熒光淬滅法研究熱敏脂質(zhì)體的體外釋放行為*

陸媛媛，符旭東，胡戴，趙倩，李雪梅

(1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院藥劑科，武漢 430070；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430065)

熒光淬滅法研究熱敏脂質(zhì)體的體外釋放行為*

陸媛媛1，2，符旭東1，胡戴1，2，趙倩1，2，李雪梅1，2

(1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院藥劑科，武漢 430070；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430065)

目的 建立一種簡單且精確評價熱敏脂質(zhì)體(TSL)體外釋放行為的方法。方法采用薄膜分散法制備鈣黃綠素?zé)崦糁|(zhì)體(CTSL),利用熒光自淬滅法研究熱敏脂質(zhì)體的體外釋放,通過差示掃描量熱法測定熱敏脂質(zhì)體的相變溫度。結(jié)果制備熱敏脂質(zhì)體能成功包裹高濃度熒光素,被包裹的鈣黃綠素能屏蔽自身的發(fā)射光。鈣黃綠素在0.000 1～0.001 mmol·L-1濃度范圍內(nèi),熒光強度與濃度之間存在良好的線性關(guān)系。CTSL在37和41℃下10 min的釋放度分別為0.1%和45.4%。CTSL的相轉(zhuǎn)變溫度約為41℃。結(jié)論通過熒光淬滅法研究評價熱敏脂質(zhì)體的熱敏釋藥特性,方法準(zhǔn)確、簡單、可行。

鈣黃綠素；脂質(zhì)體,熱敏；熒光淬滅

熱敏脂質(zhì)體(thermosensitive liposome,TSL)是一種新型的藥物載體,能結(jié)合熱療靶向?qū)⑺幬镙斔偷綄嶓w瘤部位。在人正常體溫時,藥物在血液循環(huán)中能安全地包封在TSL中而不被釋放。而當(dāng)循環(huán)到加熱的腫瘤部位時,由于TSL的雙層膜的滲透性改變,導(dǎo)致藥物的釋放[1]。傳統(tǒng)的測量熱敏脂質(zhì)體的釋放行為的方法往往是先利用透析袋分離脂質(zhì)體和游離藥物,再測定釋放度[2]。由于藥物擴散速度會影響藥物透過透析袋的時間,而熱敏脂質(zhì)體的釋放往往表現(xiàn)出突釋特征[1],所以透析袋測定方法往往不能真實反映熱敏脂質(zhì)體的釋藥特征,并且這種方法復(fù)雜且操作繁瑣。本實驗旨在建立一種簡單且精確的方法研究熱敏脂質(zhì)體的體外釋放行為。鈣黃綠素是一種常見的熒光素,溶于水后呈黃綠色熒光。當(dāng)其濃度大于100 mmol·L-1時,穩(wěn)定且具有熒光自淬滅的性質(zhì),僅能檢測到微弱的背景信號。TSL在溫度高于相變溫度時,脂質(zhì)體的穩(wěn)定性被破壞,膜的通透性增強,鈣黃綠素泄露出來。濃度逐漸稀釋,熒光自淬滅現(xiàn)象減弱,熒光信號增強。筆者利用熱敏脂質(zhì)體包裹高濃度鈣黃綠素,通過熒光光度法測定其釋放曲線,并將其測定結(jié)果與熱敏脂質(zhì)體示差掃描量熱法(differential scanning calorimetry,DSC)測定結(jié)果進行比較,以此評價熒光分光光度法測定熱敏脂質(zhì)體的體外釋放行為的可行性[3]。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 單棕櫚酰磷脂酰膽堿(1-myristoyl-2-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine,MPPC)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC)、二硬脂酸磷脂酞膽堿[1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol),DSPC]、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-N-羥基琥珀酰亞(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-PEG-NHS,DSPE-PEG-NHS)均購于美國Avanti polar lipids公司,批號:229088；鈣黃綠素(國藥集團化學(xué)試劑有限公司,批號:20120305)；曲拉通(triton X-100)；葡聚糖凝膠G-50(Pharmacia公司)；其他試劑均為分析純。

1.2 實驗儀器 熒光分光光度計(日本日立公司,型號:OA1801P F-2700)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠,型號:RE-52A)；透析袋(BIOSHARP公司,截留相對分子質(zhì)量為8 000～14 000)；紫外分光光度計(日本島津公司,型號:UV-2800AH)；超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司,型號:JY92-2D),電子天平(AB204-IU)。

1.3 鈣黃綠素?zé)崦糁|(zhì)體(calcein thermosensitive liposome,CTSL)的制備及純化 精密稱取鈣黃綠素0.6 g溶于磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saling, PBS,pH=7.4)5 mL中。用4 mol·L-1氫氧化鈉(NaOH)調(diào)pH到7.4,用PBS定容到10 mL即得終濃度為100 mmol·L-1的鈣黃綠素溶液。保存?zhèn)溆谩?/p>

取磷脂材料(DPPC,DSPC,MPPC,DSPE-PEG-NHS質(zhì)量比為9∶1∶0.8∶0.5)溶于7 mL三氯甲烷中,置于250 mL圓底燒瓶中,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中于40℃水浴下減壓旋轉(zhuǎn)45 min,以徹底揮去有機溶劑。于真空干燥器中放置12 h,再用100 mmol·L-1鈣黃綠素溶液于60℃水化,探針超聲6 min后分別過0.45,0.22 mm的聚碳酸醋膜各3次,即得CTSL。

精密吸取CTSL0.1 mL于葡聚糖凝膠G-50柱,用PBS緩沖液洗脫,流速1 mL·min-1,接收洗脫液,每管0.2 mL,依次編號。用紫外分光光度計于496 nm處測量每管吸光度,繪制洗脫曲線。

1.4 釋放液中鈣黃綠素含量測定的方法學(xué)考查

1.4.1 專屬性實驗 將相同濃度的鈣黃綠素溶液和空白熱敏脂質(zhì)體,設(shè)定激發(fā)光波長為490 nm,在熒光分光光度計中進行掃描,測定磷脂對鈣黃綠素的測定有無干擾。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取鈣黃綠素0.012 5 g,用PBS溶液配制濃度為0.01 mmol·L-1的鈣黃綠素溶液,再分別精密吸取0.1,0.2,0.3,0.5, 0.8,1 mL于10 mL量瓶中定容。在激發(fā)波長490 nm,發(fā)射波長515 nm條件下分別測其熒光值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3 加樣回收率實驗 取CTSL 1.0 mL置10 mL量瓶中,分別加入0.000 1,0.000 5,0.001 mmol·L-1鈣黃綠素對照品溶液1.0 mL,加PBS稀釋至刻度,搖勻,于熒光分光光度計在激發(fā)波長490 nm,發(fā)射波長515 nm條件下分別測其熒光值,每份平行重復(fù)3次,以吸光度值按外標(biāo)一點法計算回收率。

1.4.4 鈣黃綠素溶液的穩(wěn)定性 精密配制濃度為0.000 1,0.000 5,0.001 mmol·L-1鈣黃綠素溶液,分別在1,2,5,12 h測量其熒光值。

1.5 CTSL體外釋放度的測定

1.5.1 不同溫度釋放度的測定 精密吸取純化后的CTSL 1 mL,加入50 mL PBS中,分別在不同溫度下磁力攪拌。于0,10 min精密取樣0.2 mL,用PBS稀釋到2 mL,測定熒光值,分別作為初始熒光值(I0)和不同時刻的熒光值(It)；另精密吸取1 mL純化后的CTSL加入10 μL 1%triton X-100,搖勻后用PBS稀釋到500 mL,測定熒光值,作為脂質(zhì)體中鈣黃綠素全部釋放的熒光值(I∞)。按照以下公式計算鈣黃綠素的釋放度:釋放度(%)=(It-I0)/(I∞-I0)×100%。

1.5.2 熒光淬滅法測量CTSL的體外釋放 按照“1.5.1”項下方法,在43℃磁力攪拌。于1,5,10,20, 40,60 min取樣測定,計算鈣黃綠素的累積釋放度。

1.5.3 透析法測量CTSL體外釋放曲線 取純化后的CTSL溶液1 mL加入透析袋內(nèi),兩端夾緊后,放入50 mLPBS溶液中,在43℃條件下磁力攪拌。分別在1,5,10,20,40,60 min取出1 mL透析液,同時補充相同體積的釋放介質(zhì)。另取CTSL溶液1 mL加入50 mL PBS破乳搖勻后,采用紫外分光光度計測定,計算鈣黃綠素的釋放度。釋放百分度的公式為:F=At/A0× 100%(其中F為釋放度,At為累計釋放的鈣黃綠素的量,A0為加人透析袋中鈣黃綠素的總量)。

1.6 DSC測定CTSL的相變溫度 用微量注射器將脂質(zhì)體樣品逐滴加入鋁制DSC坩堝,用鑷子將鋁蓋放置到坩堝上,密封。將坩堝放入儀器,充氮氣。在20～60℃內(nèi)以5℃·min-1運行掃描,采集數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 CTSL的純化 以熒光值(F)為縱坐標(biāo),試管編號(n)為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線,由圖1可知,在第19到21號試管時,沒有紫外吸收。說明熱敏脂質(zhì)體和游離藥物可以被分離。收集前4 mL洗脫液即為鈣黃綠素?zé)崦糁|(zhì)體。見圖1。

圖1 CTSL洗脫曲線Fig.1 Elution curve of CTSL

2.2 釋放液中鈣黃綠素含量測定的方法學(xué)考察 測量結(jié)果得出,鈣黃綠素在激發(fā)光為490 nm時,最大熒光強度發(fā)射光波長為515 nm,而此波長下磷脂無熒光吸收,故磷脂對鈣黃綠素含量測定無影響。以熒光值(F)為縱坐標(biāo),鈣黃綠素濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程為F=545.89C-194.18,R2=0.999 5,可見鈣黃綠素在0.000 1～0.001 mmol·L-1濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。高、中、低3種濃度的平均加樣回收率為100.6%,RSD=1.1%(n=9),回收率符合分析方法的要求。濃度0.000 1,0.000 5,0.001 mmol·L-1鈣黃綠素溶液,12 h內(nèi)測量的熒光值RSD＜2.0%,說明鈣黃綠素溶液在12 h內(nèi)能保持穩(wěn)定。

2.3 CTSL不同溫度釋放度 以釋放度(F)為縱坐標(biāo),溫度(T)為橫坐標(biāo)繪制曲線。結(jié)果顯示,隨著溫度升高,釋放量逐漸增加。37～40℃時幾乎沒有釋放。41℃時,突然大量釋放。所以41℃約為此熱敏脂質(zhì)體的相變溫度。見圖2。

2.4 兩種方法測定CTSL體外釋放度的比較 以釋放度(F)為縱坐標(biāo),時間(t)為橫坐標(biāo)分別繪制以兩種方法測量的CTSL在43℃的釋放曲線。結(jié)果顯示: CTSL在相變溫度下能實現(xiàn)完全的釋放,并且在相變溫度的釋放速度非?？?20 min內(nèi)釋放可達80%。而在37℃時基本不釋放。透析袋法和熒光淬滅法均能用于CTSL的體外釋放,熒光淬滅法因為避免了熒光素與脂質(zhì)體的分離過程,釋放速度略快于透析袋法,結(jié)果更加準(zhǔn)確,更能代表CTSL的體外釋放結(jié)果。見圖3。

圖2 CTSL在不同溫度的釋放度(n=3)Fig.2 Release rate of CTSL at different temperature(n=3)

圖3 CTSL在41℃時釋放曲線(n=3)Fig.3 Releasing curve of CTSL at 41℃(n=3)

2.5 DSC測定CTSL的相變溫度結(jié)果 結(jié)果顯示:空白熱敏脂質(zhì)體的相變溫度為40.805℃,CTSL的相變溫度為40.842℃。說明鈣黃綠素對于熱敏脂質(zhì)體的相變溫度的測量沒有影響。DSC的結(jié)果和熒光淬滅法測量的結(jié)果基本吻合,說明可以通過熒光淬滅法準(zhǔn)確的測量熱敏脂質(zhì)體的體外釋放行為,也說明了采用釋放行為確定相變溫度的合理性。見圖4。

3 討論

利用熱敏脂質(zhì)體包裹高濃度熒光素的自淬滅效應(yīng),熒光信號微弱。TSL在溫度高于相變溫度時,膜的通透性增強,鈣黃綠素泄露并稀釋,熒光信號增強。這種測定方法不受藥物擴散速度影響,可以不經(jīng)分離直接測定釋放度,方法簡便快捷。如今熱敏脂質(zhì)體的相變溫度主要是借助高靈敏度的DSC來測量,價格昂貴且對磷脂濃度要求較高。本實驗結(jié)果表明DSC的結(jié)果和熒光淬滅法測量的結(jié)果基本吻合,可以借助測量鈣黃綠素的釋放行為測量脂質(zhì)體的相變溫度。

熱敏脂質(zhì)體釋放行為的改變往往會受到加入藥物的影響,比如加入含二丙酸倍氯米松(BDP)的DPPC脂質(zhì)體的預(yù)相變溫度顯著下降。本實驗結(jié)果表明,加入鈣黃綠素后,DSC測定的DPPC脂質(zhì)體的相變溫度基本相同,說明鈣黃綠素的加入對脂質(zhì)體的相變溫度沒有影響。同時也證明了利用鈣黃綠素測定脂質(zhì)體釋放行為的合理性。

A.空白熱敏脂質(zhì)體;B.CTSL圖4 CTSL的相變溫度示差掃描量熱圖A.the blank TSL；B.CTSLFig.4 Transformation temperature graph of CTSL by differential scanning calorimetry

[1] DE SMET M,LANGEREIS S,VANDEN BOSCH S,et al. Temperaturesensitiveliposomesfordoxorubicindelivery under MRI guidance[J].J Controlled Rel,2010,143(1): 120-127.

[2] STRIETH S,EICHHOM M E,WERNER A,et al.Paclitaxel encapsulatedincationicliposomesincreasestumor microvessel leakiness and improves therapeutic efficacy in combination with Cisplatin[J].Clin Cancer Res,2008,14 (14):4603-4611.

[3] HOSSANN M,SYUNYAEVA Z,SCHMIDT R,et al.Proteins and cholesterol lipid vesicles are mediators of drug release from thermosensitive liposomes[J].J Controlled Rel,2012, 162(2):400-406.

DOI 10.3870/yydb.2014.04.021

Establishment of a Method for Evaluating the Release Behavior of Thermo Sensitive Liposome in vitro

LU Yuan-yuan1,2,FU Xu-dong1,HU Dai1,2,ZHAO Qian1,2,LI Xue-mei1,2
(1.Department of Pharmacy, Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Area,Wuhan 430070,China;2.College of Pharmacy,Hubei College of Traditional Chinese Medicine,Wuhan 430065,China)

Objective To establish a simple and accurate method to evaluate the release behavior of thermo sensitive liposome(TSL).MethodsCalcein thermo sensitive liposome(CTSL)was prepared by film hydration method,and the release behavior was measured by fluorescence quenching method.Then the transformation temperture was verified by differential scanning calorimetry.ResultsThermo sensitive liposome with different phospholipids could encapsulate the high concentration of calcein successfully,and trapped calcein could shield its emitted light.Calcein was in a good linearity among the concentrations of 10-4～10-3mmol·L-1.The 10-min release rate at 37 and 41℃were 0.1%and 45.4%,respectively.The transformation temperature of CTSL was 41℃.ConclusionThe simple and accurate method to evaluate thermo sensitive liposome release behavior is successfully established based on fluorescence quenching method.

Calcein;Thermosensitive liposomes;Fluorescent quenching

R944.9;R927.1

A

1004-0781(2014)04-0484-04

2013-08-19

2013-09-24

*2011年湖北省科技計劃自然科學(xué)基金資助項目(2011CDB019)

陸媛媛(1986-),女,湖北荊州人,在讀碩士,研究方向:靶向給藥新劑型。電話:(0)15972124957,E-mail：lyy_201209@163.com。

符旭東(1969-),女,湖北武漢人,碩士生導(dǎo)師,主任藥師,博士,研究方向:靶向給藥新劑型。電話:027-68878610,E-mail：fuxudong2013@163.com。