十字孢堿對(duì)人膽管癌QBC-939細(xì)胞增殖和凋亡的影響

何政,鄭軍

(湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院普通外科一病區(qū),宜昌 443002)

十字孢堿對(duì)人膽管癌QBC-939細(xì)胞增殖和凋亡的影響

何政,鄭軍

(湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院普通外科一病區(qū),宜昌 443002)

目的 探討蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)抑制藥十字孢堿(STS)對(duì)人膽管癌QBC-939細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制。方法采用CCK-8法檢測(cè)STS對(duì)QBC-939細(xì)胞增殖的影響;透射電子顯微鏡觀察STS對(duì)QBC-939細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)STS對(duì)QBC-939細(xì)胞凋亡率和周期分布的影響;蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)STS對(duì)QBC-939細(xì)胞周期蛋白cyclin B1、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(Cdk1)和磷酸化周期蛋白依賴性激酶(p-Cdk1)表達(dá)的影響。結(jié)果STS能顯著抑制QBC-939細(xì)胞的增殖(P＜0.05),抑制作用呈濃度依賴性,對(duì)QBC-939細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50) 24 h為334 nmol·L-1,48 h為118 nmol·L-1。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),STS能誘導(dǎo)QBC-939細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡小體。Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法檢測(cè)0,12,24和48 h凋亡率分別為(10.16±4.52)%,(22.35±2.19)%,(34.27±2.30)%和(59.70±5.97)%。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,STS可顯著誘導(dǎo)QBC-939細(xì)胞凋亡率增加(P＜0.05),并引起G0/G1期細(xì)胞比例減少,而G2/M期細(xì)胞比例增加(P＜0.05)。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),經(jīng)STS處理后的QBC-939細(xì)胞cyclin B1和Cdk1蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05),而p-Cdk1蛋白表達(dá)則明顯增加(P＜0.05)。結(jié)論STS可顯著抑制人膽管癌QBC-939細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡,其機(jī)制可能是通過阻滯細(xì)胞周期于G2/M期,進(jìn)而抑制QBC-939細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

十字孢堿;蛋白激酶C抑制藥;膽管癌;細(xì)胞周期;凋亡;QBC-939細(xì)胞

膽管癌是膽道系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,近年來其發(fā)病率有明顯增高的趨勢(shì)[1]。由于膽管癌特殊的解剖部位以及缺乏早期有效的診斷標(biāo)志物,大多數(shù)膽管癌在最終明確診斷時(shí)已屬中晚期,失去根治性切除的機(jī)會(huì),因此患者預(yù)后極差[2]。蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是一種鈣激活和磷脂酶依賴的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,PKC通過磷酸化一系列底物進(jìn)而參與細(xì)胞內(nèi)廣泛的生物學(xué)效應(yīng),其對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和運(yùn)動(dòng)等過程均有一定調(diào)節(jié)作用[3]。同時(shí),越來越多的研究表明,PKC在人類多種腫瘤中存在異常激活,是腫瘤細(xì)胞維持其惡性生物學(xué)表型的重要信號(hào)分子[4]。十字孢堿(staurosporine,STS)是從微生物中分離出的一種生物堿,是已知化合物中最強(qiáng)PKC抑制藥。研究發(fā)現(xiàn),STS具有潛在的抗腫瘤活性,能抑制多種人類腫瘤的生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡。但STS對(duì)膽管癌細(xì)胞的影響筆者未見文獻(xiàn)報(bào)道。筆者在本研究以人膽管癌QBC-939細(xì)胞為研究對(duì)象,觀察STS對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖、凋亡等的影響,并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 試劑 人膽管癌細(xì)胞系QBC-939購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);RPMI 1640培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;CCK-8試劑盒(CK04)購(gòu)自日本Dojindo公司;碘化丙啶(propidium iodide,PI,批號(hào):P4170)、RNA酶(RNase A,批號(hào):R4642)和PKC抑制藥STS (批號(hào):S5921)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,STS用二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)配制成濃度為1 mmol·L-1的原液并儲(chǔ)存于-20℃,實(shí)驗(yàn)時(shí)根據(jù)需要用RPMI 1640培養(yǎng)液將原液稀釋成不同濃度的工作液;Annexin V/FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào):V13241)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;RIPA裂解液(批號(hào):P0013B)、2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒(批號(hào):P0010)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗人cyclin B1、周期蛋白依賴性激酶(Cdk1)和p-Cdk1(pY15)單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司;鼠抗人β-actin單克隆抗體及辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的二抗購(gòu)自武漢谷歌生物科技有限公司。

1.2 儀器 酶標(biāo)儀型號(hào)ELX800(美國(guó)Biotek公司);透射電鏡型號(hào)Tecnai G2 F20 S-TWIN(美國(guó)FEI公司);流式細(xì)胞儀型號(hào)為FACScan(美國(guó)BD公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞采用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液,常規(guī)在37℃、5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),0.25%胰酶消化、傳代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞增殖活性的測(cè)定 采用CCK-8法檢測(cè),將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期QBC-939細(xì)胞以2.0×105個(gè)·mL-1密度接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔200 μL置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞完全貼壁后吸去培養(yǎng)液,分別加入含10,25, 50,100,250和500 nmol·L-1STS的培養(yǎng)液200 μL,并設(shè)立不加任何處理的對(duì)照組,繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h后,每孔加入CCK-8溶液10 μL作用4 h,于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度(A)值。計(jì)算細(xì)胞的存活率和抑制率。細(xì)胞存活率(%)=藥物處理組平均A值/細(xì)胞對(duì)照孔平均A值×100%;細(xì)胞抑制率(%)=(1-藥物處理組平均A值/細(xì)胞對(duì)照孔平均A值)×100%。同時(shí)根據(jù)抑制率計(jì)算出細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(half inhibitory concentration,IC50)。

1.5 電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的QBC-939細(xì)胞傳代于50 mL培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞長(zhǎng)至約80%融合度時(shí)吸去培養(yǎng)液,分別加入濃度為250 nmol·L-1STS和不含STS的完全培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h;消化收集細(xì)胞后,立即置于2.5%戊二醛溶液中預(yù)固定,0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)清洗3次,過夜;其后以1%鵝酸溶液固定,丙酮逐級(jí)脫水,環(huán)氧樹脂包埋,超薄切片,經(jīng)鈾和鉛雙重染色后,于透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.6 Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的QBC-939細(xì)胞以每孔2×105個(gè)接種于6孔板,待細(xì)胞完全貼壁后吸去培養(yǎng)液,用濃度為250 nmol·L-1的STS培養(yǎng)液分別處理細(xì)胞0,12,24和48 h,隨后按照凋亡試劑盒說明書進(jìn)行操作,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的QBC-939細(xì)胞以每孔2×105個(gè)細(xì)胞密度接種于6孔板,待細(xì)胞完全貼壁后吸去培養(yǎng)液,用濃度為250 nmol·L-1的STS培養(yǎng)液分別處理細(xì)胞0,12,24和48 h,隨后消化、收集細(xì)胞,用4℃預(yù)冷的PBS洗2次,并重懸細(xì)胞于PBS 200 μL,緩慢加入預(yù)冷的無水乙醇1 mL,于-20℃固定過夜;之后離心收集細(xì)胞,4℃預(yù)冷的PBS洗2次,并重懸于PBS 500 μL中,分別加入終濃度為50 μg·mL-1的RNA酶(RNase A)及PI,室溫避光反應(yīng)30 min后上流式儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。采用CellQuest和ModFit軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.8 蛋白質(zhì)印跡 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期QBC-939細(xì)胞接種于6 cm的培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞完全貼壁后吸去培養(yǎng)液,用濃度為250 nmol·L-1STS培養(yǎng)液分別處理細(xì)胞0,12和24 h;消化收集細(xì)胞,加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液,冰上孵育20 min后于4℃,12 000×g離心15 min。上清液即為細(xì)胞總蛋白。按照BCA法蛋白定量試劑盒說明書測(cè)定蛋白濃度,以50 μg蛋白上樣量進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegel electrophoresis,SDS-PAGE)凝膠電泳,電泳結(jié)束后將膠上蛋白電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上;5%脫脂奶粉室溫封閉2 h;分別加入一抗(稀釋比例均為1∶500)于雜交袋中4℃孵育過夜;次日用三羥甲基氨基甲烷聚山梨酯(TBS-T)洗滌緩沖液洗膜3次,每次15 min,二抗(1∶3 000)室溫孵育1 h; TBS-T洗膜3次,每次10 min;采用電致化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)法進(jìn)行顯色、曝光。用圖像分析軟件Image J進(jìn)行灰度分析;以目的蛋白與內(nèi)參照蛋白的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行半定量分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,采用SPSS 15.0版軟件作統(tǒng)計(jì)處理,計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。不同處理組間差異采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 STS對(duì)QBC-939細(xì)胞增殖活性的影響 CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明,STS對(duì)QBC-939細(xì)胞的生長(zhǎng)有顯著抑制作用,且這種抑制作用呈明顯的濃度和時(shí)間依賴性(圖1)(F=37.85,P＜0.01)。STS對(duì)QBC-939細(xì)胞的IC5024 h為334 nmol·L-1,48 h為118 nmol·L-1。

圖1 CCK-8法檢測(cè)STS對(duì)QBC-939細(xì)胞增殖活性的抑制作用Fig.1 Inhibitoryeffectofstaurosporineoncell proliferation of QBC-939 cells detected by CCK-8 assay

2.2 STS對(duì)QBC-939細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 透射電鏡下觀察可見,未用STS處理的QBC-939細(xì)胞形體較大,胞質(zhì)均勻且含有豐富的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器,核質(zhì)均勻,無明顯染色質(zhì)邊集;而在250 nmol·L-1STS作用24 h后,可見QBC-939細(xì)胞體積縮小,其內(nèi)可見線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器腫脹明顯,數(shù)量減少,同時(shí)細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度濃縮并邊集于核膜下呈新月形,有的出現(xiàn)核固縮和核碎裂等凋亡變化,脫落后形成凋亡小體。見圖2。

2.3 STS對(duì)QBC-939細(xì)胞凋亡率的影響 采用Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示:250 nmol·L-1STS分別作用QBC-939細(xì)胞0,12, 24和48 h后,其凋亡率分別為(10.16±4.52)%, (22.35±2.19)%,(34.27±2.30)%和(59.70± 5.97)%。表明隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞凋亡率亦逐漸上升,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=81.08,P＜0.01)。見圖3。

A.QBC-939細(xì)胞;B.250 nmol·L-1STS作用的QBC-939細(xì)胞圖2 透射電子顯微鏡下觀察STS對(duì)QBC-939細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響(×1 700)A.QBC-939 control cells;B.250 nmol·L-1STS treated QBC-939 cellsFig.2 Effect of staurosporine on ultrastructure of QBC-939cellsdetectedbytransmissionelectronmicroscopy (×1 700)

A.0 h;B.12 h;C.24 h;D.48 h圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)STS對(duì)QBC-939細(xì)胞凋亡率的影響A.0 h;B.12 h;C.24 h;D.48 hFig.3 Effect of staurosporine on apoptotic rate of QBC-939 cells detected by flow cytometry

2.4 STS對(duì)QBC-939細(xì)胞周期的影響 250 nmol·L-1的STS作用QBC-939細(xì)胞0,12,24和48 h后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期,結(jié)果顯示:藥物作用12和24 h后, QBC-939細(xì)胞的S期比例依次下降(F=698.0,P＜0.01),同時(shí)G2/M期比例依次增加(F=136.8,P＜0.01),而G0/G1比例無明顯變化;當(dāng)STS作用48 h后引起了QBC-939細(xì)胞顯著的凋亡,周期分布與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)STS作用不同時(shí)間對(duì)QBC-939細(xì)胞周期的影響Tab.1 Effect of STS on cell cycle of QBC-939 cells detected by flow cytometry %,±s

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)STS作用不同時(shí)間對(duì)QBC-939細(xì)胞周期的影響Tab.1 Effect of STS on cell cycle of QBC-939 cells detected by flow cytometry %,±s

與0 h比較,*1P＜0.01Compared with 0 h,*1P＜0.01

時(shí)間/hG0/G1SG2/M 凋亡率066.79±4.0623.09±1.0810.12±2.983.73±0.63 1266.03±1.1812.24±0.23*121.74±0.95*115.59±1.84 2460.97±2.628.27±0.56*130.78±2.07*122.74±2.77 4871.22±0.4720.03±0.818.76±0.3355.88±5.06

2.5 STS對(duì)QBC-939細(xì)胞周期蛋白的影響 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示,250 nmol·L-1的STS作用12和24 h后,與對(duì)照組比較,cyclin B1和Cdk1蛋白表達(dá)水平逐漸降低(P＜0.05),而p-Cdk1蛋白表達(dá)水平則逐漸增加(P＜0.05)。見圖4。

3 討論

膽管癌的發(fā)生和發(fā)展受多種因素影響,其中細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)異常在膽管腫瘤的惡性增殖過程中起重要作用[5-6]。PKC廣泛分布于真核細(xì)胞中,具有多個(gè)亞型,在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要作用,并參與人體內(nèi)多種的生理和病理過程[7]。然而隨著研究的不斷深入,PKC在腫瘤中的異常調(diào)節(jié)作用逐漸被人們所重視,其同樣參與并維持了膽管癌的惡性生物學(xué)特性[8-9]。而一般認(rèn)為腫瘤的惡性增殖與其細(xì)胞周期之間密切相關(guān),研究表明PKC參與腫瘤細(xì)胞的周期調(diào)節(jié)過程,并對(duì)細(xì)胞的G1期和G2/M期時(shí)相轉(zhuǎn)換具有重要調(diào)節(jié)作用[10]。

STS是一種廣譜的PKC抑制藥,主要作用于PKC的催化區(qū),通過與ATP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合PKC的ATP結(jié)合位點(diǎn)而發(fā)揮抑制作用。研究表明,STS能夠抑制如宮頸癌[11]、前列腺癌[12]、口腔癌[13]等多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及促進(jìn)其凋亡,然而目前關(guān)于STS對(duì)膽管癌細(xì)胞的作用尚不明確。本研究通過體外細(xì)胞增殖活性檢測(cè)、電鏡下超微結(jié)構(gòu)觀察、流式細(xì)胞術(shù)等方法,發(fā)現(xiàn)STS在體外能顯著抑制人膽管癌QBC-939細(xì)胞生長(zhǎng),并且這種抑制作用具有濃度和時(shí)間依賴性;同時(shí),STS能誘導(dǎo)QBC-939細(xì)胞發(fā)生凋亡,且細(xì)胞凋亡率隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加。

與0 h比較,*1P＜0.05,*2P＜0.01圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)STS對(duì)QBC-939細(xì)胞周期蛋白的影響Compared with 0 h,*1P＜0.05,*2P＜0.01Fig.4 Effect of staurosporine on the expressions of cell cycle-related proteins in QBC-939 cells detected by western blotting

大量研究表明,細(xì)胞周期阻滯與細(xì)胞凋亡之間關(guān)系密切。而在細(xì)胞周期的調(diào)控過程中存在兩個(gè)限制點(diǎn),即G1/S期限制點(diǎn)和G2/M期限制點(diǎn)。當(dāng)外界各種刺激因素作用細(xì)胞時(shí),其通過激活限制點(diǎn)引起G1/S期或G2/M期阻滯,使細(xì)胞有時(shí)間完成損傷修復(fù),以保證細(xì)胞的存活;而當(dāng)損傷超過細(xì)胞修復(fù)能力時(shí),則會(huì)促使細(xì)胞凋亡[14]。有文獻(xiàn)報(bào)道STS能夠誘導(dǎo)人口腔上皮癌KB細(xì)胞和結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞周期阻滯于G2/M期,從而達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的作用[13,15]。本研究結(jié)果也證實(shí),STS抑制人膽管癌QBC-939細(xì)胞增殖的同時(shí),可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。STS作用12 h后,QBC-939細(xì)胞的G2/M期比例即顯著升高;作用24 h后G2/M期比例進(jìn)一步升高;到48 h后,G2/M期比例下降,而細(xì)胞的調(diào)亡率卻明顯增加,提示STS可能是先誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯,而后引起細(xì)胞凋亡。

在細(xì)胞周期過程中,周期蛋白cyclin B1和Cdk1是G2/M期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白,二者可形成cyclin B1/ Cdk1復(fù)合物,該復(fù)合物的活化是G2期進(jìn)入M期的必要條件;而Cdk1被磷酸化后其活性受到抑制,進(jìn)而引起G2/M期阻滯[16]。通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),250 nmol·L-1STS分別作用QBC-939細(xì)胞12和24 h后,細(xì)胞內(nèi)cyclin B1和Cdk1蛋白表達(dá)水平逐漸降低,而p-Cdk1蛋白表達(dá)水平則逐漸增加,提示細(xì)胞被阻滯于G2/M期,這與細(xì)胞周期分布的結(jié)果相一致。

綜上所述,本研究從體外實(shí)驗(yàn)證明STS可引起人膽管癌QBC-939細(xì)胞周期阻滯于G2/M期并誘導(dǎo)其凋亡。而STS誘導(dǎo)QBC-939細(xì)胞G2/M期阻滯的分子基礎(chǔ)可能與其降低cyclin B1、Cdk1表達(dá)水平,同時(shí)上調(diào)p-Cdk1表達(dá)水平有關(guān),但其具體調(diào)控機(jī)制尚待于進(jìn)一步研究。目前,PKC已成為抗腫瘤藥物研究中的重要靶點(diǎn),其抑制劑STS有望成為抗膽管癌治療的有效藥物之一。

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DOI 10.3870/yydb.2014.10.015

Effects of Staurosporine on the Proliferation and Apoptosis of Human Cholangiocarcinoma QBC-939 Cells

HE Zheng,ZHENG Jun
(Department of Hepatopancreatobiliary Spleen Surgery,the First Clinical Medical College of Three Gorges University,Yichang 443002,China)

ObjectiveTo study the effects of protein kinase C(PKC)inhibitor staurosporine(STS)on the proliferation and apoptosis of human cholangiocarcinoma QBC-939 cells and to explore its possible mechanism.MethodsCCK-8 was used to detect the effects of PKC inhibitor STS on the proliferation of human cholangiocarcinoma QBC-939 cells.The effects of STS on the ultrastructural characteristics of QBC-939 cells were observed by routine transmission electron microscopy(TEM).The apoptosis rate and the cell cycle distribution of QBC-939 cells were detected by flow cytometry.The expression of cyclin B1,Cdk1 and p-Cdk1 in QBC-939 cells was detected by Western blotting.ResultsSTS could significantly inhibit the proliferation of QBC-939 cells in a dose-dependent manner(P＜0.05)and the half inhibitory concentration(IC50)of QBC-939 cells at 24th and 48th h was 334 nmol·L-1and 118 nmol·L-1,respectively.TEM observed that STS could induce typical apoptotic bodies and supermicrostructural changes of QBC-939 cells.By Annexin V-FITC/PI double labeling flow cytometry,we found that the apoptotic rate of QBC-939 cells after treatment with STS for 0,12,24 and 48 h was(10.16±4.52)%,(22.35±2.19)%,(34.27±2.30)%and (59.70±5.97)%,respectively.By flow cytometry,compared with the control group,STS could significantly increase apoptosis rate of QBC-939 cells,decrease the percentage of cells in G0/G1phase and increase the percentage of cells in G2/M phase(P＜0.05). Western blotting proved that the expression levels of cyclin B1 and Cdk1 proteins in the STS-treated QBC-939 cells were significantly decreased(P＜0.05),while the expression level of p-Cdk1 protein in the STS-treated QBC-939 cells was significantly increased(P＜0.05).ConclusionSTS can significantly inhibit cell proliferation and induce apoptosis of human cholangiocarcinoma QBC-939 cells and the mechanism may be related to cell cycle arrest at G2/M phase.

Stanrosporine;Protein kinase C inhibitor;Cholangiocarcinoma;Cell cycle;Apoptosis;QBC-939 cell

R979.1;R965

A

1004-0781(2014)10-1314-05

2013-09-25

2013-11-22

何政(1978-),男,湖北鄂州人,主治醫(yī)師,博士,從事膽道胰腺腫瘤方面研究。電話:(0)15872654116,E-mail:805226494@qq.com。

鄭軍(1965-),男,湖北宜昌人,主任醫(yī)師,碩士,從事肝膽胰腫瘤方面研究。電話:(0)15871598533,E-mail:zhengjun1995@163.com。