反相高效液相色譜法測(cè)定4-羥基-3-甲氧基苯甲酸及間苯三酚對(duì)兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制作用

楊瑞玲,劉宏,王琪,季可菲,宋夢(mèng)姣

(1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院藥劑科,武漢 430070;2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,武漢 430065)

反相高效液相色譜法測(cè)定4-羥基-3-甲氧基苯甲酸及間苯三酚對(duì)兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制作用

楊瑞玲1,2,劉宏1,王琪1,季可菲2,宋夢(mèng)姣1

(1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院藥劑科,武漢 430070;2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,武漢 430065)

目的 建立反相高效液相色譜(RP-HPLC)法測(cè)定4-羥基-3-甲氧基苯甲酸含量和觀察間苯三酚對(duì)兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)的抑制作用。方法利用COMT催化3,4-二羥基苯甲酸生成4-羥基-3-甲氧基苯甲酸的原理,通過(guò)提取小鼠肝臟勻漿中的COMT 20 μL,在反應(yīng)體系中分別加入1×10-3mol·L-1鄰苯二酚及5×10-3,1×10-3,2×10-4mol·L-1間苯三酚各10 μL,利用RP-HPLC法測(cè)定產(chǎn)物生成量來(lái)分析間苯三酚對(duì)COMT的抑制作用。結(jié)果間苯三酚在5×10-3,1×10-3,2×10-4mol·L-13個(gè)濃度下對(duì)COMT活性均有抑制作用,抑制率分別為25.3%,17.6%,8.9%。結(jié)論間苯三酚對(duì)COMT活性具有抑制作用,但抑制作用弱于同濃度的鄰苯二酚。

間苯三酚;兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶;色譜法,高效液相,反相;抑制作用

間苯三酚(phloroglucinol)是親肌性非阿托品類純平滑肌解痙藥,除對(duì)消化系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)急性痙攣性疼痛具有明顯效果外,其對(duì)婦科痙攣性疼痛,如痛經(jīng)亦有良好的治療效果[1-2]。關(guān)于間苯三酚治療痛經(jīng)的機(jī)制研究,筆者未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。雌激素代謝是通過(guò)兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶(catecholamine-O-methyl transferase,COMT)完成的,COMT活性受到抑制會(huì)造成雌激素代謝異常[3]。而雌激素與前列腺素水平呈正相關(guān),體內(nèi)前列腺素生成量增加時(shí)痛經(jīng)癥狀加劇[4]。筆者設(shè)想間苯三酚的解痙作用與COMT的活性受到抑制有關(guān)。為了驗(yàn)證該設(shè)想,筆者在本研究利用COMT催化3,4-二羥基苯甲酸(3,4-dihydroxy benzoic acid,DBA)生成4-羥基-3-甲氧基苯甲酸(4-hydroxy-3-methoxy benzoic acid,4-OH-3-MBA)的原理[5],利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)法,以COMT抑制劑鄰苯二酚為陽(yáng)性對(duì)照[6],通過(guò)測(cè)定產(chǎn)物生成量來(lái)觀察間苯三酚對(duì)COMT的抑制作用,以期為間苯三酚治療痛經(jīng)作用機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雌性昆明小鼠,體質(zhì)量20～22 g,共40只,購(gòu)自華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,使用許可證號(hào):SYXK(鄂)2010-0057,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK (鄂)2010-0009。實(shí)驗(yàn)前于25℃相對(duì)濕度60%清潔通風(fēng)環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2 試藥 3,4-二羥基苯甲酸(上海晶純實(shí)業(yè)有限公司,批號(hào):40230,純度≥97.0%);4-羥基-3-甲氧基苯甲酸(ACROS organics公司,批號(hào):A02739066,純度≥98.5%);S-腺苷甲硫氨酸對(duì)甲苯磺酸(上海晶純實(shí)業(yè)有限公司,批號(hào):24777,純度≥80.0%,簡(jiǎn)稱:SAM);間苯三酚(J&K chemical公司,批號(hào):LN40M09,純度≥99.0%);鄰苯二酚(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):20121016,純度≥98.0%),其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純,實(shí)驗(yàn)用水為純化水。

1.3 儀器 Agilent 1220型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司,DAD檢測(cè)器);TGL-16B臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);DW-86L386立式超低溫保存箱(青島海爾特種電器有限公司);WH-2微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司);SY-2-4恒溫水浴鍋(天津歐諾儀器儀表有限公司);萬(wàn)分之一電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.4 肝臟組織樣品的制備 所有小鼠處死后,剖開(kāi)其腹部,迅速取出肝臟組織置于冰冷0.9%氯化鈉溶液中,用0.9%氯化鈉溶液洗凈后儲(chǔ)存于-80℃冰箱中備用。用濾紙吸干組織表面的水分,稱取1 g,以1∶3(W/V)的比例加入冰冷的磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)勻漿。勻漿液以15 000 r·min-1(r=10 cm)離心30 min,取上清液再次離心15 min,上清液部分為含COMT的粗酶液。

1.5 樣品反應(yīng)體系的制備 取含有0.2 mmol·L-1DBA、0.2 mmol·L-1SAM、2 mmol·L-1氯化鎂的100 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液(pH7.8),加入粗酶液20 μL。隨機(jī)分為A、B、C、D、E 5組,每組8只小鼠血漿。A組為空白對(duì)照組,B組為鄰苯二酚組,C、D、E組分別為間苯三酚大劑量組、中劑量組、小劑量組。A組為空白,B組加濃度為1×10-3mol·L-1的鄰苯二酚溶液10 μL,C、D、E組分別加濃度各為5×10-3,1×10-3, 2×10-4mol·L-1的間苯三酚溶液10 μL。各組反應(yīng)體系的總體積均為1 mL,渦旋后在37℃下孵育60 min,加入冰冷的2 mmol·L-1高氯酸溶液160 μL以終止反應(yīng),冰浴10 min,15 000 r·min-1(r=10 cm)離心15 min,取上清液待測(cè)[7]。

1.6 色譜條件 色譜柱:Welchrom C18柱(250 mm× 4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇-0.7%醋酸水溶液(25∶75);檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm;流速1.0 mL·min-1;進(jìn)樣體積20 μL;柱溫30℃。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較進(jìn)行單因素方差分析,A組分別與其他組進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 專屬性 在“1.6”項(xiàng)色譜條件下,空白小鼠肝臟組織樣品、加入4-OH-3-MBA標(biāo)準(zhǔn)品的小鼠肝臟組織樣品及反應(yīng)體系樣品的色譜圖見(jiàn)圖1所示,4-OH-3-MBA的保留時(shí)間為15.8 min,肝臟內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樣品測(cè)定,該方法專屬性強(qiáng)。

2.2 線性關(guān)系考察 取4-OH-3-MBA標(biāo)準(zhǔn)品100 mg,精密稱定,置100 mL棕色量瓶中,加適量流動(dòng)相溶解后,定容搖勻,精密移取10 mL置于100 mL棕色量瓶中,制得質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。分別取儲(chǔ)備液0.5,1.0,5.0,10.0,15.0 mL用流動(dòng)相稀釋得質(zhì)量濃度為0.5,1.0,5.0,10.0,15.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液,精密吸取各標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL,注入液相色譜儀進(jìn)樣分析,記錄峰面積。以4-OH-3-MBA的質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo),峰面積(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,線性方程為:A=927 273.28ρ+84 596.03(r= 0.999 8),表明4-OH-3-MBA在0.5～15.0 μg·mL-1內(nèi)質(zhì)量濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

A.空白肝臟提取液;B.空白肝臟提取液中加4-OH-3-MBA;C.體系中加間苯三酚反應(yīng)60 min;1.4-OH-3-MBA;2. DBA;3.未知物(不干擾測(cè)定)圖1 肝臟提取液HPLC色譜圖A.blank liver extraction;B.blank liver extraction spiked with 4-OH-3-MBA;C.reaction system spiked with phloroglucinol after 60 min;1.4-OH-3-MBA;2.DBA;3.unknown substance(without interference on analysis)Fig.1 HPLC chromatograms of liver extraction

2.3 檢測(cè)限和定量限 取4-OH-3-MBA適量,分別加流動(dòng)相稀釋至主峰響應(yīng)值約為基線噪音水平濃度3倍和10倍,作為最低檢測(cè)限溶液和定量限溶液。各精密吸取20 μL注入液相色譜儀,進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積,計(jì)算最低檢測(cè)限為1.7 ng,定量限為5.6 ng,線性關(guān)系在設(shè)定范圍內(nèi)能夠滿足定量要求。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為5.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照“1.6”項(xiàng)色譜條件,連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次,記錄峰面積,日內(nèi)RSD為0.61%(n=5);取同樣濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,按“1.6”項(xiàng)色譜條件,連續(xù)5 d,每日進(jìn)樣測(cè)定1次,記錄峰面積,日間RSD為0.72%(n=5)。表明該方法的精密度良好。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按照“2.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的制備方法,配制質(zhì)量濃度為5.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液共5份,按照“1.6”項(xiàng)色譜條件,分別進(jìn)樣測(cè)定峰面積,重復(fù)性RSD為1.13%(n=5),符合測(cè)定要求。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取樣品反應(yīng)體系溶液,于室溫下放置,分別于0,2,4,8,12,24 h取樣適量,照“1.6”項(xiàng)色譜條件測(cè)定峰面積,穩(wěn)定性RSD為1.70%(n=6)。室溫24 h內(nèi),樣品溶液穩(wěn)定性好,符合測(cè)定要求。

2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取空白肝臟組織勻漿液,按照“1.5”項(xiàng)制備方法(不加DBA),在0.5,5.0, 15.0 μg·mL-13個(gè)添加水平下進(jìn)行加樣(4-OH-3-MBA)回收率實(shí)驗(yàn),每個(gè)濃度各設(shè)6個(gè)平行樣。小、中、大3個(gè)劑量的加樣回收率分別為95.6%,101.2%, 99.7%,RSD分別為2.71%,3.58%,3.13%,說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.8 結(jié)果 見(jiàn)圖2。結(jié)果表明:與A組比較,C、D、E組均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為6.83,4.84,238,P＜0.05)。用抑制率來(lái)評(píng)價(jià)各組藥物對(duì)COMT活性的抑制作用強(qiáng)弱。抑制率(%)=(各組產(chǎn)物濃度-空白對(duì)照組產(chǎn)物濃度)/空白對(duì)照組產(chǎn)物濃度×100%。經(jīng)計(jì)算,B組抑制率為42.9%,C組抑制率為25.3%,D組抑制率為17.6%,E組抑制率為8.9%。

3 討論

前列腺素類物質(zhì)廣泛存在于人體組織中,與許多生殖系統(tǒng)疾病如痛經(jīng)等密切相關(guān),痛經(jīng)患者子宮內(nèi)膜內(nèi)前列腺素過(guò)高是造成該病發(fā)生的重要原因[8]。臨床上常用非甾體抗炎藥治療痛經(jīng),該藥通過(guò)抑制環(huán)氧化酶而減少前列腺素的生物合成來(lái)緩解痛經(jīng)癥狀。在痛經(jīng)患者子宮內(nèi)膜異位癥中,前列腺素水平與雌激素呈正相關(guān)[4],而COMT為雌激素代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一,肝臟COMT活性水平與肝臟雌激素代謝能力密切相關(guān)[9-10]。COMT催化2-或4-羥基雌激素的甲基化,生成2-或4-甲氧基雌激素,羥基雌激素、甲氧基雌激素已被證明有抑制或增強(qiáng)雌激素的作用,在鼠孕期COMT抑制劑能夠調(diào)節(jié)子宮肌層的收縮與舒張[11]。

與A組比較,*1P＜0.01圖2 間苯三酚與鄰苯二酚對(duì)小鼠肝臟COMT活性的影響Compared with group A,*1P＜0.01Fig.2 Effect of phloroglucinol and catechol on COMT activity in the liver of mice

本研究通過(guò)與COMT陽(yáng)性抑制劑鄰苯二酚的對(duì)比研究,發(fā)現(xiàn)不同濃度的間苯三酚對(duì)COMT活性均有抑制作用,且劑量越大抑制作用越強(qiáng),呈明顯的量效依賴關(guān)系。說(shuō)明間苯三酚的解痙機(jī)制可能與其抑制COMT的活性,從而影響雌激素代謝有關(guān)。本研究為進(jìn)一步闡明間苯三酚解痙鎮(zhèn)痛作用機(jī)制提供一種思路,同時(shí)也為治療痛經(jīng)的藥物開(kāi)發(fā)提供新途徑。

本研究?jī)H從間苯三酚體外抑制COMT活性的角度來(lái)說(shuō)明其發(fā)揮解痙作用的可能途徑,但間苯三酚也有可能通過(guò)某些離子通道的信號(hào)傳導(dǎo)或通過(guò)其在體內(nèi)的代謝物發(fā)揮藥效,尚待進(jìn)一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.10.012

Determination of 4-Hydroxy-3-Methoxy Benzoic Acid by RP-HPLC and Inhibitory Effect of Phloroglucinol on Catecholamine-O-Methyl Transferase

YANG Rui-ling1,2,LIU Hong1,WANG Qi1,JI Ke-fei2,SONG Meng-jiao1
(1.Department of Pharmacy,Wuhan General Hospital of Guangzhou Military,Wuhan 430070,China;2.College of Pharmacy,Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan 430065,China)

ObjectiveTo detect content of 4-hydroxy-3-methoxy benzoic acid by RP-HPLC and observe the inhibitory effect of phloroglucinol on catecholamine-O-methyl transferase(COMT).MethodsThis study used the principle of 3,4-dihydroxy benzoic acid transforming to 4-hydroxy-3-methoxy benzoic acid under COMT’s catalytic action.COMT(20 μL)was extracted from mouse liver homogenate.In a reaction system,10 μL catecol(1×10-3mol·L-1)and 10 μL phloroglucinol(5×10-3, 1×10-3and 2×10-4mol·L-1,respectively)were added.Products were determined by RP-HPLC to analyze effects of 4-hydroxy-3-methoxy benzoic acid on COMT.ResultsPhloroglucinol had inhibitory effect on COMT activity at concentrations of 5×10-3mol·L-1,1×10-3mol·L-1and 2×10-4mol·L-1,with the inhibition rate being 25.3%,17.6%and 8.9%,respectively.ConclusionPhloroglucinol has an inhibitory effect on COMT activity,which is weaker than the effect of catechol of the same concentration.

Phloroglucinol;Catecholamine-O-methyl transferase;HPLC;Inhibitory effect

R984;R927.2

A

1004-0781(2014)10-1303-04

2013-09-27

2014-02-08

楊瑞玲(1988-),女,湖北鐘祥人,碩士,研究方向:藥物制劑新技術(shù)與新劑型。電話:(0)13797077421,E-mail:ling19880611@126.com。

劉宏(1968-),男,湖北枝江人,主任藥師,博士,研究方向:藥物制劑新技術(shù)與新劑型。電話:027-68878601,E-mail:honguil@163.com。