)化學(xué)研究所，山西大同037009）

加蘭他敏（Galanthamine），又名尼瓦林、強(qiáng)肌寧、雪花胺(結(jié)構(gòu)式見圖1)，是從石蒜科植物中分離得到的一種異喹啉生物堿，具有較高的藥用價(jià)值。它是一種可逆性乙酰膽堿酯酶（AchE）抑制劑，臨床主要用于治療輕、中度阿爾茲海默?。ˋD，老年癡呆，具有較小的毒副作用和較好的治療效果。根據(jù)中國AD協(xié)會(huì)最新調(diào)查表明，全球有3 000多萬人患有老年癡呆，成為威脅人類健康的“四大殺手”之一，因此越來越多的人研究治療癡呆癥的藥物。加蘭他敏的氫溴酸鹽作為治療AD的藥物首先在奧地利獲得批準(zhǔn)，近年來又在美國、歐洲等陸續(xù)上市,而且它還在抗病毒、抗瘧疾、抗腫瘤、精神分裂癥輔助治療、慢性外傷性腦損傷的治療、面癱和偏癱等方面有著重要的作用。

圖1 氫溴酸加蘭他敏的結(jié)構(gòu)式

目前，加蘭他敏的分析方法主要有熒光法[1]、薄層色譜法[2]、放射免疫法[3]、核磁共振[4]和酶測(cè)定法[5]等。熒光法由于在測(cè)定波長下還可能會(huì)檢測(cè)到其他物質(zhì)，因此不能準(zhǔn)確定量；薄層色譜法靈敏度較低；免疫法和核磁共振價(jià)格貴。高效液相色譜法（HPLC）[6]和毛細(xì)管電泳法（CE）是現(xiàn)在使用較多的方法，可以直接進(jìn)行測(cè)定。但在測(cè)定中藥提取液或者生物樣品時(shí)，若樣品量較少則無法用HPLC測(cè)定，可用具有高效、高靈敏度、分析速度快、用樣量少等優(yōu)點(diǎn)的CE法測(cè)定。已有文獻(xiàn)中，研究的主要是非手性下的分離[7]、手性分離[8]或者結(jié)合質(zhì)譜[9]和柱后電化學(xué)發(fā)光[10]對(duì)石蒜中生物堿成分的測(cè)定。我們建立一種簡單、快捷的毛細(xì)管區(qū)帶電泳對(duì)藥物和生物樣品中的加蘭他敏進(jìn)行測(cè)定，為臨床試驗(yàn)提供一種有效的方法。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器與試劑

P/ACE System MDQ毛細(xì)管電泳儀，32 Karat software色譜工作站（美國Beckman公司）；B3200S超聲波清洗器（上海必能信超聲有限公司）；AP250D分析天平(美國Ohaus)；未涂層石英毛細(xì)管，內(nèi)徑75 μm，總長度57 cm，有效長度50 cm（河北永年銳灃色譜器件有限公司）；HH-42型數(shù)顯恒溫?cái)嚢柩h(huán)水箱（常州國華電器有限公司）；TFL-16C型高速電動(dòng)離心機(jī)（菏澤石油化工學(xué)校儀器設(shè)備廠）；PSH-2C型酸度計(jì)（上海大普儀器有限公司）。

氫溴酸加蘭他敏對(duì)照品（上海阿拉丁試劑有限公司），磷酸（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠），磷酸二氫鈉（分析純，天津市化學(xué)試劑六廠），三氯乙酸（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠），氫溴酸加蘭他敏注射液（上海旭東海普藥業(yè)有限公司），甲醇（色譜純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司），正常人血清由山西大同大學(xué)附屬醫(yī)院提供。

1.2 溶液的配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取適量的氫溴酸加蘭他敏對(duì)照品，用二次蒸餾水稀釋，分別配制成0.015，0.029，0.059，0.082 ，0.110，0.128，0.160 mg/mL 系列濃度的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)液。所有溶液用0.22 μm的微孔濾膜（水系）過濾，并進(jìn)行超聲處理，置于冰箱中4℃保存。

1.2.2 藥物樣品溶液的配制

取適量氫溴酸加蘭他敏注射液稀釋，用0.22 μm的微孔濾膜（水系）過濾，并進(jìn)行超聲處理，置于冰箱中4℃保存。

1.2.3 生物樣品溶液的配制

取適量去激素的人體血清，加入一定量10%三氯乙酸，保證蛋白質(zhì)完全沉淀，10 000 r/min離心10 min，移取上清液并加入適量氫溴酸加蘭他敏對(duì)照品，震蕩搖勻，在真空干燥箱干燥，過濾后進(jìn)樣分析。

1.3 電泳操作條件

新的未涂層石英毛細(xì)管，需要先進(jìn)行活化處理，沖洗方法是：在20 psi條件下，分別使用甲醇5 min，H2O 5 min，0.1 mol/L HCl 5 min，H2O 5 min，0.1 mol/L NaOH 30 min，H2O 5 min，運(yùn)行電解質(zhì)20 min。兩次運(yùn)行之間，用0.1 mol/L NaOH 2 min，H2O 1 min，運(yùn)行電解質(zhì)2 min。檢測(cè)波長289 nm，壓力進(jìn)樣0.5 psi，0.5 s，運(yùn)行電壓15 kV，溫度25℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 氫溴酸加蘭他敏的紫外吸收光譜

用二極管陣列檢測(cè)器在線檢測(cè)對(duì)照品氫溴酸加蘭他敏在緩沖溶液中的光譜，確定氫溴酸加蘭他敏在289 nm處有最大吸收，故選擇檢測(cè)波長為289 nm。

2.2 電泳分離條件的選擇

2.2.1 緩沖體系的選擇

本實(shí)驗(yàn)分別考察了硼砂-硼酸、磷酸鹽溶液為背景電解質(zhì)的分離效果。背景電解質(zhì)不僅可以改變毛細(xì)管內(nèi)壁表面電勢(shì)，而且影響溶液的濃度和被測(cè)物的擴(kuò)散系數(shù)，從而會(huì)使樣品組分的分離效果和遷移時(shí)間發(fā)生改變。結(jié)果表明，在磷酸-磷酸鹽的緩沖體系下，遷移時(shí)間較快，峰形好，分離度高，分離效果較理想。

2.2.2 緩沖溶液濃度的選擇

本實(shí)驗(yàn)在固定pH為2.5的條件下，又分別以（A）20 mmol/L、(B)40 mmol/L、(C)50 mmol/L、(D)60 mmol/L、(E)80 mmol/L的NaH2PO4-H3PO4為背景電解質(zhì)進(jìn)行了考察，結(jié)果見圖2。隨著濃度的增大，遷移時(shí)間也隨著增大。濃度越大，產(chǎn)生電流越大熱量越高，濃度的降低，則會(huì)導(dǎo)致峰形變寬，變差，分離效果變差。因此，選擇50 mmol/L為最佳濃度，在這個(gè)條件下峰形較好，而且分析時(shí)間也較快。

圖2 緩沖溶液濃度對(duì)分析物分離的影響

2.2.3 緩沖溶液pH的選擇

運(yùn)行緩沖液pH的選擇是又一個(gè)優(yōu)化分離效果的重要考察因素,它能改變電滲流的大小，酸度越低，電滲流越小，進(jìn)而影響遷移時(shí)間及樣品的解離，從而影響分離的選擇性和靈敏度。在固定濃度為50 mmol/L的條件下分別對(duì)pH為 (A)4.0、(B)3.5,(C)3.0,(D)2.5,(E)2.1 進(jìn)行了考察，結(jié)果如圖 3。隨著pH的增加，遷移時(shí)間只是稍有增加。pH≥3.0時(shí)，隨著pH的增加，峰形也會(huì)變寬，稍有拖尾現(xiàn)象。在pH為2.5和2.1時(shí)，遷移時(shí)間并未發(fā)生改變，可能是在pH為2.5時(shí)，被分析物與背景電解質(zhì)溶液中的氫離子結(jié)合達(dá)到平衡飽和狀態(tài)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇pH=2.5為最佳的酸度條件。

圖3 緩沖溶液pH對(duì)分析物分離的影響

2.2.4 運(yùn)行電壓的選擇

工作電壓的選擇，雖然對(duì)分離效果影響不是非常大，但是會(huì)影響分析時(shí)間，因此也作為一個(gè)考察因素。一般情況下，電壓越高，遷移時(shí)間越快,分析時(shí)間縮短，峰形變尖，這是由于電滲流的增加所致，電滲流的遷移速度快于溶質(zhì)的電泳速度。但是電壓過高，又會(huì)產(chǎn)生較大的電流和較高的熱量，反而會(huì)使分離效果變差。本實(shí)驗(yàn)在固定pH為2.5，緩沖液的濃度為50 mmol/L的條件下，分別對(duì)電壓為(A)23 kV，(B)20 kV，(C)15 kV，(D)12 kV進(jìn)行了考察,結(jié)果見圖4。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與最低檢出限

在優(yōu)化的電泳條件下，對(duì)一系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析測(cè)定，用分析物的峰面積（Y）與分析物的濃度（X）做標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示其有較好的線性關(guān)系。依據(jù)3倍信噪比來確定其最低檢出限。得到的線性方程Y=409 424x+5 312.8，r=0.998 9,線性范圍 0.015 ～ 0.160 mg/mL,最低檢出限 2.57×10-5mg/mL。

2.4 精密度與重現(xiàn)性試驗(yàn)

將供試品溶液配制成3種不同濃度的樣品，連續(xù)進(jìn)樣分別測(cè)定3次，結(jié)果日內(nèi)遷移時(shí)間和峰面積變異系數(shù)分別為 0.10%～0.22%,0.13%～1.10%。將上面的樣品放置在4℃條件下恒溫保存，每天均重復(fù)測(cè)定3次，共測(cè)定3 d，結(jié)果日間遷移時(shí)間和峰面積變異系數(shù)分別為 0.14%～0.34%,0.76%～1.63%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法具有較好的精密度和重復(fù)性。

圖4 電壓對(duì)分析物分離的影響

2.5 加樣回收實(shí)驗(yàn)

在供試品溶液中加入3種不同濃度的氫溴酸加蘭他敏標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到的回收率結(jié)果見表2。

在處理好的人血清樣品中加入3種不同濃度的氫溴酸加蘭他敏標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到的回收率結(jié)果見表1。在血清中測(cè)得的氫溴酸加蘭他敏電泳圖如圖5。

表1 加樣回收實(shí)驗(yàn)及樣品含量測(cè)定結(jié)果

2.6 實(shí)際樣品含量的測(cè)定

精密稱取批號(hào)為的氫溴酸加蘭他敏注射液，置于10 mL容量瓶中，超聲并定容至刻度，搖勻。進(jìn)樣分析，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量，結(jié)果：藥品批號(hào)110801，含量(n=5)0.522 4，0.525 1，0.510 5，0.501 1，0.499 3 mg/g，平均0.511 7 mg/g，RSD=2.32。電泳圖見圖6。

圖5 血清中氫溴酸加蘭他敏的電泳圖

圖6 氫溴酸加蘭他敏注射液的電泳圖

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用毛細(xì)管電泳法測(cè)定氫溴酸加蘭他敏含量，對(duì)不同的實(shí)驗(yàn)條件和電泳條件進(jìn)行了詳細(xì)地分析與優(yōu)化選擇，經(jīng)大量試驗(yàn)得出所建立的方法重現(xiàn)性、精密度和回收率均較好的方法，且成本較低，靈敏度較高，用量小，分析速度快，而且在生物樣品中測(cè)定的結(jié)果也較好，為臨床的測(cè)定提供可能性的方法。

[1]Culzoni M J,Aucelio R Q,Escandar G M.Spectrofluorimetry in organized media coupled to second-order multivariate calibration for the determination of galanthamine in the presence of uncalibrated interferences[J].Talanta,2010,82:325-332.

[2]Abou-Donia A H,Toaima S M,Hammoda H M，et al.New rapid ralidated HPTLC method for the determination of galanthamine in Amaryllidaceae plant extracts[J].Phytochem Anal,2008,19:353-358.

[3]Tanahashi T,Poulev A，Zenk M H.Radioimmunoassay for the quantitative determination of galanthamine[J].Planta Med,1990,56:77-81.

[4]Lubbe A,Choi Y H,Verpoorte R,et al.Analysis of metabolic variation and galanthamine content in Narcssus bulbs by(1)H NMR[J].Phytochem Anal,2010,21:66-72.

[5]da Silva J I,de Moraes M C,Vieira L C,et al.Acetylcholinesterase capillary enzyme reactor for screening and characterization of selective inhibitors[J].J Pharm Biomed Anal,2013,73:44-52.

[6]Tenchera J,Yambolier I,Zhivkova Z.Reversed-phase liquid chromatography for the determination of galanthamine and its metabolites in human plasma and urine[J].J Chromatogr,1987,421:396-400.

[7]Gotti R,Fiori J，Bartolini M,et al.Analysis of Amaryllidaceae alkaloids from Narcissus by GC-MS and capillary electrophoresis[J].J Pharm Biomed Anal,2006,42:17-24.

[8]Rizzi A,Schuh R,Brückner A,et al.Enantiomeric resolution of galanthamine and related drugs used in anti-Alzheimer therapy by means of capillary zone electrophoresis employing derivatized cyclodextrin selectors[J].J Chromatogr B,1999,730:167-175.

[9]Visky D,Jimidar L,Ael W V,et al.Capillary electrophoresis-mass spectrometry in impurity profiling of pharmaceutical products[J].Electrophoresis,2005,26:1541-1549.

[10]Deng B Y,Xie F,Li L Q,et al.Determination of galanthamine in Bulbs Lycoridis Radiatae by coupling capillary electrophoresis with end-column electrochemilumine-scence detection[J].J Sep Sci,2010,33:2356-2360.